고형 종양의 부정확한 국소화와 내재적 방사선 저항성은 방사선 치료의 임상적 구현을 심각하게 저해합니다. 본 연구에서는 일괄 수열 공정으로 히알루론산 기능화 산화 가돌리늄 나노입자(HA-Gd2O3 NPs)를 제조하여 종양의 효과적인 자기공명(MR) 영상 및 방사선 감수성 향상을 도모했습니다. HA 기능화 덕분에 직경 105nm의 제조된 HA-Gd2O3 NPs는 물에서 우수한 분산성, 낮은 세포독성, 우수한 생체적합성을 보였으며, HA 수용체 매개 내포작용으로 암세포 세포질로 쉽게 들어갈 수 있었습니다. 중요하게도, HA-Gd2O3 NPs는 MRI 조영제로서 높은 종방향 완화율(r1) 6.0 mM−1S−1을 나타냈으며, 농도 의존적으로 방사선 감수성 향상 효과를 보였습니다. 이러한 발견은 합성된 HA-Gd2O3 NPs가 이중 기능 진단-치료제로서 종양 진단과 방사선 치료에 큰 잠재력을 가짐을 입증했습니다.
방사선 치료는 암에 광범위하게 적용되어 왔으며, 고에너지 X선과 조사 선량의 종양 부위 침착을 통해 자유 라디칼 손상이나 DNA 손상을 유발합니다[1,2,3,4]. 그러나 낮은 방사선 감수성, 종양 국소화의 부정확성, 병변과 정상 조직 간의 열악한 구별로 인한 조사 부작용이 방사선 치료의 임상적 구현을 제한합니다[5]. 따라서 전신 부작용을 최소화하면서 종양 방사선 감수성을 향상시키는 방법 개발이 중요합니다. 나노기술과 방사선 치료의 결합은 방사선 감수성 향상을 위한 잘 확립된 우선순위입니다.
최근 몇 년간 나노기술은 암 진단과 치료를 위한 매력적인 전략으로 간주되어 왔습니다[6,7,8,9,10,11]. 나노입자(NPs)의 주요 기능 중 하나는 NPs의 종양 조직 내 선택적 축적(수동적 표적화, 향상된 투과성 및 잔류(EPR) 효과, 능동적 표적화, 연장된 순환 시간)을 통한 정확한 종양 표적화입니다[12,13,14]. 이전 연구에서 탄소 NPs에 헤테로 원자 도핑이 고유 특성을 효과적으로 조절하고 유익한 특성을 도입함을 입증했습니다[15,16,17]. 흥미롭게도 NPs는 방사선 감수성 증진제로 사용될 수 있습니다[18]. 중금속(고 Z 원소) NPs(예: Au, Bi, Gd)는 높은 X선 포획 단면적과 콤프턴 산란 효과로 인해 방사선 감수성 치료에 유망한 방사선 감수성 증진제로 사용될 수 있습니다[19]. X선이 고 Z 나노입자와 상호작용할 때, 오제 전자와 광전자, 2차 전자의 방출이 암세포를 손상시켜 방사선 치료 중 선량 증강을 제공합니다[20]. 현재까지 가돌리늄 기반 NPs(GdNPs)는 효과적인 MRI 조영제(CAs)로 입증되었습니다[21, 22]. 이들은 정상 조직과 병든 조직, 병변을 비침습적이고 실시간으로 구별합니다. 이 제제들은 종방향 이완 시간을 단축시켜 종방향 완화율 r1에 영향을 미칩니다[23], 부정확한 표적화는 종종 부작용을 초래합니다. 히알루론산(HA)이 클러스터 결정 인자 44(CD44) 등 HA 수용체를 가진 표적 부위에 대한 주요 리간드 및 약물 전달 운반체로 잘 알려져 있습니다[24,25,26].
이전 연구 결과를 바탕으로, 우리는 HA를 표적 리간드로 사용하여 Gd2O3 NPs를 이중 기능화했습니다: 효과적인 종양 표적 MRI CAs와 내재적 방사선 저항성과 종양 국소화의 부정확성을 극복하기 위한 방사선 감수성 증진제. 또한 HA-Gd2O3 NPs는 유망한 MR 영상 제제로 높은 종방향 완화율(r1)을 보여 더 나은 MR 영상 품질을 제공합니다. 현재 이용 가능한 CAs[27, 28]와 비교할 때, 결과적인 HA-Gd2O3 NPs는 세 가지 중요한 이점을 보입니다: 첫째, 천연 세포외 기질을 전구체로 사용하여 우수한 생체적합성을 나타냅니다. 둘째, HA 기능화가 종양 표적화를 크게 개선하고 부작용을 감소시킵니다. 셋째, HA-Gd2O3 NPs는 진단과 치료에서 이중 기능 능력을 가집니다. 방사선 감수성 향상의 효과와 메커니즘을 검증하기 위해, HA-Gd2O3 NPs가 종양 세포 생존율, 세포 주기, 세포자멸사에 미치는 방사선 감수성 효과를 평가했습니다.
