신규 Emodin-loaded 스테아르산-g-키토산 올리고당 나노셀의 제조 및 평가

초록

이 연구의 목적은 emodin-loaded stearic acid-g-chitosan oligosaccharide(CSO-SA/EMO)를 준비하고 특성화하고 시험관 내에서 항종양 활성을 평가하는 것입니다. 본 연구에서는 stearic acid-g-chitosan oligosaccharide를 담체로 사용하였고, 다양한 방법으로 물리화학적 특성을 측정하였다. FITC로 표지된 스테아르산-g-키토산 올리고당을 사용하여 세포 흡수 거동을 조사했습니다. CSO-SA/EMO는 초음파 및 투석을 사용하여 준비되었습니다. 입자 크기, 표면 전위, 포획 효율 및 약물 방출 거동을 시험관 내에서 연구했습니다. 위암 세포에 대한 CSO-SA/EMO의 효과는 MTT 분석 및 유세포 분석을 사용하여 조사되었습니다. 결과는 스테아르산-g-키토산 올리고당보다 CSO-SA/EMO 입자 크기가 더 크고 전위가 작음을 보여주었다. MGC803 및 BGC823 세포에 의한 12시간 미셀 흡수는 충분했고 미셀은 마우스의 병변 부위에 풍부하게 축적되어 우수한 수동적 EPR 표적화를 달성했습니다. MTT 및 세포 주기 정지 분석은 유리 에모딘의 세포와 비교하여 MGC803 및 BGC823 세포에 대해 CSO-SA/EMO 강화 항종양 활성을 유의하게 보여주었습니다. 종양 부피, 헤마톡실린 및 에오신 염색, 말단 데옥시뉴클레오티드 전이효소 dUTP 닉-엔드 라벨링 분석은 CSO-SA/EMO가 생체내 종양 조직에 상당한 항종양 효과를 갖는다는 것을 입증했습니다. 결론적으로 초음파 투석 방법은 CSO-SA/EMO를 제조하는 간단하고 효과적인 방법을 제공했습니다. 미셀 시스템을 이용한 에모딘의 전달은 항종양 효과를 효과적으로 향상시켰다.

소개

Emodin(EMO)은 대황, cuspidatum 및 multiflorum과 같은 전통적인 중국 허브에서 주로 추출되는 천연 안트라퀴논 유도체입니다. 한의학(TCM)은 독성이 낮고 부작용이 적으며 비용이 저렴하기 때문에 임상 연구에 널리 사용됩니다[1].

연구에 따르면 EMO는 면역 억제, 항백일해, 항고혈압, 항염, 항균 및 항암 활성을 포함한 광범위한 약리 활성을 가지고 있습니다. EMO는 암세포의 성장을 억제하고[2,3,4] 관련 유전자를 조절하여 종양 세포 사멸, 종양 형성, 세포 증식, 침습 및 전이를 제어하는 것으로 밝혀졌습니다[5,6,7,8,9]. 연구에 따르면 EMO는 인간 결장직장 선암종 세포, 간암종 세포, 림프성 백혈병 세포[10], 인간 혀암 SCC-4[11]와 같은 다양한 암세포를 억제할 수 있습니다. EMO는 위암, 유방암 및 전립선암에서 종양 세포의 증식을 억제할 수 있습니다[7, 12]. 그러나 EMO는 정상 인간 치은 섬유아세포[13], 인간 기관지 상피 세포[14], 인간 유방 세포[15]와 같은 정상 세포에 대해 세포독성 효과를 나타내지 않는다. 이는 EMO가 정상 세포에 비해 종양 세포에 대해 선택적 세포독성을 나타낸다는 것을 보여줍니다.

천연 다당류인 키토산은 키틴의 탈아세틸화된 형태입니다. 이 천연고분자는 수용성, 생체기능성, 혈액적합성, 미생물 분해성이 우수하여 다양한 생물의학 응용분야로 알려져 있다. 저분자량 키토산 올리고당(CSO, 18 kDa)을 얻기 위해 산성 조건에서 키토사나제를 사용하여 고분자량 키토산(450 kDa)을 분해했습니다. CSO는 세포막을 강력하게 침투할 수 있고[16] 스테아르산(SA)은 당단백질 경로를 통해 핵으로 들어갈 수 있습니다. CSO는 양친매성 스테아르산-g-키토산 올리고당(CSO-SA)을 합성하기 위한 커플링 시약으로 카르보디이미드(EDC)를 사용하여 SA로 소수성으로 변형되었습니다.

