측면 유동 분석법 정량화를 위한 휴대용 플라즈모닉 열 장치

요약

현장 진단 검사(POCT)는 질병의 조기 진단과 모니터링에 널리 사용됩니다. 측면 유동 분석법(LFA)은 POCT용으로 성공적으로 상용화된 도구입니다. 그러나 LFA는 정량화 부족과 분석 감도 부족으로 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 이러한 단점을 해결하기 위해 우리는 이전에 플라즈모닉 금 나노입자를 열 대비로 사용하는 열적 LFA를 휴대용 장치에 구현했습니다. 이 방법론은 기존 육안 검출에 비해 분석 감도를 크게 향상시켰지만, 정량화 문제는 여전히 남아 있었습니다. 본 연구에서는 전도 및 복사 열 감지 모드를 위한 장치 작동 조건을 최적화하여 LFA 정량화를 가능하게 했습니다. 나노입자만 포함된 스트립의 검출 한계는 기존 육안 검출에 비해 5배(전도 모드)와 12배(복사 모드) 감소했습니다. 두 검출 방법에 대한 주변 온도 효과를 연구한 결과, 복사 모드가 전도 모드보다 주변 온도에 더 큰 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 열 감지 방법을 검증하기 위해 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG) 생체표지자를 우리 LFA 스트립으로 정량화했으며, 복사 검출법 사용 시 2.8 mIU/mL의 검출 한계를 얻었습니다.

서론

조기 검출과 신속한 진단은 질병 선별과 치료에 중요합니다. 대부분의 의료 검사는 시간이 많이 걸리고 임상 검체 준비, 대형 장비, 숙련된 실험실 전문가가 필요합니다[1]. 이러한 요구사항은 자원 제한 지역의 의료 치료를 크게 저해해왔습니다. 현장 진단 검사(POCT)는 간단한 장비를 사용하고 임상적으로 관련 있는 결과를 얻는 데 필요한 시간을 최소화하여 임상의와 환자가 빠르게 결정을 내릴 수 있게 합니다. POCT는 짧은 검출 시간, 신속한 검체 처리, 단순한 장비, 낮은 조작 요구사항 등 명백한 장점이 있습니다[2, 3]. 따라서 POCT의 등장은 자원 제한 지역에서 특히 질병의 조기 및 신속 진단을 도우며 의료 조건을 개선할 수 있습니다. 그러나 낮은 분석 감도, 복잡한 조작 절차, 높은 장비 비용이 보통 이 기술 적용을 방해합니다. 따라서 단점을 최소화하면서 이상적 특성 대부분을 가진 POCT 응용을 찾기 위한 추가 작업이 시급합니다.

이러한 문제들 중 일부를 해결하기 위해 측면 유동 분석법(LFA)은 POCT에서 검사 도구로 매우 좋은 후보입니다. LFA는 주어진 검체에서 표적 분석물을 식별하는 데 사용되는 종이 기반 현장 진단 스트립 바이오센서입니다[4, 5]. LFA는 검체 패드, 접합 패드, 흡수 패드, 검출이 일어나는 니트로셀룰로오스 막으로 구성된 종이 기반 스트립(Scheme 1b)에서 수행됩니다. LFA의 장점 중에서는 신속성과 단일 단계 분석, 비용 효율성, 쉬운 조작, 적은 검체량, 다양한 환경 조건 하 긴 유통기한을 언급할 만합니다[6, 7]. 기존 LFA는 테스트 라인의 색 변화를 육안으로 검사하여 "예/아니오" 결과를 제공하며, 이는 이러한 분석법에서 가장 대중적인 검출 방법입니다. 따라서 이러한 접근법은 정확성 부족과 주관적 판단으로 어려움을 겪는 경향이 있습니다[8]. 그럼에도 불구하고 LFA를 전자 장치와 통합하기 쉽기 때문에, 정확한 정량 결과를 얻기 위해 스트립 리더를 개발하는 것이 실행 가능한 검출 접근법입니다. 전하결합소자(CCD) 또는 상보적 금속-산화막 반도체(CMOS) 센서는 보통 스트립 리더에서 이미지 캡처에 적용됩니다. 이미지 처리 소프트웨어는 정량 결과를 얻기 위해 자주 채택됩니다. 이러한 광학 리더에서 외부 광원의 반사, 투과, 산란에서 얻은 광학 정보가 기록되어 정량화를 가능하게 합니다[9,10,11,12]. 색도 리더에서 테스트 라인과 대조 라인의 색 강도(회색 값 또는 RGB 좌표)가 수집되어 LFA 스트립을 분석합니다[13,14,15,16,17]. 이 접근법의 단점 중 하나는 염료가 광손상, 기계적 수단, 기타 분해 과정으로 인해 시간이 지남에 따라 색을 잃을 수 있어 반복성과 정확도가 떨어진다는 것입니다. 형광 리더를 이용하는 시스템들[18, 19]에서는 유기 형광체들이 특정 여기 파장에 노출되어 스트립에 존재하는 형광체의 더 긴 파장 방출을 유도합니다. 이 방출광은 정량적 검출을 위해 수집됩니다. 무시할 수 없는 문제는 이러한 응용에 보통 사용되는 유기 형광체들이 광표백과 화학적 분해로 고통받아 시간이 지남에 따라 신호 감쇠를 일으키며, 특수한 취급과 보관이 필요하다는 것입니다[7].