본 연구에서는 그림 1에 도시된 바와 같이 간단한 수열 공정으로 HA-Gd2O3 NPs를 성공적으로 제조했습니다. 입자 크기는 동적 빛 산란으로 분석했으며, 형태학적 검사는 투과 전자 현미경으로 수행했습니다. 그림 1a에서 볼 수 있듯이, HA-Gd2O3 NPs는 명백한 응집 없이 균일하게 분산된 이산 준구형 모양을 보였습니다. HA-Gd2O3 NPs의 평균 직경은 105nm였습니다. 정상 조직과 비교하여 종양 조직의 모세혈관 내피 투과성이 증가하고 내피 간극이 100-600nm였습니다[29]. 따라서 바람직한 크기의 NPs는 종양 조직에 쉽게 침투할 수 있으며, 수동적 표적 약물 전달 효율을 크게 높일 수 있습니다.
수열법으로 HA-Gd2O3 NPs 합성 도식 (A) 및 후속 생물의학적 응용 (B)
HA-Gd2O3 NPs 특성화. 저배율(a) 및 고배율(b) TEM 이미지. HA-Gd2O3 NPs의 직경 분포(c) 및 XRD 패턴(d)
HA-Gd2O3 NPs의 상 구조는 그래핀 산화물(GO) 분말을 대조군으로 사용하여 XRD로 조사했습니다. 그림 1d에서 볼 수 있듯이, HA-Gd2O3 NP 회절 패턴에서 하나의 주요 회절 피크(2θ = 12.04°)와 두 개의 부 피크(2θ = 29.6°, 42.1°)가 관찰되었으며, 이는 각각 GO (100 면)와 흑연 (002 면)의 특징적 피크에 해당했습니다. HA-Gd2O3 NPs의 주 격자 간격은 GO의 d001 = 0.85nm보다 작은 0.73nm(브래그 공식으로 계산)를 보였으며, 피크 위치의 상향 이동은 sp3 층 간 간격 감소에 기인할 수 있습니다. 모든 넓은 회절 피크는 HA-Gd2O3 NPs가 비정질 구조를 가짐을 보여주며, 이는 탄소화 공정 중 고도로 무질서한 탄소와 sp2 (C-C) 층 간격 감소에 기인할 수 있습니다. 이 결과는 HA-Gd2O3 NPs가 열악한 결정성을 가지며 이종 다층 구조를 가짐을 추가로 시사하며, 이는 탄소 점에 관한 이전 보고와 일치합니다[30, 31].
HA-Gd2O3 NPs의 표면 작용기와 조성은 푸리에 변환 적외선 분광법과 X선 광전자 분광법으로 조사했습니다. 그림 2a에서 볼 수 있듯이, XPS 스펙트럼은 284.0, 400.0, 530.6, 1188.5eV에서 네 개의 전형적인 피크를 보여주며, HA-Gd2O3 NPs가 주로 가돌리늄, 탄소, 산소, 수소 원소로 구성됨을 나타냅니다. Gd3d 고해상도 스펙트럼(그림 2b)은 1187.5eV와 1221eV에서 두 개의 강한 피크를 보여주며, 32eV의 스핀-궤도 분리를 나타내며, 각각 Gd의 3d5/2와 3d3/2 에너지 준위에 해당합니다. 이러한 관찰은 HA-Gd2O3 NPs에 대한 이전 보고와 잘 일치합니다. 그림 2c에 표시된 O(1s) 스펙트럼은 531.4eV에 위치한 하나의 주요 피크가 지배적이었으며, 이는 O2−와 Gd3+ 사이의 결합에 해당합니다. 벌거벗은 샘플과 HA-Gd2O3 NP 샘플 모두에 대해 FTIR 분광법을 수행했습니다(그림 2d). 벌거벗은 샘플의 경우 그림 2a에서 볼 수 있듯이, 1580과 1380cm−1에서 vas O-C-O의 특징적 흡수 밴드가 탄산염 기의 존재를 드러냈습니다. 3340과 2900cm−1의 넓은 피크는 각각 O-H와 C-H 신축 진동에 기인하며, 표면 흡착수에 해당했습니다. HA-Gd2O3 NPs의 경우, 1580과 1380cm−1에서 COO−의 신축 진동이 강화되어 히알루론산의 카복실기 도입을 나타냈습니다. 이러한 결과는 HA-Gd2O3 NPs의 표면 작용기가 주로 수많은 카보닐, 카복실산염, 하이드록실 기를 포함함을 드러냈습니다. 표면에 위치한 이러한 작용기들은 HA-Gd2O3 NPs에 물에서 우수한 분산성을 부여했습니다. 중요하게도, NPs 표면에 내장된 Gd 이온은 MR 영상과 방사선 감수성 증진에 유용할 수 있으며, 이는 Gd 이온이 주변 환경으로 누출되는 것을 극적으로 방지했습니다.