EMO는 광범위한 생물학적 활성을 가지고 있지만 그 안트라퀴논 구조는 물에 잘 녹지 않습니다. 치료제는 혈류를 통해 운반되기 때문에 용해도는 흡수와 분포에 직접적인 영향을 미칩니다. CSO-SA 이식편은 수용액에서 자가 조립되어 내부는 소수성이고 외부는 친수성인 나노마이셀을 형성할 수 있습니다. 초음파 탐침을 이용하여 모인 상태에서 나노마이셀을 분산시켰다. EMO와 CSO는 모두 소수성이므로 EMO는 미셀의 중심에 캡슐화되었습니다.

CSO-SA에는 모델 약물의 분자량, 구조 및 소수성을 요구하는 여러 모델 약물이 적용됩니다. 기존 연구에는 항종양 효과를 크게 향상시킬 수 있는 커큐민[17], 독소루비신[18], 라미부딘 스테아레이트[19], 옥살리플라틴[20]이 있습니다. CSO-SA/EMO의 최적 적재 조건을 탐색했습니다. CSO-SA/EMO는 더 높은 용해도와 활용 효율성을 가진 새로운 제형을 만듭니다. CSO-SA/EMO는 모델 약물 또는 운반체 선택 및 미셀의 임상 적용에 대한 아이디어를 제공할 수 있습니다.

실험 자료 및 방법

실험 자료

BALB/C+/nu 수컷 누드 마우스는 Zhejiang University Experimental Animal Center에서 입수했습니다. 저분화 위암 세포주 MGC803 및 BGC823은 ATCC 세포 은행에서 구입했습니다. RPMI-1640 배양 배지 및 FBS는 Hangzhou Holly Leaf Biotechnology Company로부터 입수하였다. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, 트리니트로벤젠 설폰산 및 피렌은 Sigma Aldrich에서 공급했습니다. Zhejiang University는 CSO-SA를 제공했습니다. 구입한 다른 시약은 AR 등급이었습니다.

CMC 결정 및 ¹ CSO-SA의 H NMR 스펙트럼

이 보고서에서 CSO-SA의 임계 미셀 농도(CMC)는 형광 프로브로 파이렌을 사용하는 형광 분광광도법에 의해 결정되었습니다. 다양한 농도의 CSO-SA 용액을 피렌 아세톤 용액에 첨가한 후 아세톤을 밤새 증발시켰다. 다른 농도의 CSO-SA 용액에서 pyrene의 방출 스펙트럼과 피크 값은 형광 분광 광도법으로 분석되었습니다. 첫 번째 피크(I ₁ =374 nm) 및 세 번째 피크(I ₃ =385 nm) 스펙트럼이 기록되었습니다. 대수 농도(Log C)를 가로 좌표로 그리고 I ₁ /나 ₃ 세로좌표로 하고 폴리머 미셀에 대한 CMC를 계산했습니다.

CSO 및 CSO-SA는 D₂에 용해되었습니다. 10 mg/ml의 농도에서 O. ¹ H NMR 스펙트럼을 기록하고, 비교하고, 특징적인 CSO 및 CSO-SA 피크에 대해 분석했습니다.

탐지된 아민 치환 정도

아민 치환도(SD%)는 트리니트로벤젠 황산(TNBS) 방법을 사용하여 검출되었습니다.

다른 농도의 CSO 및 CSO-SA 용액을 준비한 후 4% NaHCO₃ 및 0.1% TNBS를 연속적으로 첨가하였다. 수조에서 37 °C에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후, 2 mol/L 염산을 첨가했습니다. 흡광도는 30분 초음파 처리 후 자외선-가시광선 분광광도법으로 344nm에서 측정되었습니다. 표준 곡선을 그리고 CSO-SA 샘플의 SD%를 계산했습니다.

CSO-SA 입자 크기 및 가능성

1.0 mg/ml CSO-SA 용액을 준비하고 초음파 세포 파괴 프로브로 미셀을 완전히 분산시켰다. CSO-SA의 입자 크기와 전위는 입자 크기 및 표면 전위 분석기로 결정되었습니다.

