에모딘 탑재 스테아르산-그-키토산 올리고당 나노미셀: 설계, 특성화 및 항종양 활성

초록

본 연구의 목적은 에모딘 탑재 스테아르산-그-키토산 올리고당(CSO-SA/EMO)을 제조 및 특성화하고, 그 체외 항종양 활성을 평가하는 것이었습니다. 본 연구에서 스테아르산-그-키토산 올리고당을 운반체로 사용하여 다양한 방법으로 물리화학적 특성을 결정했습니다. 세포 섭취 거동은 FITC 표지 스테아르산-그-키토산 올리고당으로 조사했습니다. CSO-SA/EMO는 초음파와 투석으로 제조했습니다. 입자 크기, 표면 전위, 포집 효율, 약물 방출 거동을 체외에서 연구했습니다. MTT 분석과 유세포 분석으로 CSO-SA/EMO가 위암 세포에 미치는 영향을 조사했습니다. 결과는 CSO-SA/EMO 입자 크기가 스테아르산-그-키토산 올리고당보다 크고 전위가 더 작음을 보였습니다. 12시간 후 MGC803과 BGC823 세포의 미셀 섭취가 충분했으며, 미셀은 쥐에서 병변 부위에 풍부하게 축적되어 우수한 수동적 EPR 표적화를 달성했습니다. MTT와 세포 주기 정지 분석은 CSO-SA/EMO가 자유 에모딘에 비해 MGC803과 BGC823 세포에 대한 항종양 활성을 유의미하게 향상시킴을 보였습니다. 종양 부피, 헤마톡실린-에오신 염색, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉 엔드 라벨링 분석은 CSO-SA/EMO가 체내 종양 조직에 유의미한 항종양 효과가 있음을 입증했습니다. 결론적으로, 초음파-투석 법은 CSO-SA/EMO 제조를 위한 간단하고 효과적인 방법을 제공했습니다. 미셀 시스템을 이용한 에모딘 전달이 항종양 효과를 효과적으로 개선했습니다.

서론

에모딘(EMO)은 대황, 호장근, 하수오 등 전통 한약재에서 주로 추출되는 천연 안트라퀴논 유도체입니다. 전통 한의학(TCM)은 낮은 독성, 적은 부작용, 저비용으로 임상 연구에서 널리 사용됩니다[1].

연구에 따르면 EMO는 면역억제, 진해, 항고혈압, 항염증, 항균, 항암 등 광범위한 약리 활성을 가집니다. EMO는 암세포 성장 억제[2,3,4] 및 종양 세포 세포자멸사, 종양 발생, 세포 증식, 침윤, 전이 조절 관련 유전자 조절[5,6,7,8,9]이 보고되었습니다. EMO가 인간 결장 선암 세포, 간암 세포, 림프구성 백혈병 세포[10], 인간 설암 SCC-4[11] 등 다양한 암세포를 억제할 수 있음이 밝혀졌습니다. EMO는 위암, 유방암, 전립선암에서 종양 세포 증식 억제[7, 12]. 그러나 EMO는 정상 인간 치은 섬유아세포[13], 인간 기관지 상피 세포[14], 인간 유방 세포[15] 등 정상 세포에 세포독성 효과를 나타내지 않습니다. 이는 EMO가 정상 세포에 비해 종양 세포에 선택적 세포독성을 나타냄을 보여줍니다.

키토산은 키틴의 탈아세틸화 형태인 천연 다당류입니다. 이 천연 고분자는 우수한 수용성, 생물학적 기능성, 혈액 적합성, 미생물 분해성 특성을 가지며 다양한 생물의학적 응용으로 알려져 있습니다. 우리는 산성 조건에서 키토산아제를 사용하여 고분자량 키토산(450kDa)을 분해하여 저분자량 키토산 올리고당(CSO, 18kDa)을 얻었습니다. CSO는 세포막을 강하게 투과할 수 있습니다[16] 스테아르산(SA)은 당단백질 경로를 통해 핵으로 들어갈 수 있습니다. 카르보디이미드(EDC)를 결합 시약으로 사용하여 CSO를 SA로 소수성 개질하여 양친매성 스테아르산-그-키토산 올리고당(CSO-SA)을 합성했습니다.