HA-Gd2O3 NPs의 화학 구조 및 조성. a HA-Gd2O3 NPs의 전체 스캔 XPS 스펙트럼. b Gd3d 스펙트럼. c O1s 스펙트럼. d HA-Gd2O3 NPs의 FTIR 스펙트럼
잠재적 생물의학 제제로서 HA-Gd2O3 NPs의 생체적합성은 생물의학적 응용에 필수적입니다. 먼저, CCK-8 분석을 사용하여 HepG2와 VSMC 세포에서 HA-Gd2O3 NPs의 고유 세포독성을 평가했습니다. 그림 3a와 S. 그림 1에서 볼 수 있듯이, HA-Gd2O3 NPs는 3일까지 명백한 세포독성을 보이지 않았습니다. 24시간 노출 후 200μg/mL 농도에서도 세포 생존율은 약 90%였습니다. 둘째, 용혈 분석을 사용하여 HA-Gd2O3 NPs의 체내 혈액적합성을 평가했습니다. 그림 3b에서 볼 수 있듯이, 물(양성 대조군)에서 적혈구 용혈을 관찰했습니다. 반면, 0~200μg/mL의 다양한 농도에서 2시간 동안 HA-Gd2O3 NP 배양 후 명백한 용혈은 관찰되지 않았으며, 이는 PBS 용액(음성 대조군)과 유사한 결과였습니다. 음성 대조군과 비교하여, 541nm에서 상등액 흡광도 기반으로 다양한 농도의 HA-Gd2O3 NPs 용혈 비율을 약간 평가했습니다. 결과는 연구된 농도에서 HA-Gd2O3 NPs의 용혈 비율이 모두 3% 미만임을 보여주어 우수한 혈액적합성을 검증했습니다. 잠재적 독성을 조사하기 위해 HA-Gd2O3 NPs를 Balb/c 쥐에 정맥 주사했습니다(S. 그림 2 참조). 1주일 후 이 쥐들을 안락사시키고 방광, 신장, 비장을 수확하여 병리 절편 분석을 수행했습니다. S. 그림 2에서 볼 수 있듯이, 병리 절편 결과는 HA-Gd2O3 NP 처리 쥐의 장기에서 관찰 가능한 병변이나 염증 반응이 없음을 보여주었습니다. 이러한 결과들은 합성된 HA-Gd2O3 NPs가 우수한 세포적합성과 양호한 혈액적합성을 가짐을 명확히 나타냈습니다.
a CCK-8 분석을 사용한 HA-Gd2O3 NPs의 HepG2 및 VSMC 세포 생존율 영향. b 다양한 농도(50, 100, 200, 300, 400μg/mL)에서 HA-Gd2O3 NPs의 용혈 활성. PBS와 물은 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용
HA-Gd2O3 NPs의 종방향(T1) 이완 시간은 상용 조영제 마그네비스트(Gd-DTPA)를 대조군으로 사용하여 인산염 완충 식염수(pH=7.4, 0.2M)와 함께 in vitro에서 조사했습니다. Gd 농도 증가에 따라 T1-가중 팬텀 이미지의 신호 강도가 명확히 증가하여, 모든 샘플이 T1-가중 시퀀스에서 MRI 조영 증강을 생성할 수 있음을 나타냈습니다(그림 4a). 또한 신호 강도 대 반전 시간 플롯으로 각 조영제의 특정 농도에서 T1-이완 시간을 얻었습니다. 그림 4b에서 볼 수 있듯이, HA-Gd2O3 NPs의 r1 값은 동일한 조건에서 마그네비스트(3.86 mM−1S−1)보다 유의미하게 높은 6.0 mM−1S−1로 측정되었습니다. 향상된 r1은 HA-Gd2O3 NPs의 훨씬 더 큰 수동 반경과 표면적에 기인할 수 있으며, 따라서 NP 격자에 도핑된 더 많은 Gd 원자가 물 분자에 접근 가능해져 종방향 이완을 단축시키고 r1 값을 향상시킵니다.