CSO-SA의 세포 활용

FITC 및 CSO-SA 용액을 혼합하고, 밤새 교반하고, 투석 백으로 옮겼다. 미반응 FITC 및 무수 에탄올을 24시간 동안 탈이온수로 투석하여 제거하였다. 마지막으로, 1.0 mg/mL 농도의 FITC 표지 CSO-SA(FITC-CSO-SA) 용액을 얻었다.

MGC803 및 BGC823 세포를 표적 세포로 사용하여 CSO-SA의 세포 흡수를 조사하였다. 세포 증식 속도를 기준으로 세포를 24웰 플레이트에 접종하고 완전히 부착될 때까지 밤새 배양했습니다. 그런 다음 80μL의 FITC-CSO-SA 용액을 설정된 시점에 추가했습니다. 세포 핵을 염색하기 위해 15분 동안 10 μL의 Hoechst 33342(1 mg/mL)와 함께 세포를 배양했습니다. FITC-CSO-SA에 의한 CSO-SA의 흡수는 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 감지되었습니다.

CSO-SA의 생체 내 배포

생체 내 CSO-SA의 분포는 DiR 형광 염료 염색에 의해 결정되었습니다. CSO-SA/DiR 용액은 투석으로 준비했습니다.

6주령의 수컷 누드 마우스를 실험 모델로 사용하였다. 누드 마우스에 1 × 10⁸ 을 피하 접종했습니다. /mL MGC803 세포. CSO-SA/DiR은 약 200 mm³ 의 종양 세포 부피에서 꼬리 정맥을 통해 투여되었습니다. . 그런 다음 마우스를 설정된 시점에 마취시켰다. 생체 내 CSO-SA/DiR의 시간 분포는 작은 동물 생체 이미저(파장 범위, 580-700 nm, 노출 시간 1000 ms)를 사용하여 기록되었습니다.

HPLC에 의한 EMO 농도 검출

EMO 농도는 HPLC에 의해 결정되었습니다. EMO는 보호 컬럼(4.6 × 10 mm, 5 μm)이 있는 Eclipse XDB-C18 충전 컬럼(4.6 × 250 mm, 5 μm)에 적용되었습니다. 컬럼 온도는 30 °C, 유속은 1.0 mL/min, 검출 파장은 254 nm, 주입 부피는 20 μL로 설정했습니다. 이동상은 메탄올/0.1% 인산(85:15, v/v)이었습니다. EMO 농도를 가로축으로, 피크 면적을 세로축으로 표시했습니다. 최적의 선형 범위를 결정하기 위해 EMO의 표준 곡선을 그렸습니다. 모든 HPLC 주입 샘플은 컬럼을 보호하기 위해 0.45μm 유기 필터를 통해 여과되었습니다.

CSO-SA/EMO 준비

이 연구에서 EMO는 초음파 프로브로 캡슐화되었습니다. 10%의 초기 제형 비율(EMO:CSO-SA, w/w)을 출발점으로 사용했습니다. EMO 용액을 ice bath에서 미셀 용액에 천천히 적가하였다. 그런 다음 초음파 프로브를 20 사이클(400 W, 작업 2 초, 정지 3 초) 동안 적용했습니다.

약물이 적재된 미셀을 투석 백(MWCO, 3.5 kDa)으로 옮기고 탈이온수에 대해 24시간 동안 투석하여 용매에서 에탄올을 제거했습니다. 순수한 CSO-SA/EMO는 투석액을 원심분리하여 유리 EMO를 제거하여 얻었습니다.

CSO-SA/EMO의 속성(입자 직경 전위, TEM, EE%)

CSO-SA/EMO의 입자 크기 및 표면 전위는 입자 크기 및 표면 전위 분석기로 측정되었습니다.

0.1mg/ml CSO-SA/EMO 용액을 탄소 필름으로 덮인 구리 와이어에 적가하고 2% 인텅스텐산으로 염색하고 건조시켰다. CSO-SA/EMO의 형태와 입자크기는 투과전자현미경으로 관찰하였다.

