항체 기능화 실리카 코팅 금 나노로드: 크립토코쿠스 네오포르만스 신속 진단 및 광열 치료

초록

배경

크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)는 피막 효모균. 임상에서 C. 네오포르만스 감염 조기 진단이나 치료 위한 빠르고 효과적 해결책 여전히 부족. 항체 접합 실리카 개질 금 나노로드(GNR-SiO₂-Ab)가 C. 네오포르만스 선택적 결합 가능. 암호구균증 안전 효과적 치료 가능성 제시.

방법

금 나노로드(GNR) 종자 매개 템플릿 보조 프로토콜로 합성. 항-C. 네오포르만스 항체 실란 커플링제로 GNR 표면 공유 결합 고정. 인비트로 컴퓨터 단층촬영(CT) 영상 진단 효과 탐색. 근적외선(NIR) 레이저 광 결합 GNR-SiO₂-Ab 광열 치료 효과 세포 생존율 평가로 확인.

결과

GNR-SiO₂-Ab 양성 X선/CT 영상 조영제 잠재력 보유. 항체 C. 네오포르만스 세포 표면 결합해 GNR 응집 유도, 전례 없는 높은 감쇠값 생성. 조사 후 C. 네오포르만스 세포 광열 손상, 정상 구조 파괴. 세포 생존율 미처리 세포 대비 유의미 감소.

결론

항체 접합 실리카 개질 금 나노로드 CT 영상서 C. 네오포르만스 세포 X선 감쇠 증강 확인. 항체 매개 면역 GNR NIR 유도 광열 치료 효과 C. 네오포르만스 세포서 증가시킴.

배경

크립토코쿠스 네오포르만스(C. neoformans)는 1894년 Busse 첫 기술 피막 효모균[1]. 포자 흡입 시 무해 기도 정착 가능하나, 수막염 또는 파종성 질환 유발[2], 특히 세포 매개 면역 결핍 환자. 암호구균증 중증 HIV 감염자 주요 생존 위협 진균 감염, 장기 이식, 망내계 악성종양, 코르티코스테로이드 치료, 사르코이드증 등 합병[3]. HIV 연관 암호구균 수막염 연간 60만 명 이상 사망[4]. 암호구균 수막염 및 파종성 질환 불가피 치명적. 1995년 Speed, Dunt 암포테리신 B+플루시토신 치료 환자 14% 사망률 보고[5]. 의심 환자 진단 곰팡이 배양 의존. 그러나 C. 네오포르만스 감염 조기 진단/치료 빠르고 효과적 해결책 여전히 부족. 대부분 환자 즉각 치료 못 받아 높은 사망률.

전체 영상 기술 중 X선 컴퓨터 단층촬영(CT) 가용성, 효율성, 비용 측면 병원서 가장 유용한 진단 도구[6]. CT 해부학적 패턴 식별, 종양 위치, 크기, 전이 등 내인성 대비 보완 해부 정보 제공[7]. 폐 암호구균증 흔한 소견: 단일/다발 폐결절 또는 종괴, 공동, 실질 이상, CT 영상 명확히 감지[8]. 방사선 영상서 암호구균 수막염 특징: 확장된 비르코-로빈 공간, 수막 강화, 두드러진 맥락막 열, 해마 주변 낭종[9]. 그러나 초기 암호구균증 방사선 영상서 검출 불가. 즉 조기 단계 즉각 치료 불가능. 최근 금 나노물질 표면 형상/형태 제어 발전 국소 표면 플라즈몬 공명 설계 큰 능력 입증[10, 11]. 여기 나노스케일 금 물질 금 나노로드(GNR) 조사, 진균 선택적 결합 가능. 임상 CT 영상 요오드 화합물 가장 흔한 조영제. 그러나 금 원자 번호, 전자 밀도 요오드보다 훨씬 높음. 금 강한 X선 감쇠 유도, 이상적 CT 조영제 후보[7]. GNR 특정 항체 접합으로 과학자 특정 조직, 병원체 표적 영상 포착 잠재력[12].