a 총 Gd 이온의 다양한 농도에서 HA-Gd2O3 NPs의 T1 팬텀 이미지. b 총 Gd 이온 농도에 대한 1/T1 플롯. c HA-Gd2O3 NPs를 조영제로 정맥 주사한 후 마우스의 체내 T1 MR 영상 및 분석. d 투여 후 다양한 시점에서 방광과 신장의 신호 변화(SNR 비율) 정량화 (n=3). *p < 0.05
체내 잠재적 응용을 결정하기 위해, 정상 BALB/c 쥐를 모델로 사용하여 MRI 스캐너로 HA-Gd2O3 NPs(10mg/kg)의 MR 영상 성능과 순환 운명을 조사했습니다. 주사 전 이미지(그림 4c)와 비교하여, 점선 원으로 표시된 신장과 방광의 더 밝은 영역이 주사 후 10분에 명확히 관찰되어, HA-Gd2O3 NPs가 체내에서 이 주요 장기에서 T1 이완을 향상시키는 CAs로 사용될 수 있음을 입증했습니다. 중요하게도, HA-Gd2O3 NPs의 조영 증강은 주사 후 60분까지 유지되었으며, 이는 소동물에서 수분의 반감기를 가진 Gd 복합체 소분자[27]보다 훨씬 길어, HA-Gd2O3 NPs가 상용 조영제보다 체내에서 더 긴 잔류 시간을 가짐을 나타냅니다. MR 조영 효과를 정량적으로 분석하기 위해, MRI 영상의 관심 영역을 세밀하게 분석하여 신호대잡음비(SNR)를 계산하고, SNRpost/SNRpre 값을 계산하여 상대적 신호 증강(RSE)을 나타냈습니다(그림 4d). 신장에서 HA-Gd2O3 NPs의 RSE 값은 1.35, 1.99, 1.86이었습니다. 유사하게, 방광에서의 RSE 값은 신장보다 더 높았습니다(1.29, 3.59, 2.26). 큰 크기(100nm 이상)의 HA-Gd2O3 NPs는 긴 순환 시간을 보였으며, 이전 결과에 따라 담도-장 경로로 배설될 수 있습니다[32]. 또한 체내 연장된 순환 시간은 EPR 효과를 강화하여 종양에서 수동적 표적화 효율을 증가시켰을 수 있습니다.
우수한 MR 영상 성능과 긴 순환 시간을 가진 HA-Gd2O3 NPs는 EPR 효과를 통한 종양 영상화에 큰 기회를 제공합니다. 따라서 피하 간종양 모델을 구축하여 간세포암(HCC)이 HA-Gd2O3 NP 강화 MRI로 검출될 수 있는지 조사했습니다. HA-Gd2O3 NPs 정맥 주사 후, 관상 및 횡단 스캔 모두에서 피하 종양 영역이 주변 조직보다 더 밝아지는 것을 관찰했습니다(그림 5a). 횡단 및 관상 스캔으로 피하 종양의 RSE가 각각 1.54와 1.83으로 극적으로 도달하여, EPR 효과를 통한 HA-Gd2O3 NPs의 종양 영역 내 효과적 축적을 나타냈습니다. 이러한 발견은 HA-Gd2O3 NPs가 종양의 MRI 가시화에 고감도임을 입증합니다. 많은 연구에서 긴 순환 시간이 고형 종양의 누출 혈관을 통한 수동적 표적화 효율을 촉진할 수 있음을 보였습니다[33].
HA-Gd2O3 NPs 정맥 주사 후 Heps 마우스 간암 이종이식 종양의 T1-가중 MR 영상(a) 및 해당 정량 분석(b)
HA-Gd2O3 NPs의 우수한 T1 조영제 성능은 종양의 방사선 감수성 증진에서 그 위치를 정확히 결정하도록 촉구했습니다. 먼저, CCK-8 분석을 사용하여 이 병용 치료로 선량 증강이 발생하는지 탐구했습니다. 그림 6a에 도시된 바와 같이, 단독 HA-Gd2O3 NPs(농도 0-200μg/mL)는 HepG-2 생존율에 유의미한 영향을 미치지 않았지만, X선 조사(범위 0-9Gy)는 9Gy에서 HepG-2 세포 생존율을 70% 미만으로 감소시켰습니다. 중요하게도, X선 조사와 HA-Gd2O3 NPs 병용은 특히 9Gy에서 200μg/mL 농도일 때 HepG-2 세포 생존율을 50% 미만으로 극적으로 감소시켰습니다. 다음으로, 클로노제닉 분석을 수행하여 X선 조사와 HA-Gd2O3 NPs 병용 후 HepG-2 세포 생존율을 평가했습니다. 그림 6b에서 볼 수 있듯이, 단독 HA-Gd2O3 NPs는 HepG-2 세포 집락 형성에 극적인 영향을 미치지 않았지만, X선 조사는 HepG-2 세포 집락 형성을 46.7%로 감소시켰습니다. 그러나 X선 조사와 HA-Gd2O3 NPs 치료는 세포 집락 형성 생존율을 29.8%로 현저히 억제했습니다. 해당 이미지는 HA-Gd2O3 NPs의 HepG-2 세포에 대한 방사선 감수성 증진을 추가로 검증했습니다.