EMO가 광범위한 생물학적 활성을 가지지만, 안트라퀴논 구조로 인해 물에 잘 녹지 않습니다. 치료 약물이 혈류를 통해 수송되므로, 용해도는 흡수와 분포에 직접 영향을 미칩니다. CSO-SA 그라프트는 수용액에서 자가 조립하여 소수성 내부와 친수성 외부를 가진 나노미셀을 형성합니다. 우리는 초음파 프로브를 사용하여 모인 상태의 나노미셀을 분산시켰습니다. EMO와 CSO 모두 소수성이므로, EMO는 미셀 중심에 캡슐화되었습니다.

여러 모델 약물이 CSO-SA에 적용되며, 이는 모델 약물의 분자량, 구조, 소수성을 요구합니다. 기존 연구에는 커큐민[17], 독소루비신[18], 라미부딘 스테아레이트[19], 옥살리플라틴[20] 등이 포함되며, 이들은 항종양 효과를 유의미하게 개선할 수 있습니다. 우리는 CSO-SA/EMO의 최적 적재 조건을 탐구했습니다. CSO-SA/EMO는 더 높은 용해도와 이용 효율을 가진 새로운 제형을 만듭니다. CSO-SA/EMO는 모델 약물이나 운반체 선택, 미셀의 임상 적용에 아이디어를 제공할 수 있습니다.

실험 재료 및 방법

실험 재료

BALB/C+/nu 수컷 누드 쥐는 절강대학 실험동물 센터에서 얻었습니다. 저분화 위암 세포주 MGC803과 BGC823은 ATCC 세포 은행에서 구입했습니다. RPMI-1640 배양 배지와 FBS는 항저우 홀리 리프 생명공학 회사에서 얻었습니다. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, 트리니트로벤젠 설폰산, 피렌은 Sigma Aldrich에서 공급했습니다. 절강대학에서 CSO-SA를 제공했습니다. 기타 시약은 분석급을 구입했습니다.

CSO-SA의 CMC 및 ¹H NMR 스펙트럼 결정

본 보고서에서 CSO-SA의 임계 미셀 농도(CMC)는 피렌을 형광 프로브로 사용하여 형광 분광광도법으로 결정했습니다. 다양한 농도의 CSO-SA 용액을 피렌 아세톤 용액에 첨가한 후 아세톤을 하룻밤 증발시켰습니다. 다양한 농도 CSO-SA 용액에서 피렌의 방출 스펙트럼과 피크 값을 형광 분광광도법으로 분석했습니다. 스펙트럼의 첫 번째 피크(I₁ = 374nm)와 세 번째 피크(I₃ = 385nm)를 기록했습니다. 로그 농도(Log C)를 가로축, I₁/I₃를 세로축으로 플로팅하여 고분자 미셀의 CMC를 계산했습니다.

CSO와 CSO-SA를 10mg/ml 농도로 D₂O에 용해했습니다. ¹H NMR 스펙트럼을 기록, 비교, 분석하여 CSO와 CSO-SA의 특징적 피크를 확인했습니다.

아민 치환도 검출

아민 치환도(SD%)는 트리니트로벤젠 황산(TNBS) 법으로 검출했습니다.

CSO와 CSO-SA의 다양한 농도 용액을 제조한 후 4% NaHCO₃와 0.1% TNBS를 순차적으로 첨가했습니다. 수욕에서 37°C로 2시간 배양 후 2mol/L 염산을 첨가했습니다. 30분 초음파 처리 후 자외선-가시광선 분광광도법으로 344nm에서 흡광도 측정. 표준 곡선을 그리고 CSO-SA 샘플의 SD%를 계산했습니다.

CSO-SA 입자 크기 및 전위

1.0mg/ml CSO-SA 용액을 제조하고 초음파 세포 분쇄 프로브로 미셀을 완전히 분산시켰습니다. 입자 크기 및 표면 전위 분석기로 CSO-SA의 입자 크기와 전위를 결정했습니다.

CSO-SA 세포 섭취

FITC와 CSO-SA 용액을 혼합, 하룻밤 교반, 투석 백으로 이송. 탈염수로 24시간 투석하여 미반응 FITC와 무수 에탄올 제거. 최종적으로 1.0mg/mL 농도의 FITC 표지 CSO-SA(FITC-CSO-SA) 용액 획득.