플라즈모닉 열 감지 개념. a 휴대용 장치 모델과 주요 구성요소(상단), 두 가지 감지 모드(하단). b 열 감지 설정 하 LFA

최근 열 감지가 LFA 검출에 점차 적용되고 있습니다. 열 감지는 분석물 존재 시 증가하는 열을 생성하는 열 변환기를 사용하는 것으로, 이 열 신호를 변환기로 검출하는 것입니다. Polo 등[20]은 근적외선(NIR) 광원을 사용해 금 나노입자의 플라즈모닉 가열에 의한 암 생체표지자 암배아항원(CEA) 검출로 플라즈모닉 가열 구동 감지 개념을 탐구했습니다. Qin 등[21]은 녹색 레이저를 광원으로 사용해 열 대비를 이용한 LFA 정량화 방법을 제안했으며, 분석 감도 32배 향상을 보였습니다. 2016년 Wang이 개발한 유사한 열 대비 리더[22]는 LFA 정량화에서 8배 분석 감도 향상을 보였습니다. 열 변환기에서 열 생성을 유도하는 광원은 특정 파장으로 조정되어 해당 파장에서 흡수하지 않는 다른 분자 존재에 영향을 받지 않게 하여 검출 특이성을 보장할 수 있습니다. 전자기 스펙트럼 NIR 영역에 위치한 광원 사용은 생물학적 기원 분자 대부분, 특히 혈액에 의한 빛 흡수를 방지할 수 있습니다[23]. 이러한 장점들은 NIR 광원을 사용한 플라즈모닉 열 감지가 유망한 LFA 검출 방법임을 보여줍니다. 그러나 이전 연구들에서 LFA 스트립과 NIR 광원을 함께 사용하는 POCT 장치는 개발되지 않았습니다.

본 연구에서는 LFA 스트립 추가 수정 없이 LFA 분석 감도를 개선하는 플라즈모닉 열 감지 기반 휴대용 장치(Scheme 1a)를 개발했습니다. NIR 레이저 조사 시 플라즈모닉 공명을 최대한 활용해 신호를 증폭했습니다. 시제품의 레이저 파장은 나노입자의 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR) 피크 내에 위치하며(우리 설정에서 나노입자는 빛-열 변환기 역할을 함), 테스트 라인에서 열 생성을 유도합니다. 그러면 장치에 위치한 열 센서가 열 생성을 감지하는데, 적외선 방출(복사) 또는 열 전도에 의해 생성된 열을 측정합니다. 생성된 열량은 테스트 라인 나노입자 수와 조사 전력에 비례합니다[24]. 추가 조작이 필요 없습니다.

열 전달에는 전도, 대류, 복사 세 가지 주요 형태가 있습니다. 서로 다른 열 전달 형태의 검출 성능을 연구하기 위해 두 종류의 센서(Scheme 1a 및 추가 파일 1: Figure S1)로 전도 모드(접촉)와 복사 모드(비접촉)를 테스트했습니다. 전체 시제품은 임베디드 시스템 기술과 표면 실장 부품을 사용해 컴팩트합니다. 검출 능력에 영향을 주는 주요 요인들을 조사해 작동 조건을 최적화했습니다. 휴대용 장치 검출 능력 검증을 위해 나노입자가 막에 직접 적재된 LFA 스트립을 정량화하고 기존 육안 검출과 비교했습니다. 우리 검출법은 온도 의존적이므로 주변 온도가 열 신호 검출에 미치는 영향도 연구했고 전도 모드에 대한 보정 곡선을 얻었습니다. 마지막으로 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG) 생체표지자를 모델로 정량화해 열 감지 검출 능력을 검증했습니다.