암포테리신 B 1960년대 말부터 암호구균증 주요 치료제[13]. 그러나 임상 효능 제한, 현저 신독성[14]. 현약 효능 독성, 약물 내성, 부적절한 활성 범위 저해[15, 16]. 새 선택적 암호구균증 치료법 고안 필요. 최근 광열 치료 암세포, 바이러스, 박테리아 표적 파괴 광범위 사용[17-19]. 전통 치료와 메커니즘 완전히 다름. 근적외선(NIR) 레이저 광 이상적 광열 치료법, 특정 조직/물질 선택적 흡수. 광선 조직 효과적 투과, 정상 조직 최소 손상[20]. GNR NIR 영역(650-900 nm) 흡수, 흡수 광에너지 열에너지 변환. 이 원리 NIR 레이저+GNR 결합 이상적 치료법. 기존 광감작제 대비 GNR 장점: 높은 흡수 단면적, 높은 용해도, 우수 생체적합성, 저독성, 뛰어난 광안정성, 표적 분자 쉬운 접합[21]. 여러 보고 GNR 광열 치료 활용 기술[22-24]. Carpin HER2 과발현 유방암 세포 항-HER2 접합 실리카-금 나노쉘 배양 후 808 nm NIR 조사. 대조군 대비 세포 파괴[17]. Wang 항체 접합 GNR NIR 조사 시 병원성 살모넬라균 선택적 표적 파괴, 세포 생존율 고도로 유의미 감소[19].

본 연구 항체 접합 실리카 개질 금 나노로드 C. 네오포르만스 세포 특이적 결합 사용. 복합체 결합 세포 CT 영상서 쉽게 구별. 금 나노입자 면역 접합으로 C. 네오포르만스 세포 연관, 광열 용해 세포 생존율 유의미 감소. 연구 C. 네오포르만스 인비트로 진단 및 광열 치료 새 옵션 확인, 암호구균증 안전 효과적 치료 가능성 제시.

방법

재료

항-C. 네오포르만스 항체 메리디안 라이프 사이언스(미국 멤피스) 구매. 클로로아우르산(HAuCl₄·3H₂O) 시그마(미국 세인트루이스). 질산은(AgNO₃), 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS), 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTS), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 붕소수소화나트륨(NaBH₄), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC), 폴리(나트륨-4-스티렌설포네이트)(PSS), 아스코르브산 J&K 케미컬(중국) 구매. 위 시약 무정제 사용. 탈수(밀리포어 밀리-Q 등급) 18.2 MΩ·cm 저항도 모든 제조 사용.

항체 접합 실리카 개질 금 나노로드 합성

대표 실험: GNR 종자 매개 템플릿 보조 프로토콜[25-27] 합성. 항체 접합 실리카 개질 금 나노로드(GNR-SiO₂-Ab) 제조 합성 경로 그림 1 예시. GNR 용액 25 mL 12000 rpm 15분 원심분리. 상층액(주로 CTAB 분자) 제거, 침전물 무수 에탄올 20 mL(28% 암모니아 20 µL로 pH 10 조절) 재분산. 초음파 처리 후 TEOS 5 mL(10 mM) 첨가, 24시간 강력 교반. 실리카 코팅 GNR 4000 rpm 30분 원심분리 수집, 물 3회, 에탄올 2회 세척. 정제 GNR-SiO₂ 시료 에탄올 10 mL 재분산 추가 실험[28]. 이후 APTS 10 mL 첨가 혼합 용액 형성, 60°C 1시간 환류 반응. 결과물 탈수 5회 세척, 진공 오븐 60°C 3시간 건조 GNR-SiO₂-NH₂ 얻음. 결과물 층별 기술 폴리머(PSS) 추가 코팅해 접근 가능 아민 기 용매 노출[29]. 아민 종단 나노로드 정제 항체 카르복실기와 EDC 존재 하 12-16시간 반응, EDC 수용성 카르보디이미드로 카르복실기와 1차 아민 사이 아마이드 결합 촉진[30]. 배양 후 나노로드-항체 복합체 원심분리 정제, PBS 재분산[31].