MGC803과 BGC823 세포를 표적 세포로 사용하여 CSO-SA 세포 섭취 조사. 세포 증식률에 따라 24웰 플레이트에 파종하고 하룻밤 배양하여 완전히 부착될 때까지 기다림. 설정 시점에 80μL FITC-CSO-SA 용액 첨가. 10μL Hoechst 33342(1mg/mL)로 15분 배양하여 세포핵 염색. 레이저 주사 공초점 현미경으로 FITC-CSO-SA에 의한 CSO-SA 섭취 검출.

CSO-SA 체내 분포

CSO-SA 체내 분포는 DiR 형광 염료 염색으로 결정했습니다. CSO-SA/DiR 용액을 투석으로 제조했습니다.

6주령 수컷 누드 쥐를 실험 모델로 사용. 누드 쥐에 1×10⁸/mL MGC803 세포 피하 접종. 종양 세포 부피 약 200mm³에서 CSO-SA/DiR을 꼬리 정맥 투여. 설정 시점에서 쥐 마취. 소동물 생체 영상 장치(파장 범위 580-700nm, 노출 시간 1000ms)로 CSO-SA/DiR 체내 시분포 기록.

HPLC로 EMO 농도 검출

EMO 농도는 HPLC로 결정했습니다. EMO를 Eclipse XDB-C18 충전 컬럼(4.6×250mm, 5μm)에 보호 컬럼(4.6×10mm, 5μm)과 함께 적용. 컬럼 온도 30°C, 유속 1.0mL/min, 검출 파장 254nm, 주입량 20μL 설정. 이동상은 메탄올/0.1% 인산(85:15, v/v). EMO 농도를 가로축, 피크 면적을 세로축으로 플로팅. EMO 표준 곡선 그려 최적 선형 범위 결정. 모든 HPLC 주입 샘플은 0.45-μm 유기 필터로 여과하여 컬럼 보호.

CSO-SA/EMO 제조

본 연구에서 EMO를 초음파 프로브로 캡슐화했습니다. 초기 제형 비율 10%(EMO:CSO-SA, w/w)를 시작점으로 사용. EMO 용액을 얼음 욕조에서 미셀 용액에 방울방울 천천히 첨가. 초음파 프로브를 20사이클(400W, 작업 2초, 정지 3초) 적용.

약물 탑재 미셀을 투석 백(MWCO, 3.5kDa)에 이송하고 탈염수로 24시간 투석하여 용매 에탄올 제거. 투석액을 원심분리하여 자유 EMO 제거, 순수 CSO-SA/EMO 획득.

CSO-SA/EMO 특성(입자 직경 전위, TEM, EE%)

입자 크기 및 표면 전위 분석기로 CSO-SA/EMO 입자 크기와 표면 전위 측정.

0.1mg/ml CSO-SA/EMO 용액을 탄소막 덮인 구리선에 떨어뜨리고 2% 포스포텅스텐산으로 염색, 건조. 투과 전자 현미경으로 CSO-SA/EMO 형태와 입자 크기 관찰.

유기 용매 추출과 HPLC로 CSO-SA/EMO 포집 효율(EE%)과 약물 적재량(DL%) 검출. 200μL CSO-SA/EMO 미셀 용액에 1.8mL 메탄올 첨가하여 미셀 분산 및 약물 추출. EMO 농도 C_EMO 측정. 또 다른 400μL CSO-SA/EMO 미셀 용액을 초여과 원심분리 튜브에 넣고 원심분리(12,000rpm, 5분)하여 상등액 획득. EE%와 DL%는 다음 공식으로 계산:

EE% = (10 × C_EMO - C) × V / M_EMO × 100%

DL% = (10 × C_EMO - C) × V / [(10 × C_EMO - C) × V + M_CSO-SA] × 100%

여기서 C_EMO는 미셀 내 EMO 농도, C는 초여과 원심분리 후 약물 탑재 미셀의 EMO 농도, V는 투석된 약물 탑재 미셀 부피, M_EMO는 약물 적재 시 투여된 EMO 양, M_CSO-SA는 CSO-SA 질량.