재료 및 방법

재료 및 시약

인산완충식염수(PBS)는 Lonza®에서 구입했습니다. N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 염산염(EDC)과 이종이작용 폴리에틸렌글리콜(HS-PEG-COOH, MW = 5000 g/mol (5 kDa))은 SIGMA®에서 구입했습니다. Tween 20, Triton X100, 우혈청알부민(BSA), 트레할로스, 폴리비닐피롤리돈(PVP), N-하이드록시설포석시니미드(S-NHS), 수산화나트륨, 염화나트륨, 금(III) 염화물 수화물, HCG 호르몬은 Aladdin®에서 구입했습니다. 자당, 붕사 십수화물, 붕산, 요오드화칼륨, 티오황산나트륨 오수화물은 신약화학시약유한공사(Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.)에서 구입했습니다. 붕소수소화나트륨은 상하이 링펑 화학시약유한공사(Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd.)에서 구입했습니다. 항-αHCG, 항-βHCG, 항-마우스 이차 항체, 니트로셀룰로오스 막(NC-a110), 검체 패드(유리섬유 BX108), 접합 패드(유리섬유 BX101), 폴리염화비닐(PVC) 표면은 JieyYiBiotech™에서 구입했습니다. 4-모르폴린에탄설폰산(MES)은 상하이 메이저바이오(Shanghai Majorbio)에서 구입했습니다. 순수 에탄올은 창수 양위안 화학유한공사(Changshu Yangyuan Chemical Co., Ltd.)에서 구입했습니다.

나노입자 합성(금 나노프리즘, AuNPrs)

본 연구에 사용된 나노입자는 이전에 보고된 프로토콜[25]의 변형으로 얻었으며, 이후 개선되었습니다[26]. 간단히, 0.5 mM Na₂S₂O₃ 220 mL에 0.1 M KI 20 μL를 보충했습니다. 그런 다음 상기 용액 110 mL를 2 mM HAuCl₄ 함유 용액에 30초에 걸쳐 점진적으로 첨가하고 총 4분이 될 때까지 실온에서 배양했습니다. 이 시점에서 나머지 Na₂S₂O₃+KI 용액 110 mL를 30초에 걸쳐 보충하고 또 4분간 배양했습니다. 마지막으로 KI 없는 Na₂S₂O₃ 100 mL를 결과 용액에 첨가하고 실온에서 60분 배양하여 최종 프리즘 모양 나노입자를 얻었습니다. 앞서 설명한 모든 배양 단계는 흔들림 없이 수행되었습니다. 합성 후 나노입자는 PEG로 안정화되었습니다(PEG화). 나노입자에 첨가된 PEG 양은 합성에 사용된 금 총 중량 대비 1:2 비율(나노입자:PEG)로 제조했습니다. PEG를 1 mL Milli-Q 물에 희석하고, PEG와 NaBH₄의 1:1 몰비에 도달하도록 정해진 양의 NaBH₄를 첨가했습니다. PEG-NaBH₄ 용액 전체를 AuNPrs에 첨가하고 2 M NaOH로 pH 12로 조절하며 약한 혼합 하에 진행했습니다. 마지막으로 60 °C에서 60분간 초음파 처리하고 실온에서 4400 G로 15분 원심분리해 AuNPrs를 과량 PEG와 미반응 물질로부터 분리했습니다. 펠렛을 Milli-Q 물에 재현탁하고 실온에서 4400 G로 9분간 3회 원심분리했습니다. 이 최종 시료를 원래 부피의 4분의 1로 희석해 실온에서 몇 주간 침전시켰습니다. 이 시간이 지나면 용액 상층(작고 가벼운 나노미터 금 부산물 주요 분율 포함)을 바닥에 침전한 AuNPrs에서 제거할 수 있었습니다. 나노입자 농도는 UV-Vis 분광법으로 400 nm에서 흡광도(OD) 측정하고 전환 인자(ε) 11.3 mL mg⁻¹ cm⁻¹를 적용해 얻었습니다. 이 값은 ICP로 얻은 금 농도와 최종 합성 산물의 UV-Vis 400 nm OD를 상관관계로 실험적으로 얻었습니다.