CSO-SA/EMO의 포획 효율(EE%) 및 약물 로딩(DL%)은 유기 용매 추출 및 HPLC에 의해 검출되었다. CSO-SA/EMO 미셀 용액 200㎕ 샘플에 메탄올 1.8㎕를 첨가하여 미셀을 분산시키고 약물을 추출하였다. EMO 농도는 C_EMO로 측정되었습니다. . 또 다른 400 μL의 CSO-SA/EMO 미셀 용액을 한외여과 원심분리 튜브에 넣고 원심분리(12,000 rpm, 5 min)하여 상등액을 얻었다. EE% 및 DL%는 다음 공식에 따라 계산되었습니다.

$$ \mathrm{EE}\%=\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times V/{M}_{\mathrm{EMO}}\times 100 \% $$$$ \mathrm{DL}\%=\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times \mathrm{V}/\left[\left( 10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times V+{M}_{\mathrm{CSO}-\mathrm{SA}}\right]\times 100\% $$

여기서 C _이모 미셀의 EMO 농도, C 한외여과 원심분리 후 약물이 로딩된 미셀의 EMO 농도, V M은 투석을 받은 약물이 적재된 미셀의 부피입니다. _이모 약물 로딩 동안 투여된 EMO의 양, M _CSO-SA CSO-SA의 질량입니다.

체외 약물 방출 평가

CSO-SA/EMO로부터의 약물 방출은 방출 매질로 PBS(pH 7.2)를 사용하여 조사되었습니다. 1 밀리리터의 약물이 장전된 미셀 용액을 양쪽 끝이 밀봉된 3.5kDa 투석 백에 넣은 다음 튜브를 포함하는 적절한 방출 매질에 넣었습니다. 투석 백을 37 °C 수평 온도 조절기 쉐이커에 넣었습니다. 샘플을 정해진 시점에 채취하고 동일한 부피의 새로운 방출 매질로 교체했습니다. 시료의 EMO 함량은 HPLC로 측정하고 EMO 누적 방출량을 계산했습니다.

CSO-SA/EMO의 세포독성

CSO-SA/EMO, CSO-SA 및 EMO를 처리한 위암 세포의 생존율을 MTT assay로 검출하였다. 세포를 약 10⁵ 농도로 96웰 플레이트에 접종했습니다. /ml. CSO-SA/EMO, CSO-SA 및 EMO를 다른 농도로 첨가했습니다. 다른 시간 동안 배양한 후, 20 μL의 MTT 작업 용액을 첨가했습니다. 4 h의 배양 후, 200 μL의 DMSO를 첨가하고 570 nm에서 용액의 광학 밀도(OD)를 마이크로플레이트 리더로 측정했습니다.

CSO-SA/EMO가 세포 주기에 미치는 영향

두 세포주의 세포를 10⁵ 의 밀도로 6웰 플레이트에 접종했습니다. /mL. 12시간 배양 후, CSO-SA, CSO-SA/EMO 및 EMO를 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포를 소화하고 수집하고 세척했습니다. 그런 다음 500μL의 PI 염색 용액을 각 세포 샘플에 첨가하고, 세포 펠렛을 천천히 재현탁하고, 세포를 37℃에서 30분 동안 암소에서 배양하였다. 488 nm의 여기 파장에서 유세포 분석기에 의해 적색 형광이 검출되었습니다. DNA 함량은 FlowJo 소프트웨어로 분석되었습니다.

생체내 및 조직학적 분석으로 평가된 CSO-SA/EMO의 항종양 효과

동물 실험은 Zhejiang University의 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 수행되었습니다. MGC803 셀(1 × 10⁶ )을 5-6주령에 수컷 누드 마우스의 오른쪽 앞 옆구리에 피하 주사했습니다. 종양이 약 5 mm의 직경으로 성장하도록 하였다. 이때 마우스를 무작위로 대조군, EMO 주사군, CSO-SA/EMO 주사군으로 나누어 각 군에 3마리씩 넣었다. 모든 마우스에 꼬리 정맥을 통해 관련 시약을 2 주 동안 하루에 한 번 정맥 주사했습니다. 전자 버니어 캘리퍼스를 사용하여 종양(b)의 장경(a) 및 단경(b)을 측정했습니다. 종양 부피는 V 공식에 따라 계산되었습니다. =a × b² /2. 각 마우스의 체중을 기록한 후 조직학적 분석을 위해 종양을 수집했습니다. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색 후 종양 조직에서 종양 억제율을 결정하였다. TUNEL(Terminal deoxynucleotide transferase dUTP nick-end labeling)은 제조업체의 지침에 따라 제자리 세포 사멸 검출 키트를 사용하여 말단 회장 조직에서 세포 사멸을 검출하기 위해 수행되었습니다.