체외 약물 방출 평가

PBS(pH 7.2)를 방출 매체로 사용하여 CSO-SA/EMO 약물 방출 조사. 1mL 약물 탑재 미셀 용액을 양 끝 밀봉된 3.5kDa 투석 백에 넣고 적절한 방출 매체 포함 튜브에 배치. 투석 백을 37°C 수평 항온 진탕기에 배치. 설정 시점에서 시료 채취 후 동일 부피 신선한 방출 매체로 교체. HPLC로 시료 내 EMO 함량 결정, 누적 EMO 방출량 계산.

CSO-SA/EMO 세포독성

MTT 분석으로 CSO-SA/EMO, CSO-SA, EMO 처리 위암 세포 생존율 검출. 약 10⁵/ml 농도로 96웰 플레이트에 세포 파종. CSO-SA/EMO, CSO-SA, EMO 다양한 농도 첨가. 다른 시간 배양 후 20μL MTT 작업 용액 첨가. 4시간 배양 후 200μL DMSO 첨가, 마이크로플레이트 리더로 570nm 용액 광학 밀도(OD) 측정.

CSO-SA/EMO 세포 주기 영향

두 세포주 세포를 10⁵/mL 밀도로 6웰 플레이트 파종. 12시간 배양 후 CSO-SA, CSO-SA/EMO, EMO 첨가 24시간 배양. 세포 소화, 수집, 세척. 각 세포 시료에 500μL PI 염색 용액 첨가, 세포 펠릿 천천히 재현탁, 37°C 암소 30분 배양. 488nm 여기 파장에서 유세포 분석기로 적색 형광 검출. FlowJo 소프트웨어로 DNA 함량 분석.

체내 및 조직학적 분석으로 CSO-SA/EMO 항종양 효과 평가

동물 실험은 절강대학 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 수행. 5-6주령 수컷 누드 쥐 우측 전방 옆구리에 MGC803 세포(1×10⁶) 피하 주입. 종양 직경 약 5mm 성장 시, 쥐를 대조군, EMO 주사군, CSO-SA/EMO 주사군으로 무작위 분할, 각 그룹 3마리. 모든 쥐에 관련 시약 꼬리 정맥으로 하루 1회 2주간 정맥 주사. 전자 버니어 캘리퍼로 종양 장경(a)과 단경(b) 측정. 종양 부피 공식 V = a × b²/2로 계산. 각 쥐 체중 기록 후 종양 수집 조직학적 분석. 헤마톡실린-에오신(HE) 염색 후 종양 조직에서 종양 억제율 결정. 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL) 분석으로 제조사 지침에 따라 말단 회장 조직 세포자멸사 검출.

결과 및 논의

CSO-SA CMC 및 ¹H NMR 스펙트럼

양친매성 고분자는 친수성 매체에서 미셀로 자가 조립. 낮은 CMC는 더 큰 미셀 형성을 가져와 정맥 투여 후 미셀 구조 유지에 유리합니다. CSO-SA가 미셀을 형성하면 피렌 형광 프로브가 미셀 소수성 핵으로 쉽게 들어가 하전된 피렌 형광 강도 증가, 방출 스펙트럼 강도 증가. 이 시점에서 I₃가 I₁보다 현저히 빠르게 증가하여 I₁/I₃ 형광 강도 비율이 급격히 감소. I₁/I₃ 플롯과 Log C 값에서 유의미한 변곡점 관찰(그림 1). 변곡점 계산 결과 CMC는 179.02μg/mL. CMC가 작을수록 미셀 형성 능력이 강하고 희석 저항성이 강해 정맥 투여 후 미셀 구조 보호가 개선됩니다.

CSO-SA 로그 농도에 따른 형광 강도 비율(I₁/I₃) 변화

EDC는 SA 카르복실기와 반응하여 활성 중간체 -OO-아실 이소우레아 유도체 형성. 이는 CSO 1차 아민기와 반응하여 아미드 결합 형성. 양성자 핵자기 공명 스펙트럼 기반으로 CSO-SA 구조 결정 및 확인. ¹H NMR (400MHz, D₂O) δ 1.06 (m, CH₂), 1.02 (m, CH₃)는 각각 SA의 메틸렌 양성자, 메틸 양성자에 해당.

아미노기 치환도

CSO-SA SD%는 키토산 상 스테아르산 치환 아미노기 비율. TNBS가 키토산 자유 아미노기와 반응하여 344nm UV 흡수 가지는 트리니트로벤젠 유도체 형성. 키토산 트리니트로벤젠 유도체 표준 곡선 344nm UV 흡수로 결정. CSO-SA SD%는 9.3±8% 계산. 이는 CSO와 SA가 그라프트 비율 기반으로 성공적으로 연결되었음을 확인.