나노입자와 항-HCG 항체 접합

간단히, 0.5 mg/mL PEG화 나노입자 함유 용액 3 mL를 0.1 M MES 완충액 pH 5.5로 실온에서 미니 스핀 마이크로퓨즈 6000 rpm 9분 원심분리해 3회 세척했습니다. 최종 세척된 나노입자를 같은 완충액(0.1 M MES pH 5.5) 1 mL 최종 부피에 재현탁하고 EDC 4 mg과 S-NHS를 용액에 첨가했습니다. 시료를 약한 혼합 하에 20분 배양하고, 6000 rpm 9분 원심분리 후 MES 완충액으로 세척했습니다. 항체 스톡 20 μL(200 μg)를 시료에 첨가하고 37 °C에서 3시간 배양 후 4 °C에서 하룻밤 2차 배양(흔들림 없음)했습니다. 다음 날 접합된 나노입자를 원심분리(6000 rpm 9분)하고 붕산염 완충액 5 mM pH 9로 2회 세척했습니다. BSA 25 mg을 용액에 첨가했습니다. 실온에서 약한 흔들림 하 1시간 배양 후, 시료를 세척(6000 rpm 9분)했고 붕산염 완충액에 Tween 20 보충(5 mM pH 9) 후 최종 4 °C에 보관했으며, 4~5일 이상 사용하지 않았습니다.

나노입자 제조 후 테스트 스트립 조립을 수행했습니다(ESI에 설명).

스트립 막에 나노입자 적재

스트립 막에 나노입자를 적재하기 위해, PEG화 나노입자(항체 없음) 원액 농도를 획득하고 Milli-Q 물에서 일련의 희석을 수행해 최대 농도 10 OD/mL에 해당하는 0(나노입자 없는 순수 Milli-Q 물)부터 10 OD/mL까지 농도 범위를 얻었습니다. 이는 앞서 ICP-AES로 특성화된 전환 인자에 따라 0.9 mg/mL에 해당합니다. 단순성과 외삽을 위해 중량 농도보다 OD 값을 선호했습니다. 따라서 앞서 언급한 각 희석액 2 μL를 마이크로피펫으로 스트립 니트로셀룰로오스 막에 직접 첨가하고 실온에서 ~2시간 건조시켰습니다. 건조된 스트립은 조사 테스트 전 실온에서 보관했습니다.

스트립에서 HCG 항원 검출을 위해, 분석물(HCG) 일련의 희석을 PBS에서 수행했습니다. 각 스트립은 항-HCG 항체와 접합된 AuNPr 5 μL를 접합 패드에 적재하고, 필요한 희석액 50 μL를 HCG 함유로 적재해 실행했습니다. 스트립은 이전 테스트와 유사하게 건조되었습니다.

휴대용 장치 개발

휴대용 장치(그림 1a 및 추가 파일 1: Figure S1)는 임베디드 시스템 기술과 표면 실장 부품으로 조립되었으며, 크기가 작고 비용 효율적입니다. 시제품 구성은 그림 1b에 나와 있습니다. 마더보드(추가 파일 1: Figure S1)는 데이터 처리와 나머지 구성요소 제어 기능을 하는 장치 핵심 모듈입니다. 이 모듈은 주로 대용량 메모리와 저전력 동작을 특징으로 하는 MCU STM32F407로 구성됩니다. 마더보드에 전압 변환 회로를 설계해 장치 내 각 모듈에 올바른 전압 공급을 제공했습니다.

휴대용 장치 세부사항. a 플라즈모닉 열 감지 기반 휴대용 장치. b 하드웨어 구성도 ① 마더보드, ② 레이저 및 센싱 모듈, ③ 사용자 인터페이스. c 스트립용 카트리지

마더보드에 다른 모듈 연결용 5개 인터페이스를 적용했습니다. 온도 센서는 IIC 인터페이스로 마더보드에 연결되어 센서가 전송하는 온도 신호를 수신했습니다. 정확한 온도 측정을 위해 디지털 출력을 가진 온도 센서를 선택했습니다. 전도 모드용 센서는 16비트 온도 분해능(0.0078 °C)과 낮은 전력 소모(700 μW)를 가진 반도체 센서(ADT7420, Analog Devices)였습니다. 복사 모드에서는 17비트 온도 분해능과 3.9 mW 전력 소모를 가진 적외선 온도계(MLX90614, Melexis)를 사용했습니다. 레이저 제어 모듈과 마더보드 간 인터페이스는 레이저 다이오드 정확한 관리를 보장하고 마더보드를 고전류로부터 보호하기 위해 릴레이 제어 회로로 구성했습니다. 레이저 모듈은 세 구성요소로 이루어집니다: (1) 레이저 제어 구성요소(추가 파일 1: Figure S1), (2) 레이저 다이오드(Thorlabs, M9-A64-0200)로 1064 nm 파장과 최대 200 mW 광학 출력을 가진 광원 제공, (3) 레이저 다이오드 방출광을 1 mm × 2.5 mm 영역으로 집속하기 위해 레이저 모듈에 장착된 비구면 렌즈(Thorlabs, 354330-C). 이들 구성요소로 스트립 테스트 라인을 정확하게 조명할 수 있었습니다. LCD 터치스크린(TaoJinChi Corporation TJC4827K043_01RN, 480 × 272 픽셀)을 사용해 그래픽 사용자 인터페이스를 제공했습니다. 보드 인터페이스 4는 프로그램 다운로드와 디버그용으로 남겨두었습니다. USB 인터페이스를 장치에 조립해 배터리 충전포트와 장치와 선택적 외부 컴퓨터 간 통신포트로 사용했습니다. 시제품은 10,000 mAh 리튬 배터리로 구동되었습니다. MCU 프로그램은 IAR 소프트웨어(버전 7.50.2.10505)로 컴파일되었습니다. 그래픽 사용자 인터페이스는 USART HMI 소프트웨어로 설계되었습니다.