결과 및 토론

CMC 및 ¹ CSO-SA의 H NMR 스펙트럼

양친매성 고분자는 친수성 매질에서 미셀로 자가 조립됩니다. CMC가 낮을수록 미셀이 더 많이 형성되었습니다. 이것은 정맥 투여 후 미셀 구조의 유지에 유익했습니다. CSO-SA가 미셀을 형성할 때, 파이렌 형광 프로브는 마이셀의 소수성 코어에 쉽게 들어갈 수 있어 하전된 파이렌의 형광 강도를 증가시켜 방출 스펙트럼의 강도를 증가시켰다. 이 시점에서 나 ₃ 나보다 훨씬 빠르게 증가했습니다. ₁ , 따라서 나 ₁ /나 ₃ 형광 강도 비율이 급격히 감소했습니다. I에서 중요한 중단점이 관찰될 수 있습니다. ₁ /나 ₃ 플롯 및 Log C 값(그림 1). 변곡점 계산은 CMC가 179.02 μg/mL인 것으로 나타났습니다. CMC가 작을수록 미셀을 형성하는 능력이 강하고 희석에 대한 저항성이 강해 정맥 투여 후 미셀 구조 보호가 향상됩니다.

<그림>

형광 강도 비율의 변화(I ₁ /나 ₃ ) 대 CSO-SA의 대수 농도

EDC를 가교 결합제로 사용하여 SA의 카르복실기와 반응하여 활성 중간체 -OO-아실 이소우레아 유도체를 형성하였다. 이것은 CSO의 1차 아민기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있습니다. CSO-SA의 구조는 핵자기공명 proton 스펙트럼을 기반으로 결정 및 확인되었다. ¹ H NMR(400 MHZ, D₂ O) δ 1.06(m, CH2), 1.02(m, CH3)는 각각 SA의 메틸렌 양성자 및 메틸 양성자에 해당합니다.

아미노 그룹의 대체 학위

CSO-SA의 SD%는 키토산에서 스테아르산으로 치환된 아미노기의 백분율입니다. TNBS는 키토산의 유리 아미노기와 반응하여 344 nm에서 UV 흡수를 갖는 트리니트로벤젠 유도체를 형성했습니다. 키토산의 트리니트로벤젠 유도체의 표준 곡선은 344 nm에서 UV 흡수에 의해 결정되었습니다. CSO-SA의 SD%는 9.3 ± 8%로 계산되었습니다. 이를 통해 CSO와 SA가 이식 비율을 기준으로 성공적으로 연결되었음을 확인했습니다.

CSO-SA, CSO-SA/EMO 입자 크기 및 가능성

표 1은 CSO-SA의 Z-평균이 139.3 ± 2.2 nm임을 보여줍니다. PDI는 0.179 ± 0.03으로 비교적 균일한 분산을 나타냅니다. CSO-SA와 비교하여 CSO-SA/EMO의 Z-평균 및 PDI가 증가했습니다. EMO를 로딩한 후, CSO-SA/EMO의 표면 양전하는 CSO-SA의 표면 양전하보다 높았다.

세포 흡수

FITC는 CSO-SA의 물리화학적 특성에 영향을 미치지 않았습니다. 우리는 fluorescein FITC를 CSO-SA에 접목하여 FITC-CSO-SA를 얻었습니다. Hoechst 33342로 세포를 염색한 후 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 FITC-CSO-SA 세포의 흡수를 관찰했습니다. 우리는 시간이 증가함에 따라 MGC803의 흡수가 점차 증가하고 FITC 형광이 점차적으로 증가한다는 것을 발견했습니다. BGC823의 미셀 흡수는 시간 의존적 방식으로 MGC803과 유사했습니다. FITC-CSO-SA는 세포 투과성이 우수하고 위암 세포의 세포질에 고르게 분포되어 있다(Fig. 2).