CSO-SA, CSO-SA/EMO 입자 크기 및 전위

표 1에 따르면 CSO-SA Z-평균 139.3±2.2nm. PDI 0.179±0.03으로 비교적 균일한 분산 나타냄. CSO-SA와 비교하여 CSO-SA/EMO Z-평균과 PDI 증가. EMO 적재 후 CSO-SA/EMO 표면 양전하가 CSO-SA보다 높음.

세포 섭취

FITC는 CSO-SA 물리화학적 특성 영향 없음. FITC를 CSO-SA에 접목하여 FITC-CSO-SA 획득. Hoechst 33342로 세포 염색 후 공초점 레이저 주사 현미경으로 FITC-CSO-SA 세포 섭취 관찰. MGC803 섭취가 시간 증가에 따라 점차 증가, FITC 형광 점차 증가. BGC823 미셀 섭취도 시간 의존적으로 MGC803과 유사. FITC-CSO-SA 우수한 세포 투과 능력 보이며 위암 세포 세포질에 고르게 분포(그림 2).

MGC803(a) 및 BGC823(b) 세포에서 1, 4, 8, 12시간 CSO-SA 미셀 체외 시간 의존적 섭취 (파란색, Hoechst 33342; 녹색, FITC; 스케일 바 = 50μm)

CSO-SA 체내 분포

근적외선(NIR) 영상 기술은 생체 물질과 조직 투과에 유리. 누드 쥐 꼬리 정맥에 CSO-SA/DiR 주사 후 소동물 생체 영상 장치로 다양한 시점에서 CSO-SA/DiR 분포 관찰 기록. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 꼬리 정맥 주사 4시간 후 CSO-SA/DiR 분포는 다른 미셀과 유사하며 주로 간, 비장, 종양 조직에 분포. 나노미셀 종양 분포 강도가 시간 증가에 따라 점차 증가. 이는 CSO-SA 그라프트가 나노미셀 EPR 효과로 주로 우수한 수동적 표적화 능력 가짐을 나타냄(그림 3).

정맥 주사 후 다양한 시점 CSO-SA/DiR 전신 이미지

CSO-SA/EMO 제조

다른 pH 환경이 약물 적재에 미치는 영향

CSO-SA 용액 제조 후 CSO-SA pH 조절하여 pH 약물 적재 영향 조사. 그림 4에서 볼 수 있듯이, CSO-SA 우수한 약물 적재 능력 보이며 pH 6.4-6.8 범위에서 포물선 경향 나타냄. pH 6.6에서 최고 약물 적재 수준 보여 이 값이 약물 적재 최적 pH임(그림 4).

CSO-SA 그라프트 다른 pH 값이 약물 적재에 미치는 영향. 데이터는 평균±SD (n=3)로 제시

포집 효율, TEM, 약물 적재량

CSO-SA는 껍질-핵 나노복합체 미셀로 자가 조립. 소수성 부분이 친수성 매체 밀어내며 자발적으로 소수성 핵 구조 형성. 이 구조는 EMO가 소수성 구조로 인해 소수성 핵에 쉽게 캡슐화될 수 있어 약물 적재 핵심 운반체 제공. EMO 투여량 변화로 CSO-SA EMO 적재 용량 영향 조사. 그림 5에서 볼 수 있듯이, EMO 투여량 증가에 따라 약물 적재량 증가. 비율 30%에서 CSO-SA 적재율 최대 21.16% 도달(그림 5).

EMO와 CSO-SA 다른 비율(5-30%)이 약물 적재량에 미치는 영향. 데이터는 평균±SD (n=3)로 제시

CSO-SA/EMO 투과 전자 현미경으로 30,000배 확대. 나노미셀 모양과 크기 관찰 기록.

CSO-SA/EMO EMO 방출

약물 탑재 미셀 용액을 3.5kDa 투석 백에 넣고 PBS(pH 7.2) 방출 매체 사용. 시료 채취 시마다 동일 부피 신선한 방출 매체로 교체.