시제품 케이스 및 테스트 스트립 카트리지 설계

장치가 사용자 친화적이고 휴대 가능하도록 3D 프린팅 쉘과 카트리지를 설계해 장치의 간섭 방지 능력과 안정성을 개선했습니다. 케이스와 카트리지 모두 흰색 수지 재료를 사용했습니다. Solidworks 2018 소프트웨어로 설계했습니다.

내부 구성요소 형태에 따라 직육면체 케이스(추가 파일 1: Figure S2a)와 직사각형 바닥판(추가 파일 1: Figure S2b)을 장치용으로 설계했습니다. 직육면체 케이스는 LCD 화면과 레이저 다이오드 제어 모듈 고정 위치를 제공했습니다. 하우징 측면 직사각형 슬롯은 테스트 스트립 카트리지 삽입용으로 사용했습니다. 바닥판에는 배터리와 마더보드 마운팅 베이스가 제공되어 구성요소들이 바닥판에 고정되어 움직이지 않게 했습니다. 모든 검출 부품은 바닥판에 고정되었습니다. 센서와 스트립 카트리지 모두를 위한 지지 프레임이 바닥판에 정착되어 이들을 밀접하게 접촉시켰습니다. 레이저 다이오드와 렌즈용 미세조정 이동 트랙을 제공해 고정과 거리 조절을 가능하게 했습니다. 전체 케이스 크기는 133 mm × 108 mm × 73 mm였습니다.

테스트 스트립 보호를 위한 특수 카트리지(그림 1c, 15 mm × 4 mm × 70 mm)를 설계했습니다. 카트리지에는 세 개 창이 있었는데, 하나는 검체 로딩용, 다른 두 개는 테스트 라인과 대조 라인 시각화용이었습니다. 테스트 라인 창은 테스트 스트립 폭보다 약간 작게 설계해 레이저가 테스트 스트립을 통과해 센서 검출에 영향을 주지 않게 했습니다. 카트리지 후면에 백킹 노치를 만들어 전도성 센서가 테스트 라인 위치에서 스트립 후면을 완전히 접촉하게 하면서 복사 센서가 온도를 제대로 검출할 수 있게 했습니다.

열 감지 및 매개변수 계산을 위한 알고리즘

레이저가 나노입자를 조명하면 테스트 라인에서 열이 생성되어 검출 가능한 온도 변화를 일으켰습니다. 이 열 생성(Q, W/m³)은 나노입자 농도(C, OD/mL), 조명 영역(A, m²), 레이저 강도(I, W/m²)에 의존합니다[22], 다음 공식에 따라:

$$ Q= CIA $$ (1)

레이저가 스트립을 조명할 때 열 신호(온도)를 수집했습니다. 조명 영역과 레이저 강도가 일정하게 유지되었으므로, 열 신호는 테스트 라인에 결합된 나노입자 양에 따라 변합니다. 열 생성 정량화를 위해 두 방법을 비교했습니다. 첫 번째는 온도 변화(추가 파일 1: Figure S3)를 사용해 열 신호를 정량화했습니다. 온도 변화(∆T)는 결정을 위해 계산되었습니다:

$$ \Delta T={T}_{\mathrm{end}}-{T}_0 $$ (2)

여기서 T_end는 조사 종료 시 도달한 최종(최대) 온도이고 T₀은 조사 시작 전 센서가 기록한 초기 주변 온도입니다. 다른 방법은 곡선 아래 면적(AUC, 추가 파일 1: Figure S3)의 정량적 계산을 사용했습니다. 이 방법은 10 Hz 샘플링 주파수에 따라 곡선을 사다리꼴로 나누고 모든 사다리꼴 합을 계산합니다. 열 신호는 면적을 검출 시간(t_det)으로 나누어 달성했습니다:

$$ \mathrm{AUC}=\sum \limits_{i=1}^n\left(\Delta {T}_i+\Delta {T}_{i-1}\right)\times 0.1\div 2 $$ (3) $$ {T}_{\mathrm{auc}}= AUC\div {t}_{\mathrm{det}} $$ (4)

두 방법을 검출에 적용했을 때, AUC 분석이 정량화의 더 나은 반복성을 주었습니다(추가 파일 1: Figure S4). 따라서 최종 열 정량화에 AUC 분석을 선택했습니다.