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MGC803에서 CSO-SA 미셀의 시험관 내 세포 시간 의존적 흡수(a ) 및 BGC823(b ) 각각 1, 4, 8, 12 h에 대한 셀(파란색, Hoechst 33342, 녹색, FITC, 눈금 막대 =50 μm)

생체 내 CSO-SA 배포

근적외선(NIR) 이미징 기술은 생체 재료 및 조직을 투과하는 데 유리합니다. CSO-SA/DiR을 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주입한 후 CSO-SA/DiR의 분포를 관찰하고 작은 동물 생체 이미저를 사용하여 다른 시간에 기록했습니다. 도 3에 나타난 바와 같이, CSO-SA/DiR의 분포는 꼬리 정맥 주사 후 4 h에서 다른 미셀과 유사하였으며 주로 간, 비장 및 종양 조직에 분포하였다. 종양에서 나노마이셀의 분포는 시간이 지남에 따라 강도가 점진적으로 증가했습니다. 이는 CSO-SA 이식편이 주로 나노마이셀의 EPR 효과로 인해 우수한 수동적 표적화 능력을 가짐을 나타냅니다(그림 3).

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i.v. 후 다른 시간에 CSO-SA/DiR의 전신 이미지. 주사

CSO-SA/EMO 준비

약물 로딩에 대한 다양한 pH 환경의 영향

우리는 CSO-SA 용액을 준비하고 CSO-SA의 pH를 조정하여 약물 로딩에 대한 pH의 영향을 조사했습니다. 도 4에 도시된 바와 같이, CSO-SA는 우수한 약물 로딩 능력을 갖고 pH 6.4-6.8 범위에서 포물선 경향을 나타냈다. 가장 높은 수준의 약물 로딩은 pH 6.6에서 관찰되어 이 값을 약물 로딩에 대한 최적의 pH로 만듭니다(그림 4).

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약물 로딩에 대한 CSO-SA 이식편의 다양한 pH 값의 영향. 데이터는 평균 ± SD(n =3)

캡슐화 효율성, TEM 및 약물 로딩

CSO-SA는 쉘 코어 나노복합체 미셀로 자가 조립됩니다. 소수성 모이어티는 소수성 코어 구조를 자발적으로 형성하여 친수성 매체를 격퇴합니다. EMO는 소수성 구조로 인해 소수성 코어에 쉽게 캡슐화될 수 있기 때문에 이 구조는 약물 로딩을 위한 핵심 매개체를 제공합니다. 우리는 EMO의 용량을 변화시켜 EMO의 로딩 용량에 대한 CSO-SA의 영향을 조사했습니다. 도 5에 도시된 바와 같이, EMO 투여량이 증가함에 따라 약물 로딩량이 증가한다. CSO-SA의 로딩률은 비율이 30%일 때 21.16%까지 도달했습니다(그림 5).

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약물 부하에 대한 EMO 및 CSO-SA의 다양한 비율(5-30%)의 영향. 데이터는 평균 ± SD(n =3)

CSO-SA/EMO는 투과 전자 현미경으로 30,000배 확대되었습니다. 나노셀의 모양과 크기를 관찰하고 기록했습니다.

CSO-SA/EMO의 EMO 릴리스

약물이 로딩된 미셀 용액을 3.5 kDa 투석 백에 첨가하고 PBS(pH 7.2)를 방출 매질로 사용했습니다. 샘플이 제거될 때마다 동일한 양의 새로운 방출 배지로 교체되었습니다.

여러 시점에서 EMO의 농도를 HPLC로 측정한 후 누적 방출 백분율을 계산했습니다. Fig. 6에서 보는 바와 같이 CSO-SA/EMO는 free EMO에 비해 유의한 지속방출 효과를 보였다. 이러한 결과는 자유 EMO의 방출 비율이 0.5 h에서 38.4%인 반면 CSO-SA/EMO로부터의 EMO 방출 비율은 약 6.6%임을 보여줍니다. 4 h에서 자유 EMO의 방출 비율은 83.7%였고 CSO-SA/EMO의 방출 비율은 약 32.5%였습니다. 72시간 이내에 자유 EMO의 방출은 97.2%에 도달한 반면 CSO-SA/EMO로부터의 EMO 방출은 78.4%였습니다. EMO는 두 가지 주요 방법으로 CSO-SA/EMO 약물 로딩된 미셀에서 방출되었습니다. 즉, 미셀 핵에서 EMO 해리를 통해 그리고 미셀 코어에서 방출 매질로 침투하는 것입니다.