GNR-SiO₂-Ab 합성 절차

GNR-SiO₂-Ab 특성화

GNR, GNR-SiO₂-Ab 크기, 형태 투과 전자현미경(TEM; Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, 미국) 120 kV 가속 전압 특성화[20]. UV-Vis 스펙트럼 20°C Shimadzu UV-2450(일본) 10 mm 석영 셀, 광로 1 cm 측정. 200-1000 nm 파장 스캔, GNR, 항-C. 네오포르만스 항체, GNR-SiO₂-Ab 흡수 피크 포함. GNR-SiO₂-Ab 4°C 2, 4주 배양. 두 시점 200-1000 nm 스캔.

GNR-SiO₂-Ab 하운스필드 단위 측정

0.04-4 mg/mL 범위 GNR-SiO₂-Ab 수용액 필립스 브릴리언스 64 CT 스캐너(필립스 헬스케어, 네덜란드 베스트) 직접 검출. CT 영상 소프트웨어 감쇠값 획득.

C. 네오포르만스 GNR-SiO₂-Ab 부착

C. 네오포르만스 A형 H99주 상하이 분자 의학 진균학 핵심 실험실(상하이 창정 병원, 제2 군의대) 획득. 균사체 GNR, 항체-나노로드 복합체 1시간 배양 후 TEM 분석 준비. TEM(Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, 미국) 120 kV 이미지 수집.

균사체-항체-나노로드 복합체 인비트로 CT 스캐닝

물질, 균사체 세 그룹: 균사체 그룹(N), GPR-SiO₂-Ab 그룹(G), GPR-SiO₂-Ab 부착 C. 네오포르만스 그룹(G+N). 위 GNR-SiO₂-Ab 수용액 농도 4 mg/mL. 인비트로 CT 영상 위해 1.5 mL 멸균 Ep 튜브 세 그룹 용액 제조. 모든 CT 스캔 위 시스템 수행.

인비트로 광열 치료 효과

GNR-SiO₂-Ab 배양 유무 C. 네오포르만스 세포 NIR 레이저(LWIRL 808, 레이저웨이브, 중국) 5분 조사, 파장 808 nm, 강도 30 mW(4 W/cm²). TEM(Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, 미국) 120 kV 이미지 수집. 조사 후 37°C 암소 2시간 배양. GNR-SiO₂-Ab 배양 유무 세포 대조군 설계. 세포 생존율 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 분석(프로메가, 미국 위스콘신) 제조사 지침 따라 수행[28]. 이 분석 동질적 법, 생존 세포 수 결정. 루시페라제 촉매 루시페린-ATP 반응 대사 활성 세포 합성 이용. 모든 실험 6회 반복, 평균값 결정.

통계 분석

SPSS 13.0(SPSS Inc., 미국 시카고) 분석. 데이터 평균±SD 표현. P<0.05 통계적 유의. 본 논문 모든 그림 3회 이상 독립 실험 유사 결과 획득.

결과

GNR-SiO₂-Ab 합성 및 특성화

TEOS 실리카 소스, APTS 커플링제 실리카 코팅 GNR 선행 보고[30]. 항-C. 네오포르만스 항체 접합 시 GNR 형상, 크기 변화 없음. 그림 2 GNR-SiO₂-Ab TEM 이미지. 나노입자 폭 18.48±2.39 nm, 길이 57.56±4.57 nm.