서로 다른 검출 방법 성능을 평가하기 위해 정량화 LOD를 평가했습니다. 각 실험에서 한 농도를 4개 검체(4개 스트립, n = 4)로 측정했습니다. 블랭크 그룹 표준편차(σ₀)와 선형 범위에서 표준 곡선 기울기인 감도(S)를 고려해 LOD를 아래와 같이 평가했습니다:

$$ \mathrm{LOD}=\frac{3{\sigma}_0}{s} $$ (5)

분석 절차

전체 분석 절차는 세 가지 주요 단계로 구성되었습니다: (1) 데이터 수집, (2) 검출 및 결과 획득, (3) 결과 표시 및 저장. 먼저 테스트 스트립을 카트리지에 적재하고 장치에 삽입했습니다. 검출 버튼을 누르고 환자 정보 입력(선택적으로 익명 코드 입력 가능)만으로 측정이 수행되었습니다. 정보는 마이크로컨트롤러 유닛(MCU)으로 전송되어 저장되었습니다. 그런 다음 MCU가 온도 센서와 레이저 다이오드를 활성화해 테스트를 시작했습니다. 한편, MCU가 수신한 온도 데이터는 실시간 표시와 플로팅을 위해 LCD로 전송되었습니다. 검출 후 MCU가 AUC 값을 계산하고 화면에 결과를 표시했습니다.

결과 및 고찰

나노입자 특성 분석

접합된 나노프리즘 UV-Vis 스펙트럼은 그림 2a에 나와 있으며, 최대 피크가 1130 nm에 있음을 나타냅니다. 레이저 파장(1064 nm)에서 AuNPr 흡광도는 1130 nm 최대 흡광도의 92%입니다. SEM과 TEM 이미지(그림 2b, c)를 수집해 나노입자 형태를 시각화했으며, 대부분 삼각형 모양임을 확인했습니다.

금 나노프리즘 특성 분석. a 나노입자 UV-Vis 스펙트럼. 비접합 나노입자 대표 이미지 b SEM, c TEM 시각화

장치 내 측정 조건 최적화

열 감지에서 검출 시간과 레이저 다이오드에서 테스트 라인까지 거리는 신호 응답에 영향을 주는 주요 요인입니다[27, 28]. 두 요소를 연구해 측정 조건을 최적화했습니다. 조사 시간 최적화를 위해 스트립을 10분간 조사하고 두 센서로 각각 온도 변화를 기록했습니다. 그림 3a에서 볼 수 있듯 온도는 10분간 지속 상승했지만, 120초 후 온도 상승이 평탄해지기 시작했습니다. 이 결과는 열 신호 변화가 시간과 유사한 경향을 보인 이전 연구와 일치합니다[28]. POCT 요구사항과 전력 소모를 고려해 장치 검출 시간을 120초로 설정했습니다.

열 감지 최적화. a 10분 조사 온도 변화. b 서로 다른 조사 거리에서 열 신호

거리 최적화를 수행했습니다. 그림 3b는 레이저 다이오드와 테스트 라인 사이 거리 증가에 따라 열 신호가 감소함을 보여줍니다. 이유는 거리가 증가함에 따라 유효 조사 면적이 커져 테스트 라인에 도달하는 레이저 전력이 감쇠되기 때문일 수 있습니다. 최대 신호 응답을 얻기 위해 거리를 7 mm로 설정했습니다.

주변 온도가 열 감지에 미치는 영향

열 감지가 온도와 밀접하게 관련되어 있으므로, 주변 온도가 열 감지에 미치는 영향을 연구할 필요가 있었습니다. 인큐베이터를 사용해 주변 온도를 27.5~40 °C 범위로 설정했습니다. 각 온도점에서 2.5 °C 간격으로 4개 검체를 측정했습니다. 주변 온도 대 열 신호 곡선을 블랭크와 1 OD/mL 스트립 각각에 대해 두 열 감지 방법으로 측정했습니다. 주변 온도 피팅 곡선 매개변수는 표 1에 나와 있습니다. 그림 4a에서 전도 모드에서 곡선 기울기가 서로 다른 농도에 대해 일반적으로 일관적이어서, 주변 온도 변화가 서로 다른 농도에 같은 영향을 미침을 나타냅니다. 결과적으로 주변 온도 효과 곡선을 정량 결과 보정에 사용할 수 있습니다. 복사 모드에서 두 농도에 해당하는 곡선 기울기(그림 4b)는 서로 일치했지만, 두 곡선 모두 하향 추세를 보였습니다. 결과는 전도 모드가 높은 온도 변동성 조건에서 검체 측정 시 더 신뢰할 수 있음을 시사합니다.