HPLC로 다양한 시점 EMO 농도 결정, 누적 방출 비율 계산. 그림 6에서 볼 수 있듯이, CSO-SA/EMO 자유 EMO 대비 유의미한 서방 효과 나타냄. 결과에서 자유 EMO 방출 비율 0.5시간 38.4%인 반면 CSO-SA/EMO EMO 방출 비율 약 6.6%. 4시간 자유 EMO 83.7%, CSO-SA/EMO 약 32.5%. 72시간 내 자유 EMO 97.2% 도달, CSO-SA/EMO EMO 방출 78.4%. EMO는 CSO-SA/EMO 약물 탑재 미셀에서 두 주요 방식으로 방출: 미셀 핵에서 EMO 해리, 미셀 핵에서 방출 매체로 침투.

72시간 CSO-SA/EMO EMO 방출 프로파일. 그래프 오차 막대 표준편차 나타냄 (n=3)

CSO-SA/EMO 위암 세포 독성

MTT 분석은 세포 생존율 검출 표준 방법. 자유 EMO, CSO-SA, CSO-SA/EMO MGC803과 BGC823 위암 세포 세포독성 MTT 분석 측정. EMO와 CSO-SA/EMO가 MGC803과 BGC823 세포를 농도 및 시간 의존적으로 억제함 보임. 그러나 동일 농도에서 CSO-SA/EMO가 자유 EMO 용액 대비 MGC803과 BGC823 세포에 더 높은 억제 효과 가짐. EMO와 CSO-SA/EMO 위암 세포 IC₅₀ 값 계산(표 2). 각 시점(24h, 48h, 72h)에서 CSO-SA/EMO IC₅₀이 EMO보다 유의미하게 낮음. CSO-SA IC₅₀ 값은 CSO-SA가 생물학적 독성 적은 안전한 생물학적 운반체임을 보여주며, CSO-SA/EMO 세포독성이 EMO에 기인함 확인(그림 7).

24h, 48h, 72h CSO-SA, EMO, CSO-SA/EMO 처리 MGC803 및 BGC823 위암 세포 생존율. 데이터는 평균±SD (n=3)로 제시

표 2와 그림 7은 CSO-SA/EMO 약물 전달 시스템 세포독성이 자유 EMO보다 유의미하게 높음 보여줌. 그러나 CSO-SA/EMO와 자유 EMO 체내 환경 방출 시뮬레이션 시, 자유 EMO 방출 0.5시간 38.4% 도달, CSO-SA/EMO 6.6%에 불과. 전반적으로 자유 EMO 농도가 각 시점에서 CSO-SA/EMO보다 높음.

이 현상 쉽게 설명 가능. CSO-SA/EMO가 EMO 상대적으로 천천히 방출하지만, 항종양 효과 느려지거나 감소하지 않음. 많은 연구에서 나노 약물 전달 시스템이 화학요법 약물 항종양 활성 개선함 보임[21].

첫째, 자유 EMO가 초기 폭발적 활성 보이지만, EMO가 세포에 효율적으로 섭취되지 않는 반면 CSO-SA가 내포작용이나 식세포작용으로 세포 섭취 크게 가속화.

둘째, CSO-SA/EMO가 세포막에 접근 시 나노입자와 세포막 상호작용이 나노미셀 구조와 특성, 이온 채널 등 생물학적 거대분자 기능에 영향. 따라서 CSO-SA/EMO 세포막 부착은 단순 물리적 흡착 아니며 세포 동적 평형 변화시켜 CSO-SA/EMO 세포독성 추가 촉진.

셋째, 자유 EMO 소수성 안트라퀴논 구조로 혈액 내 분포 열악. CSO-SA/EMO 약물 전달 시스템이 EMO 용해도 증가시키고 용해 개선하여 주변 세포 더 높은 분자 농도 유도.

유세포 분석으로 세포 주기 정지 검출

세포 주기 분석은 악성 종양 임상 치료 중요 측면. 약물 민감 기간 동안 주기 특이적 약물 종양 세포 적용 시 큰 효능 보임. 에티디움 브로마이드 유사체 정상 세포 투과 못 하지만 손상 세포막 투과로 세포핵 염색. PI 삽입 이중가닥 DNA 적색 형광 생성, 형광 강도 이중가닥 DNA 수준 비례. PI DNA 염색 후 유세포 분석(FCM) DNA 함량 결정. DNA 함량 분포 기반 세포 주기 분포와 세포자멸사 분석.