a, b GNR-SiO₂-Ab TEM 이미지. 나노로드 막대 형태. 항-C. 네오포르만스 항체 접합 시 GPR 형상, 크기 변화 없음

GNR-SiO₂-Ab 분광 특성 및 안정성

GNR-SiO₂-Ab 광물리 특성 관련 그림 3 GNR-SiO₂, GNR-SiO₂-Ab, 항-C. 네오포르만스 항체 흡수 스펙트럼. GNR-SiO₂ 스펙트럼 두 흡수 밴드: 약한 횡 표면 플라즈몬 공명 파장(TSPRW) ~520 nm, 강한 종 표면 플라즈몬 공명 파장(LSPRW) ~808 nm. 항체 접합 후 GNR-SiO₂-Ab TSPRW, LSPRW 각각 540, 835 nm. 항체 스펙트럼과 GNR-SiO₂-Ab 비교 시 둘 다 ~280 nm 특이 피크 공유. 항-C. 네오포르만스 항체 GNR-SiO₂ 성공적 접합 증명. 4°C 2주 배양 후 TSPRW, LSPRW 각각 540, 835 nm 동일. 4주 후 동일 데이터. GNR-SiO₂-Ab TSPRW, LSPRW 4주 배양 후 변화 없음. GNR-SiO₂-Ab 안정성 확인.

흡수 스펙트럼: GNR+SiO₂+Ab (A), GNR+SiO₂ (B), 항-C. 네오포르만스 항체 (C). GNR-SiO₂ 두 흡수 밴드: 약한 횡 표면 플라즈몬 공명 파장(TSPRW) ~520 nm, 강한 종 표면 플라즈몬 공명 파장(LSPRW) ~808 nm. 항체 접합 후 GNR-SiO₂-Ab TSPRW, LSPRW 각각 540, 835 nm

GNR-SiO₂-Ab 하운스필드 단위 측정

임상 CT 평가 GNR-SiO₂-Ab 하운스필드 단위(HU). 그림 4 0.04-4 mg/mL GNR-SiO₂-Ab 범위 CT 이미지. GNR-SiO₂-Ab 농도 증가 시 CT 신호 강도 지속 증가. 그림 3에서 HU GNR-SiO₂-Ab 농도 함수 선형 관계(R²=0.9903) 보임, 전형적 방정식: y=12.52x+11.971. 결과 GNR-SiO₂-Ab 양성 X선/CT 영상 조영제 잠재력 시사.

GNR-SiO₂-Ab 하운스필드 단위. a PBS 현탁 GNR-SiO₂-Ab 인비트로 CT 이미지. 각 시료 농도(mg/mL) 상단 표시. b 0.04-4 mg/mL 범위 다양한 농도 GNR-SiO₂-Ab CT 감쇠 플롯

C. 네오포르만스 세포 GNR-SiO₂-Ab 부착

TEM 이미지 C. 네오포르만스 세포, 균사체-항체-나노로드 복합체 형태적 특징. 세포 직경 2-20 µm 범위. 그림 5a 다당류 캡슐 둘러싼 C. 네오포르만스 세포 TEM 이미지. 구조물 결합 없는 세포 4-6 µm 직경. 그림 5b 항체-나노로드 복합체 배양 후 C. 네오포르만스 세포 다량 응집 GNR-SiO₂-Ab 피복. GNR-SiO₂ C. 네오포르만스 부착 탐색 위해 균사체 세포 GNR-SiO₂ 배양. 결과 GNR-SiO₂ 산재 분포(그림 5c). 연구 C. 네오포르만스 세포 GNR-SiO₂-Ab 선택적 결합 가능 보여줌.

TEM 이미지 GNR-SiO₂-Ab와 C. 네오포르만스 세포 상호작용 예시. a C. 네오포르만스 세포 TEM 이미지. b 균사체-항체-나노로드 복합체 TEM 이미지. c GNR-SiO₂ 배양 C. 네오포르만스 세포 TEM 이미지

균사체-항체-나노로드 복합체 인비트로 CT 스캐닝

제조사 표준 디스플레이 프로그램(필립스 포털, 필립스 헬스케어, 네덜란드 베스트) CT 신호 강도 정량 분석. 그림 6 세 그룹 X선 감쇠값 묘사. G+N 그룹 값 G, N 그룹 대비 유의미 높음. 또한 G 그룹 값 N 그룹 대비 유의미 높음. 선행 문헌[31] 발견과 일치.