HA-Gd2O3 NPs의 체외 방사선 감수성 효과. a HA-Gd2O3 NPs(0, 12.5, 25, 50, 100, 200μg/mL)와 X선 조사(0, 3, 6, 9Gy)의 시너지 효과가 HepG2 세포 생존율에 미치는 영향(CCK-8 분석). *p < 0.05, **p < 0.01, 통계적으로 유의미한 차이. b HA-Gd2O3 NPs와 X선 조사로 처리된 HepG2 세포의 집락 생존 분석 및 c 해당 클로노제닉 능력 정량 분석. d 다양한 치료 후 다른 그룹 마우스의 종양 부피 성장 곡선. 그룹: a 대조군, b 조사, c HA-Gd2O3 NPs, d 조사 + HA-Gd2O3 NPs. e 치료 종료 시 다른 그룹 마우스에서 수집한 종양 사진
체외 방사선 치료의 효과는 HA-Gd2O3 NPs를 조사와 병용하여 종양 보유 쥐에서 종양 성장을 제어하도록 고무했습니다. 대조군과 단독 HA-Gd2O3 NP 치료군의 종양 부피는 급속히 성장하여 둘 다 180% 증가했습니다. 단독 조사 치료 58%와 비교하여, HA-Gd2O3 NPs와 방사선 병용은 10일 조사 후 38%의 효율적인 종양 억제를 보였습니다(그림 6d). 종양을 촬영했으며, 각 그룹의 평균 종양 부피에서 그룹 (a)가 가장 높고 그룹 (d)가 모든 그룹 중 가장 낮았습니다(그림 6e). 이러한 결과는 제조된 HA-Gd2O3 NPs가 X선 조사 하 종양 성장 억제에 유망함을 드러냅니다.
유세포 분석과 라이브/데드 염색 분석을 수행하여 HA-Gd2O3 NPs와 X선 조사의 병용 치료에서 방사선 감수성 메커니즘을 추가로 이해했습니다. 그림 7a에서 볼 수 있듯이, 단독 HA-Gd2O3 NPs로 처리된 HepG-2 세포에서 적색 형광 없는 강렬한 녹색 형광이 관찰되어 높은 세포 생존율을 검증했습니다. X선 조사 처리 후 소량의 적색 형광이 관찰되어 낮은 수준의 세포자멸사를 나타냈습니다. 그러나 HA-Gd2O3 NPs(200μg/mL)와 방사선 병용 처리 후 강한 적색 형광이 관찰되어, HA-Gd2O3 NPs가 X선 조사 유도 세포자멸사를 극적으로 향상시킬 수 있음을 입증했습니다. HA-Gd2O3 NPs의 방사선 감수성 메커니즘은 유세포 분석으로 추가 조사했습니다. 그림 7b에 도시된 바와 같이, 단독 조사와 HA-Gd2O3 NPs는 각각 27.55%와 19.12%의 G2/M기 정지를 유도했습니다. 그러나 HA-Gd2O3 NPs와 방사선 병용 처리는 G2/M기 정지를 30.89~33.27%로 농도 의존적으로 현저히 증가시켰습니다. 한편, 단독 HA-Gd2O3 NPs와 조사가 각각 3.02%와 13.87%를 유도한 반면, 병용 처리는 sub-G1 비율로 반영된 세포자멸사 세포 사멸을 10.63~22.67%로 유도했습니다. 가능한 세포 사멸 메커니즘을 추가 조사하기 위해 유세포 분석으로 Annexin V-EGFP/PI 법을 수행했습니다. Annexin V-EGFP 방출 신호는 x축에, PI 방출 신호는 y축에 플로팅했습니다(그림 8). 괴사 세포, 초기 세포자멸사 세포, 후기 세포자멸사 세포, 생존 세포의 양은 각각 Annexin V−/PI+(Q3), Annexin V+/PI+(Q2), Annexin V−/PI−(Q4) 비율로 결정했습니다. 대조군과 단독 HA-Gd2O3 NP(100μg/mL) 그룹의 세포 세포자멸사 비율은 5% 미만으로 미미한 영향을 보였습니다. 단독 조사 치료 그룹(8.8%)과 비교하여, HA-Gd2O3 NPs와 방사선 병용의 세포자멸사 비율은 농도 증가(50~200μg/mL)에 따라 증가했습니다. 특히 초기 세포자멸사 비율이 명백히 33.2%로 증가했으며, 초기 및 후기 세포자멸사가 200μg/mL 농도에서 44.3%에 도달했습니다. 일반적으로 HA-Gd2O3 NPs와 X선 조사의 병용은 세포 집락 형성, 농도 의존적 세포 생존율, 방사선 감수성 향상 효과에 시너지 효과를 가졌습니다. 이러한 결과를 바탕으로 HA-Gd2O3 NPs는 방사선 치료를 위한 방사선 감수성 향상의 효율적인 대안이 될 수 있습니다.