EMO가 세포 주기 분포 영향 줌 보고됨[11, 22]. FCM 분석 결과 CSO-SA/EMO와 EMO가 MGC803과 BGC823 세포를 세포 주기 G2/M기에 차단 가능.

MGC803 세포 동일 농도(20μM) CSO-SA, 자유 EMO, CSO-SA/EMO 용액 24시간 노출. MGC803 G2/M기 비율 각각 8.95%, 15.29%, 23.12%. 대조군 6.47%. 동일 조건 20μM CSO-SA, 자유 EMO, CSO-SA/EMO 처리 BGC823 G2/M기 비율 각각 14.25%, 16.79%, 35.71%로 대조군(13.66%)보다 높음. 이 데이터는 CSO-SA/EMO가 동일 농도에서 자유 EMO보다 MGC803과 BGC823 G2/M기 더 효율적이고 유의미하게 차단함 보여줌. CSO-SA 대조군과 차이 없음(그림 8).

24시간 EMO와 CSO-SA/EMO 처리 MGC803 및 BGC823 세포 세포 주기 분포. 학생 t-검정 계산, 데이터 평균±SD (n=3) 제시 (*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.001)

CSO-SA/EMO 체내 항종양 효과

CSO-SA/EMO 항종양 효과 추가 연구 위해 종양 억제율과 세포자멸사 수준 체내 평가. 결과 CSO-SA/EMO와 EMO 모두 종양 성장에 주목할 억제 효과 가짐(그림 9a). CSO-SA/EMO 그룹 종양 억제율 EMO 그룹 3배(그림 9d). 각 그룹 쥐 체중 유의미 변화 없음(그림 9b). 이는 CSO-SA/EMO와 EMO 모두 상대적으로 안전함 보여줌. 각 그룹 종양 조직 형태 변화와 세포자멸사는 CSO-SA/EMO 유의미한 항종양 효과 가짐 입증(그림 9e, f).

CSO-SA/EMO 체내 항종양 효과. a 각 그룹 종양 모양. b 각 그룹 쥐 체중. c 각 그룹 종양 부피. d 종양 억제율. e 각 그룹 TUNEL 염색 종양 조직 대표 이미지 (스케일 바 = 200μm). f 각 그룹 HE 염색 종양 조직 대표 이미지 (스케일 바 = 200μm)

결론

본 연구에서 다양한 방법으로 CSO-SA 구조, CMC, SD%, 입자 크기, 전위 검출. 결과 양친매성 CSO-SA 운반체로 우수함 입증. 위암 세포 형광 강도 CSO-SA 12시간 내 급속 섭취 확인. 누드 쥐 모델로 72시간 CSO-SA 체내 분포 연구. 시간 경과 CSO-SA 병변 부위 분포 더 농축, 우수한 수동적 표적 효과 나타냄.

CSO-SA/EMO 초음파-투석 법 제조. CSO-SA 강한 약물 적재 능력. 환경 pH 6.6 설정 시 30% 제형 비율에서 약물 적재 수준 21.6% 도달. CSO-SA 대비 CSO-SA/EMO 더 큰 입자 크기와 제타 전위. CSO-SA/EMO 모양 TEM 직접 기록 가능. CSO-SA/EMO EMO 방출 72시간 78.4%, 체내 매끄럽고 지속적 과정 나타냄. CSO-SA/EMO 항종양 효과 자유 EMO 대비 다양한 실험으로 확인.

MTT 분석으로 CSO-SA 위암 세포 독성 검출. 결과 CSO-SA 안전한 생물학적 운반체. 자유 EMO 대비 CSO-SA/EMO 위암 세포 항종양 활성 유의미하게 향상. MGC803과 BGC823 세포 주기 CSO-SA/EMO로 G2/M기 더 효과적 정지. 종양 부피, HE 염색, TUNEL 분석으로 CSO-SA/EMO 자유 EMO보다 더 유의미한 항종양 효과 입증.

위 결과 기반, CSO-SA 생체적합하고 안전한 운반체. 본 연구 CSO-SA/EMO 암 치료 위한 새롭고 효과적인 제형 활용, 체내 우수한 수동적 표적 효과 나타냄.