a, b 상이한 그룹 인비트로 CT 스캐닝. G+N 그룹 값 G, N 그룹 대비 유의미 높음. 또한 G 그룹 값 N 그룹 대비 유의미 높음

인비트로 광열 치료 효과

CellTiter-Glo® 발광 기기 세포 생존율 분석 수행 평가. 비조사 세포 NIR 조사 세포 대비 생존율 높음(P<0.05). 또한 NIR 조사 후 균사체 생존율 GNR-SiO₂-Ab 결합 세포 대비 높음(P<0.05). 추가 세포 생존율 균사체-항체-나노로드 복합체 대비 높음(P<0.05). 그림 7 상이한 처리 C. 네오포르만스 세포 생존율 변동 명확 예시. 조사 후 C. 네오포르만스 세포 광열 손상, 정상 세포 구조 파괴. 그림 8 세포 위축, 불규칙, 붕괴 모습. 특징적 다당류 캡슐 손상.

상이한 처리 세포 생존율. 비조사 세포 NIR 조사 세포 대비 생존율 높음(P<0.05). 또한 NIR 조사 후 균사체 생존율 GNR-SiO₂-Ab 결합 세포 대비 높음(P<0.05). 추가 세포 생존율 균사체-항체-나노로드 복합체 대비 높음(P<0.05)

a, b TEM 이미지 GNR-SiO₂-Ab 결합 C. 네오포르만스 세포 광열 손상 입증. 세포 위축, 불규칙, 붕괴 모습. 특징적 다당류 캡슐 손상

토의

실리카 폴리머 대비 다수 장점[32]. 제조 공정 용이, 실리카 쉘 두께 원하는 크기, 다공성 조절 가능. 또한 실리카 극도로 안정, 생체적합성, pH 변화에 팽창/다공성 변화 없음, 미생물 공격 취약하지 않음. 덧붙여 실란 케미스트리, 상용 유기실리콘 시약 이용 다양한 작용기 표면 개질 용이, 바이오타겟팅 가능. 실리카 코팅 GNR 우수 광학 특성 유지, 고에너지 조사 열 안정성 개선. 본 연구 실리카 코팅, 항-C. 네오포르만스 항체 접합 후 GNR 주변 매질 굴절률 증가로 표면 플라즈몬 공명 피크 적색 이동[32, 33]. 결과 시료 크기 수정, 접합 후 점점 커짐 지시. 데이터 금 나노입자 항-C. 네오포르만스 항체 성공적 접합 입증. 그러나 GNR-SiO₂ 항체 결합 후 세포 결합 특수 능력 가능성 배제 못 함, 향후 추가 연구 수행 예정. 본 연구 단순 항원-항체 반응으로 GNR-SiO₂-Ab 세포 캡슐 부착 성공. 또한 복합체 세포 캡슐 항원 표적화 보장.

GNR 지난 10년 광범위 관심. Hainfeld 등[34] 최초 GNR X선 조영제 사용 보고. GNR 조건부 조영제 요오드 분자 대비 여러 장점. 높은 원자 번호, 전자 밀도로 GNR 상대적 높은 X선 감쇠 계수. 금 원자 번호, 전자 밀도(각각 79, 19.32 g/cm³) 요오드(53, 4.9 g/cm³)보다 높음[7]. 요오드 X선 조영제 신장독성, 중증 알레르기 반응 등 심각한 부작용. 그러나 GNR 요오드 조영제보다 체내 오래 지속, 영상 관찰 충분 시간. 또한 GNR 펩타이드, 항체 등 다양한 분자 표면 기능화로 암세포, 바이러스, 박테리아 표적화 가능. Reuveni 등[31] 여러 상이한 분자 유형 GNR 표면 부착 가능 보임. 본 연구 GNR-SiO₂-Ab 농도 증가에 따라 CT 신호 강도 지속 증가, 더 밝은 이미지. GNR-SiO₂-Ab 유의미한 양성 잠재력 X선/CT 영상 조영제, GNR과 유사. 금 나노로드 X선 흡수 표면 개질 후에도 영향 없음. 데이터 GNR-SiO₂-Ab X선 감쇠 특성 표면 개질 결과 유의미 변화 없음 지시. 선행 문헌[35-37] 발견과 일치. 표면 기능화 GNR 특정 관심 부위 수동/능동 표적화 강력한 도구. 본 연구 GNR-SiO₂-Ab C. 네오포르만스 캡슐 성공적 부착. 또한 항체 접합 입자 표적 CT 영상 나노프로브 활용 가능성 인비트로 확인. C. 네오포르만스 세포 PBS 분산 CT 이미지 물 분산 유사하나 진균-연조직 영상 구별 어려움. 항체 C. 네오포르만스 세포 표면 결합해 GNR 훨씬 큰 응집 유도, 전례 없는 높은 감쇠값 생성. 따라서 진균 구별 가능한 X선 감쇠 달성. 결과 기반 C. 네오포르만스 CT 영상 검출 가능, 진단 새 기회 제공.