HA-Gd2O3 NPs의 방사선 선량 증강. a HepG2 세포 라이브-데드 염색. 녹색(플루오레세인 디아세테이트 염색) = 생존 세포, 적색(프로피디움 요오드 염색) = 사멸 세포. 스케일 바 = 200mm. b 유세포 분석 분석으로 DNA 함량 정량화 후 다양한 처리 후 세포 주기 분포
HA-Gd2O3 NPs의 세포자멸사 분석. a X선 조사 후 24시간 HepG-2 세포의 세포자멸사 수준. b 해당 정량 분석
결론적으로, 일괄 수열 공정으로 효과적인 MR 영상과 종양 방사선 감수성 증진을 위한 이중 기능 HA-Gd2O3 NPs를 개발했습니다. HA 코팅 후 합성된 HA-Gd2O3 NPs는 물에서 우수한 분산성과 생체적합성을 보였습니다. 결과적인 HA-Gd2O3 NPs는 Gd 원자를 캡슐화하여 T1 조영제로서 MRI를 위한 높은 종방향 완화율(r1)을 효과적으로 나타냈을 뿐만 아니라, 세포자멸사 유도와 세포 주기 차단을 통해 종양의 방사선 감수성을 향상시키는 방사선 감수성 증진제로서도 작용했습니다. 따라서 새로운 HA-Gd2O3 NPs는 종양 진단과 방사선 치료에 유망한 잠재력을 보입니다.
플루오레세인 디아세테이트(FDA)와 프로피디움 요오드(PI)는 Sigma(New York, NY, USA)에서 구입했습니다. GdCl3·6H2O, 에틸렌 글리콜(99%)은 Hengrui 제약 유한회사(Lianyungang, Jiangsu, 중국)에서 구입했습니다. 세포 계수 키트-8(CCK-8)은 Dojindo(Kumamoto, Japan)에서 구입했습니다. NaH2PO4, Na2HPO4, H2SO4는 Guangfu 정밀화학 연구소(Nankai, Tianjin, 중국)에서 얻었습니다. 태아 소 혈청과 Dulbecco's 최소 필수 배지(DMEM)는 Invitrogen 중국 유한회사(Shanghai, 중국)에서 구입했습니다. 모든 화학 물질은 분석 등급이었으며 추가 정제 없이 사용되었습니다.
HA-Gd2O3 NPs는 다음과 같은 일괄 수열 접근법으로 제조되었습니다: 먼저, 0.1g HA를 상온에서 하룻밤 동안 강력 교반하며 20mL 물에 용해했습니다. 이후 0.1g GdCl3·6H2O와 0.5mL NaOH(1M)를 각각 첨가했습니다. 그런 다음 혼합물을 5분간 더 교반하여 균일한 투명 용액을 형성하고 50mL 오토클레이브로 이송, 밀봉, 120°C에서 6시간 수열 처리했습니다. 자연적으로 실온으로 냉각된 후, 투명 현탁액을 0.22-μm 막으로 여과하여 큰 크기 응집체를 제거했습니다. 제조된 용액을 14-kDa 분자량 컷오프 투석 백에서 3일간 물에 대해 투석했습니다. 투석액을 수집하고 진공 동결 건조기로 동결 건조했습니다. 이렇게 얻은 HA-Gd2O3 NP 분말을 추가 특성화를 위해 보관했습니다.
HA-Gd2O3 NPs의 형태는 JEM-2100 현미경(JEOL, Tokyo, Japan)에서 200kV 가속 전압으로 고해상도 투과 전자 현미경으로 관찰했습니다. HA-Gd2O3 NPs의 원소 조성은 Al-Ka(1486.6eV)를 X선 소스로 사용하는 MK II 광전자 분광계에서의 XPS 측정과 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광계(Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, USA)로 결정했습니다. HA-Gd2O3 NPs의 결정 구조는 Cu Kα(λ=0.15405nm) 방사선을 장착한 Rigaku-D/MAX2500 회절계(Rigaku, Japan)에서 4°/min 스캔 속도로 5-80° 범위에서 X선 회절(XRD) 패턴으로 특성화했습니다.