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72 h 동안 CSO-SA/EMO의 EMO 방출 프로필. 그래프의 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다(n =3)

위암 세포에 대한 CSO-SA/EMO의 독성

MTT 분석은 세포 생존력을 감지하는 표준 방법입니다. 유리 EMO, CSO-SA 및 CSO-SA/EMO의 MGC803 및 BGC823 위암 세포에 대한 세포 독성은 MTT 분석을 사용하여 측정되었습니다. EMO 및 CSO-SA/EMO가 MGC803 및 BGC823 세포를 용량 및 시간 의존적으로 억제할 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 동일한 농도에서 CSO-SA/EMO는 유리 EMO 용액에 비해 MGC803 및 BGC823 세포에 대한 억제 효과가 더 높았다. IC₅₀ 위암 세포에 대한 EMO 및 CSO-SA/EMO의 값(표 2)을 계산했습니다. IC₅₀ CSO-SA/EMO는 각 시점(24 h, 48 h, 72 h)에서 EMO보다 유의하게 낮았다. IC₅₀ CSO-SA의 값은 CSO-SA가 생물학적 독성이 거의 없는 안전한 생물학적 운반체임을 나타내어 CSO-SA/EMO의 세포독성이 EMO에 의해 유발되었음을 확인했습니다(그림 7).

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CSO-SA, EMO 및 CSO-SA/EMO를 24 h, 48 h 및 72 h 동안 처리한 MGC803 및 BGC823 위암 세포의 세포 생존율. 데이터는 평균 ± SD(n =3)

Table 2 및 Fig. 7은 CSO-SA/EMO 약물 전달 시스템의 세포 독성이 free EMO보다 유의하게 더 높음을 보여주었다. 그러나 생체 내 환경에서 CSO-SA/EMO와 자유 EMO의 방출을 모사했을 때 자유 EMO의 방출은 0.5 h에서 38.4%에 도달한 반면 CSO-SA/EMO의 방출은 6.6%에 불과했습니다. 전반적으로 각 시점에서 free EMO의 농도가 CSO-SA/EMO보다 높았다.

이 현상은 쉽게 설명됩니다. CSO-SA/EMO가 EMO를 비교적 느리게 방출했지만 CSO-SA/EMO의 항종양 효과는 느려지거나 감소하지 않습니다. 많은 연구에서 나노약물 전달 시스템이 화학요법 약물의 항종양 활성을 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다[21].

첫째, free EMO는 초기의 폭발적인 활동을 나타내지만 EMO는 세포에 의해 효율적으로 흡수될 수 없는 반면 CSO-SA는 endocytosis 또는 phagocytosis를 통해 세포 흡수를 크게 가속화합니다.

둘째, CSO-SA/EMO가 세포막에 근접할 때 나노입자와 세포막 사이의 상호작용은 나노마이셀의 구조 및 특성뿐만 아니라 이온 채널과 같은 생물학적 거대분자의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 CSO-SA/EMO가 세포막에 부착되면 단순한 물리적 흡착이 아니라 세포의 동적 균형을 변화시켜 CSO-SA/EMO의 세포독성을 더욱 촉진할 수 있습니다.

마지막으로, 유리 EMO는 소수성 안트라퀴논 구조를 가지고 있어 혈액 내 분포가 불량합니다. CSO-SA/EMO 약물 전달 시스템은 EMO의 용해도를 높이고 용해를 개선하여 주변 세포의 분자 농도를 높입니다.

FCM에 의한 세포 주기 정지 감지

세포 주기 분석은 악성 종양의 임상 치료에서 중요한 측면입니다. 약물에 민감한 기간 동안 종양 세포에 주기 특이적 약물을 적용하면 큰 효과가 있는 것으로 나타났습니다. ethidium bromide 유사체는 정상 세포를 투과할 수 없지만 손상된 세포막을 투과하여 세포 핵을 염색할 수 있습니다. PI가 포함된 이중 가닥 DNA는 적색 형광을 생성하며 형광 강도는 이중 가닥 DNA의 수준에 비례합니다. DNA 함량은 PI로 DNA 염색 후 유세포 분석(FCM)에 의해 결정되었습니다. DNA 함량 분포를 기반으로 세포 주기 분포 및 세포 사멸을 분석했습니다.

연구에 따르면 EMO가 세포 주기 분포에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다[11, 22]. FCM 분석은 CSO-SA/EMO 및 EMO가 세포 주기의 G2/M 단계에서 MGC803 및 BGC823 세포를 차단할 수 있음을 보여주었습니다.