GNR 종양 광열 치료 널리 활용[22, 38, 39]. 본 연구 GNR-SiO₂-Ab C. 네오포르만스 세포 파괴 선택적 도구 가능성 지시. 결과 NIR 조사 후 C. 네오포르만스 세포막 비가역적, 심각 파괴 확인. 또한 세포 생존율 미처리 세포 대비 유의미 감소. 결과 NIR 단독 C. 네오포르만스 세포 사멸 유발 지시. 그러나 GNR-SiO₂-Ab 배양 세포 생존율도 저하. GNR-SiO₂-Ab 배양 NIR 조사 세포 생존율 타 그룹 대비 유의미 감소. GNR-SiO₂-Ab 진균 선택적 결합, NIR 복사 효과 개선 확인. GNR-SiO₂-Ab C. 네오포르만스 세포 선택적 광열 치료 효과 능력 보유. 효과 메커니즘 미보고. 조사 유도 세포 사멸로 세포막 파괴 추정. Norman 등[18] 항체 공유 결합 금 나노로드 결합 녹농균 NIR 조사 시 생존율 유의미 감소 보고. 이 세포들도 NIR 조사로 비가역적 손상 심각하게 파괴된 세포막 영역 보임. 나노입자 NIR 조사 시 나노입자 폭발, 충격파, 기포 형성, 열적 분해 등 요인 세포막 손상[40].

본 연구 C. 네오포르만스 세포 사멸/활성 저하 국소 온도 상승, 나노입자 폭발, 충격파, 기포 형성, NIR 복사 유발 열적 분해로 세포막 분해 파괴 시 발생. 표적 GNR-SiO₂-Ab NIR 복사 자극해 C. 네오포르만스 세포 광열 파괴 유도 두 가능성 추측. 하나: C. 네오포르만스 세포 캡슐 내 표적 GNR-SiO₂-Ab 국소 온도 상승 유도. 둘: GNR-SiO₂-Ab와 C. 네오포르만스 세포 캡슐 사이 항원-항체 반응으로 세포벽, 캡슐 구조 변화. 변화로 세포 광열 치료 더 민감[41]. 선행 연구 금 나노로드 저독성 확인[22, 42, 43], 향후 인비보 광열 치료 효과 연구 필요. 본 연구 가장 아쉬운 점 GNR-SiO₂-Ab 로딩 용량 논의 안 함. 향후 연구 GNR-SiO₂-Ab 로딩 용량과 광열 효과 관계 집중.

결론

C. 네오포르만스 세포 표적 GNR-SiO₂-Ab 성공적 제작. 특이 항체 접합 금 나노로드 CT 영상서 C. 네오포르만스 세포 X선 감쇠 증강. 결과 면역 GNR 항체 매개 NIR 유도 광열 치료 효과 C. 네오포르만스 세포서 증가시킴. 또한 GNR-SiO₂-Ab C. 네오포르만스 감염 진단 및 치료서 쉬운 조작, 최소 침습 시술 가능, 이 접근법 잠재적 임상 응용 초점.