HA-Gd2O3 NPs의 세포 생존율 영향은 세포 계수 키트 CCK-8 분석(CCK-8 분석)으로 연구했습니다. HepG2(인간 간암종, ATCC 번호: HB-8065)와 VSMC(혈관 평활근 세포)를 96웰 플레이트에 3×103 cells/well 밀도로 파종하고 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 다양한 농도의 HA-Gd2O3 NPs(0, 25, 50, 100, 200μg/mL)를 함유한 DMEM으로 배지를 교체했습니다. 추가 4시간 배양 후 각 웰에 10-μL CCK-8 용액을 첨가하고 어두운 곳에서 4시간 배양했습니다. Synergy HT 다중 모드 마이크로플레이트 리더(Bio Tek, Winooski, VT, USA)로 490nm에서 흡광도를 측정했습니다. 처리하지 않은 세포(DMEM 배지)를 대조군으로 사용했으며, 상대 세포 생존율(평균 SD, n=5)은 Abssample/Abscontrol × 100%로 표현했습니다.
간단히, 19-21g, 6주령 암컷 BALB/c 쥐를 중국 보건부 동물 관리 규칙에 따라 준비했습니다. 헤파린 나트륨으로 안정화된 3mL 혈액을 안구 적출로 얻었습니다. 그런 다음 문헌에 따라 1200rpm, 15분 원심분리하여 상등액을 제거했습니다. 이후 문헌에 따라 PBS로 5회 세척하여 마우스 적혈구(MRBCs)를 얻었습니다. PBS로 10배 희석 후, 0.1mL MRBCs를 0.9mL PBS(다양한 입자 농도 50-200μg/mL HA-Gd2O3 NPs 포함), 0.9mL 물(양성 대조군), 0.9mL PBS(음성 대조군)가 미리 채워진 1.5mL 튜브에 이송했습니다. 혼합물을 부드럽게 흔든 후 실온에서 2시간 배양한 다음, 12,000rpm으로 1분 원심분리했습니다. 마지막으로 모든 샘플 사진을 촬영하고 UV-2450 UV-Vis 분광광도계로 상등액(헤모글로빈) 흡광도를 541nm에서 측정했습니다. 샘플, 양성, 음성 대조군 간 흡광도 차이를 541nm에서 나누어 다양한 샘플의 용혈 비율을 계산했습니다.
In vitro 및 in vivo MR 영상은 3테슬라 MRI 스캐너(Magnetom Trio Tim, Siemens, 독일)에서 획득했습니다. In vitro T1 팬텀 이미지 연구를 위해, 0-16mM 범위의 다양한 농도 HA-Gd2O3 NP 용액을 96웰 배양 플레이트에 첨가했으며, 상용 MR 조영제 마그네비스트(Gd-DTPA)를 대조군으로 사용했습니다. In vivo MR 영상을 위해 정상 BALB/c 쥐를 모델로 선택했습니다(n=4). 동물 실험은 중국 보건부 동물 관리 규칙을 엄격히 준수했습니다. 멸균 막 필터(공극 크기 0.22μm)로 여과된 10mg/kg HA-Gd2O3 NPs를 동물에 정맥 주사하고 즉시 MRI 스캐너로 조사했습니다. 이 in vitro MR 영상 샘플과 in vivo 동물은 다음 매개변수로 영상화되었습니다: TR/TE = 300/10ms, 256×256 매트릭스, 슬라이스 = 5, 두께 = 2mm, 평균 = 2, FOV = 80×80.
CCK-8 분석을 사용하여 HA-Gd2O3 NPs의 체외 방사선 감수성 활성을 평가했습니다. 세포를 3×103 cells/well 밀도로 다섯 96웰 플레이트에 파종하고, 각 플레이트를 동일 조건으로 처리했습니다: 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양 후, 다양한 농도 HA-Gd2O3 NPs(0, 12.5, 25, 50, 100, 200μg/mL)를 함유한 DMEM으로 배지 교체. 4시간 배양 후 다섯 플레이트를 각각 다른 X선 선량(0, 3, 6, 9Gy), 300cGy/min으로 조사했습니다. 조사 후 모든 플레이트를 4시간 배양한 후 동일한 매개변수로 흡광도 측정했습니다.
클로노제닉 생존 분석도 체외 방사선 감수성 효과 연구를 위해 수행했습니다. HepG2 세포를 4.0×104 cells/well로 6웰 플레이트에 파종하고 16시간 성장시켰습니다. 세포를 세포 배양 배지에 희석된 HA-Gd2O3 NPs로 6시간 배양했습니다. 세포를 임상용 선형 가속기(Oncor, Siemens, 독일)로 6Gy 조사했으며, 6MeV 조사, 10cm×10cm 방사선 필드, 소스-피부 거리(SSD) 100cm로 전체 세포를 커버했습니다. 이후 조사된 세포를 14일간 성장시키고, 4% 파라포름알데히드로 실온에서 40분 고정, 세척 후 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색했습니다.