MGC803 세포를 동일한 농도(20 μM)의 CSO-SA, 유리 EMO 및 CSO-SA/EMO 용액에 24시간 동안 노출시켰다. G2/M기에서 MGC803 세포의 비율은 각각 8.95%, 15.29% 및 23.12%인 것으로 밝혀졌습니다. 대조군 비율은 6.47%였다. 동일한 조건에서 20μM CSO-SA, free EMO 또는 CSO-SA/EMO를 처리한 G2/M에서 BGC823 세포의 비율은 각각 14.25%, 16.79% 및 35.71%로 대조군보다 높은 값이었습니다. (13.66%). 이러한 데이터는 CSO-SA/EMO가 MGC803 및 BGC823 세포의 G2/M 단계를 동일한 농도에서 유리 EMO보다 더 효율적이고 유의하게 차단한다는 것을 보여주었습니다. CSO-SA는 대조군과 차이가 없었다(Fig. 8).

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24시간 동안 EMO 및 CSO-SA/EMO로 처리한 MGC803 및 BGC823 세포의 세포 주기 분포. 학생의 t 테스트가 계산되었고 데이터는 평균 ± SD(n =3), (*p <0.05, ^** 피 <0.005, ^*** 피 <0.001)

생체 내 CSO-SA/EMO의 항암 효과

CSO-SA/EMO의 항종양 효과를 더 연구하기 위해 생체 내에서 종양 억제율과 세포 사멸 수준을 평가했습니다. 결과는 CSO-SA/EMO와 EMO 모두 종양 성장에 주목할만한 억제 효과가 있음을 보여주었다(그림 9a). CSO-SA/EMO 그룹의 종양 억제율은 EMO 그룹의 3배였습니다(그림 9d). 각 그룹의 마우스 무게는 크게 변하지 않았습니다(그림 9b). 이것은 CSO-SA/EMO와 EMO가 상대적으로 안전하다는 것을 보여주었습니다. 각 그룹의 종양 조직에서 형태학적 변화와 세포 사멸은 CSO-SA/EMO가 상당한 항종양 효과를 갖는 것으로 나타났습니다(그림 9e, f).

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생체 내 CSO-SA/EMO의 항종양 효과. 아 각 그룹의 종양 모양. ㄴ 각 그룹의 마우스 체중. ㄷ 각 그룹의 종양 부피. d 종양 억제율. 이 각 그룹의 TUNEL 염색 종양 조직의 대표적인 이미지(축척 막대 =200 μm). 에 각 그룹의 HE 염색 종양 조직의 대표적인 이미지(축척 막대 =200 μm)

결론

이 연구에서 우리는 다른 방법으로 CSO-SA의 구조, CMC, SD%, 입자 크기 및 잠재력을 감지했습니다. 결과는 양친매성 CSO-SA가 운반체로서 잘 수행되었음을 입증합니다. Fluorescence intensity of gastric cancer cells showed CSO-SA had been taken up rapidly within 12 h. Nude mice were used as a model to study the distribution of CSO-SA within 72 h. Over time, CSO-SA distribution in lesion became more concentrated exhibiting a good passive targeting effect.

CSO-SA/EMO was prepared with ultrasound-dialysis method. CSO-SA had strong drug-loading capacity. When environment pH was set at 6.6, the level of drug loading reached 21.6% at a 30% formulation ratio. Compared with CSO-SA, CSO-SA/EMO had bigger particle size and zeta potential. The shape of CSO-SA/EMO could be recorded directly using TEM. The release of EMO from CSO-SA/EMO was 78.4% within 72 h, it indicated a smooth and continuous process in body. Considering the antitumor effect of CSO-SA/EMO compared with free EMO, we confirmed it with various experiments.

CSO-SA toxicity to gastric cancer cells was detected by MTT assay. The results showed that CSO-SA was a safe biological carrier. Compared with that of free EMO, CSO-SA/EMO significantly enhanced the antitumor activity against gastric cancer cells. MGC803 and BGC823 cell cycle could be arrested in the G2/M phase more effectively by CSO-SA/EMO. Tumor volume, HE staining, and TUNEL assay proved more significant antitumor effect of CSO-SA/EMO than free EMO.

Based on above results, CSO-SA is both biocompatible and safe carrier. CSO-SA/EMO in this study utilizes a new and effective dosage formulation for the treatment of cancer and exhibits good passive targeting effect in vivo.