주변 온도 효과. a 전도 모드에서 주변 온도에 따른 열 신호 변화. b 복사 모드에서 주변 온도에 따른 열 신호 변화

나노입자 정량화

열 감지 검출

표준 정량 곡선을 얻기 위해 두 열 감지 방법(추가 파일 1: Figure S5)을 각각 사용해 0~10 OD/mL 범위 나노입자 함유 테스트 스트립을 검출했습니다. 해당 스트립들(추가 파일 1: Figure S6a)은 앞서 언급한 휴대용 장치로 검출했습니다(「재료 및 방법」 참조). 장치 내 두 센서 설정은 추가 파일 1: Figure S5a와 S5b에 나와 있습니다. 각 농도당 4개 검체를 주변 온도 27.5 °C에서 테스트했습니다. 장치는 AUC 방법을 적용해 테스트 라인 열 신호를 계산했습니다. 따라서 열 신호 정량화는 테스트 라인 나노입자 양에 비례했습니다. 정량 곡선(그림 5a)은 열 신호와 나노입자 농도 데이터로부터 선형 회귀해 생성했으며, 표 2 공식으로 표현했습니다.

나노입자 정량화. a 세 방법 표준 정량 곡선. b 저농도 선형 곡선 정량 결과

표 2에 따르면 복사 모드 감도는 전도 모드보다 15배 높았습니다. 전도 및 복사 모드 LOD는 각각 0.053 OD/mL와 0.023 OD/mL였습니다. 열 감지에서 복사 모드는 전도 모드에 비해 검출 한계(LOD)를 2배 개선했습니다. LFA 스트립 안정성도 추가 파일 1: Figure S7에 묘사된 대로 테스트했습니다. 전도 열 감지 모드는 두 고체 간 열 전달을 필요로 합니다. 테스트 라인 온도가 급격히 상승하면 센서가 테스트 라인과 같은 온도에 도달하는 데 시간(이완 시간)이 걸립니다. 결과적으로 검출 종료 시 센서 온도는 테스트 라인 실제 온도보다 낮았습니다. 반면 복사 모드는 열을 센서로 전달할 필요가 없었고, 센서가 테스트 라인에서 방사된 IR 파를 직접 검출해 현재 온도를 얻었습니다. 전도 검출 모드에서 양호한 열전도체 역할을 하는 것들이 히트싱크로 작용해 열 일부가 소산되었지만, 복사 검출에서는 공기와 스트립 자체만 열 소산에 개입했습니다. 이러한 이유들이 전도법 감도가 복사법보다 낮은 이유를 설명할 수 있습니다.

10 OD/mL 농도 스트립 테스트 시 복사(비접촉) 감지 모드에서 연소 자국이 있음을 발견했습니다. 이 현상 한 가지 가능한 이유는 비접촉 측정에서 공기의 낮은 열전도율이 테스트 라인에 열을 유지시키고 덜 효율적으로 소산시켜 유효 국소 온도를 증가시켜 결국 막 연소를 유발하기 때문입니다.

반면 접촉 검출 모드에서는 큰 열전도율을 가진 센서가 매체와 히트싱크 역할을 했습니다. 이렇게 열이 센서로 전도되어 테스트 라인에서 연소가 발생하지 않았습니다.