HA-Gd2O3 NPs의 방사선 감수성 효과 연구를 위해, HepG2 세포를 4.0×104 cells/well 밀도로 6웰 플레이트에 파종하고 12시간 성장시킨 후 6그룹 설정(대조군, HA-Gd2O3 NPs, 조사, 조사+50μg/mL HA-Gd2O3 NPs, 조사+100μg/mL HA-Gd2O3 NPs, 조사+200μg/mL HA-Gd2O3 NPs). 플레이트에서 세포가 80% 자랐을 때, 첫 그룹은 무처리, 두 번째 그룹은 100μg/mL HA-Gd2O3 NPs로 24시간 배양, 세 번째 그룹은 조사만, 네 번째에서 여섯 번째 그룹은 조사 후 다른 농도 HA-Gd2O3 NPs(50, 100, 200μg/mL)로 24시간 배양. 이후 FDA와 PI 작업 버퍼를 첨가하여 세포 염색. 형광 현미경(×20)으로 염색 세포 형광 관찰, 생존 세포는 녹색, 사멸 세포는 적색. 또한 다양한 처리로 세포를 PBS로 3회 세척, 소화, 수집, 2000rpm 5분 원심분리, -20°C에서 70% 에탄올로 하룻밤 고정 후 PI 염색. PI 형광 강도로 DNA 단편화를 유세포 분석기(BD, Accuri, C6)로 정량화, 소프트웨어(FLOWJO 7.6.2)로 분석하여 세포 주기 분포 명확화.
양저우 대학 실험동물 센터에서 표준 조건 하에 19-21g 체중, 6주령 암컷 BALB/c 쥐를 얻었습니다. 동물 실험은 중국 보건부 동물 관리 규칙을 준수했습니다. 피하 종양 모델을 다음 절차로 확립했습니다: 먼저, 1×106 HepS 세포를 쥐 복강 내 접종, 5일 후 복수 수집. 이 복수를 피하 주입. 종양 크기가 약 100mm3에 도달하면 피하 종양 모델이 확립되어 후속 실험에 적용했습니다.
그룹당 피하 종양 보유 쥐 8마리를 3Gy/분획으로 7일 내 총 9Gy 조사했습니다. 방사선 치료는 지멘스 프라이머스 임상용 선형 가속기(6MeV)에서 자가 제작 장치로 전체 종양 커버하여 수행했습니다. 이 쥐들을 1% 펜토바르비탈(50mg/kg)로 마취하여 조사 중 부동 보장. 부피를 매일 측정 기록, 캘리퍼 측정으로 결정, 공식 V = 0.5 × a × b2로 계산, 여기서 V(mm3)는 종양 부피, a(mm)와 b(mm)는 종양 길이와 너비. 상대 종양 부피는 초기 크기로 정규화. 각 그룹 8마리씩 수행, 통계 분석은 학생 양측 t-검정 사용(*p < 0.05, **p < 0.001).
이 논문 결과를 뒷받침하는 데이터 세트는 논문 내에 포함되어 있습니다.
나노물질
초록 산화아연 나노입자(ZnO NP)는 산업, 상업 제품, 의료 분야 등 광범위한 응용에 사용된다. 수많은 메커니즘 연구가 프리스틴(신선한) NP의 독성에 대해 수행되었으나, 변형된(노화된) ZnO NP에 의한 세포독성과 기저 메커니즘은 불분명하다. 여기서 우리는 ZnO NP의 물리화학적 변환을 시간에 따라 관찰한 후 신선한 NP와 노화된 NP의 세포독성을 평가했다. 신선한 ZnO NP가 노화된 것보다 더 높은 아폽토시스 수준을 유도함을 발견했다. 이에 따라 노화된 ZnO NP 처리된 인간-햄스터 하이브리드(AL) 세포의 RNA 시
요약 고열요법은 비침습적, 최소한의 부작용 및 독성, 쉬운 구현으로 암 치료에 가장 환자 친화적인 방법 중 하나이며, 광열학적 약물 전달 시스템 같은 새로운 치료법 개발을 촉진했습니다. 본 연구는 Cs0.33WO3 나노입자(NPs)의 광열 효과 변수인 조사 지속시간, 광 파워 밀도, NP 농도가 HepG2 간암 세포주에 미치는 영향을 in vitro에서 조사해 근적외선(NIR) 조사 열선량을 도출했습니다. 구체적으로, 입자 크기 120nm의 NPs를 일련의 산화-환원(REDOX) 반응, 열 어닐링, 습식 분쇄 공정으로 합성했으며,