열 감지와 육안 검출 비교

휴대용 장치에 인기가 있고 널리 사용되므로, 검출 능력을 위해 열 감지를 육안 검출과 비교했습니다. 육안 검출을 위해 스트립 사진을 일반 현미경 디지털 카메라로 촬영했습니다. 테스트 스트립을 카트리지에 장착해 열 감지와 유사하게 화상 분석 위치 일관성을 보장했습니다. 소프트웨어 Image J를 사용해 서로 다른 나노입자 농도에 대한 테스트 라인 회색값을 분석했습니다. 이 분석 결과를 바탕으로 육안 검출법 표준 곡선(그림 5a)을 플로팅했습니다. 회색값과 나노입자 농도 간 선형 범위는 0.2–10 OD/mL였습니다(0–0.2 OD/mL 범위에서 R²가 0.770이어서 추가 분석에서 제외). 검출 한계는 0.268 OD/mL였습니다. 결과는 열 감지가 육안 검출에 비해 LOD를 5~12배 감소시킬 수 있음을 나타냈습니다. Qin 연구에서 육안 분석 LOD가 열 대비보다 100배 높음을 발견했습니다[21]. 그들은 높은 레이저 전력과 적외선 카메라를 사용해 더 큰 LOD 차이를 얻었습니다. LOD 개선에 대한 합리적 설명 중 하나는 열 감지가 막 표면 위와 아래 나노입자를 측정할 수 있다는 것입니다. 열 감지의 또 다른 장점은 육안 검출보다 안정성이 높다는 것입니다. 열 감지는 전체 테스트 라인 나노입자로 열을 생성합니다. 육안 검출은 테스트 라인 표면 나노입자 색 반응에만 의존합니다. 두 테스트 스트립 분석물 농도가 같아도 테스트 라인 접평면에서 나노입자 분포가 다르므로 육안 검사는 검출 결과 차이를 초래하지만 열 감지는 더 안정적이고 재현 가능합니다. 반대로 육안 검출 감도는 열 감지보다 2배 높았습니다. 육안 검출은 나노입자 직접 정량법인 반면, 열 감지는 온도 변화 측정으로 나노입자 농도를 간접 측정하므로 감도 부족을 부분적으로 설명할 수 있습니다. 그림 5b는 열 감지 검출 선형 범위가 0 OD/mL까지 낮아질 수 있으며, R²가 0.972(전도)와 0.987(복사)임을 보여주어, 표적 분석물이 낮은 농도에 있는 POCT 조기 검출 응용에서 열 감지가 색 정량화보다 더 좋은 잠재력을 가짐을 시사합니다.

HCG 정량 검출

마지막으로 우리 시스템으로 생체표지자 HCG를 정량화해 열 감지 검증을 수행했습니다. 전도 및 복사 모드 모두 HCG 정량화에 적용했습니다. 스트립 연소 방지를 위해 광학 출력을 150 mW로 낮췄습니다. 4가지 다른 농도 스트립들(추가 파일 1: Figure S6b)을 테스트했습니다. 그림 6a와 b는 열 신호가 복사 모드와 전도 모드 모두에서 35~700 mUI/mL HCG 농도에 선형적임을 보여줍니다. 농도 범위를 35~7000 mUI/mL로 확장하면 그림 6c, d처럼 농도 로그와 열 신호 간 선형성이 나타났습니다. 전도 모드에서 LOD는 64.2 mIU/mL로 육안 검출과 유사 범위였습니다. 그러나 복사 모드 이상적 LOD는 2.8 mIU/mL였습니다. 데이터는 나노입자 정량화와 일치했습니다. 광열 효과 적용 다른 장치(LOD = 5.5 mIU/mL)[27]와 비교해 우리 장치 복사 모드는 LOD를 거의 2배 감소시켰습니다. 이 결과들은 열 감지가 LFA 검출과 정량화에 효과적임을 증명했습니다.

HCG 표준 곡선. a 복사 모드에서 HCG 농도 로그와 열 신호 간 선형 곡선. b 전도 모드에서 HCG 농도 로그와 열 신호 간 선형 곡선. c 복사 모드 HCG 정량 결과. d 전도 모드 HCG 정량 결과

결론

LFA 검출을 위한 플라즈모닉 열 감지 방법이 확립되었습니다. 서로 다른 온도 센서(전도 및 복사 모드)를 적용해 이 방법 기반 휴대용 장치를 개발했습니다. 주변 온도 영향 연구는 열 감지에 부정적 영향을 미치며 전도 모드가 복사 모드보다 덜 영향을 받음을 보여주었습니다. 복사 모드에서 영향은 고농도에서 더 유의미했습니다. 두 모드 모두 정량화 능력 비교를 위해 테스트했습니다. 기존 육안 검출과 비교했을 때 열 감지 방법은 나노입자 정량화에서 LOD 5~12배 개선을 보였습니다. 복사 모드는 감도와 LOD 모두에서 전도 모드보다 더 나은 성능을 보였습니다. 열 감지 검증에서 HCG 검출용 LFA 스트립을 테스트했고, 결과는 복사 모드가 전도 모드보다 훨씬 더 민감함을 보여주었습니다. 이로써 열 감지가 LFA 플랫폼에서 조기 검출을 위한 실행 가능하고 효과적인 방법임을 증명했습니다.

결론적으로 플라즈모닉 열 감지는 분석 감도를 진정으로 개선하며 LFA 검출에서 조기 진단 응용을 위한 유망한 미래를 보여줍니다. 본문에서 설명한 휴대용 장치는 서로 다른 요구사항을 충족하기 위한 두 가지 감지 접근법을 제공했습니다.