향상된 약물 전달을 위한 후두암 세포 및 면역 세포 내 고분자 나노입자의 세포 내재화에 대한 정량적 평가

결과 및 토론

폴리(락트산-코-글리콜산) 입자의 특성

PLGA 입자의 형광 현미경 사진(그림 1a,b,c)은 강력한 형광 강도를 나타내었고 준비 후 14일 동안 형광 신호의 현저한 감소가 없었으며(추가 파일 1:S1), 이는 상대적으로 균일한 크기 분포와 높은 형광성을 나타냅니다. 안정. 공급업체가 명시한 바와 같이 100, 500, 1000nm PLGA 입자는 각각 약 80.6 ± 19.3nm, 542.6 ± 128.3nm, 951.9 ± 237.5nm의 크기를 나타냈습니다. 제타 전위 측정에 따르면 입자의 평균 표면 전하는 0.057, 0.056, 0.0에 대해 0.057, 0.056, 0.0에 대해 0.057, 0.056 및 5의 다분산 지수에서 -20.6 ± 5.3, -17 ± 4.6 및 -16.5 ± 3.5인 것으로 나타났습니다. nm 입자는 각각 높은 단분산 표준을 나타냅니다. 모든 입자를 볼텍싱한 다음 수조에서 5분 동안 초음파 처리하여 입자 응집을 크게 제거했습니다. 그러나 100 및 1000 nm 입자에 해당하는 작은 피크가 직경 약 4-6 µm로 관찰되었는데, 이는 매우 소량(약 3-4%)의 불가피한 입자 응집으로 인해 발생하기 때문입니다.

PLGA 입자의 특성화. 형광 현미경 사진은 다양한 크기를 보여줍니다(a 100nm, b 500nm 및 c 1µm)의 PLGA 입자. 이러한 입자는 물 현탁액에서 상대적으로 균일한 입자 크기 분포를 나타내는 Olympus 광학 현미경으로 검출할 수 있습니다. 동적 광산란(DLS) 측정은 100nm(d ), 500(e ), 1μm(f ) PLGA 입자. 100nm 및 1µm PLGA 현탁액에서 입자 응집의 작은 부분(더 작은 피크:3-4%)에도 불구하고 좁은 주 피크로 인해 전체 입자 크기 분포가 상당히 균일합니다.

세포 생존율 및 세포독성 평가

뛰어난 생체 적합성과 생분해성으로 인해 PLGA 입자는 FDA와 유럽 의학청에서 생물 의학 응용 분야에 대한 승인을 받았습니다[27, 28]. 따라서 PLGA 입자는 현재 임상에서 사용되어 왔으며 특정 질병 부위 또는 종양에 약물을 전달하는 나노운반체로서 전임상 연구에 널리 적용됩니다. 그러나, PLGA 입자의 표적화 효율 및 치료 효능은 면역계에 의해 적어도 부분적으로 방해를 받습니다. 예를 들어, 간에서 Kupffer 세포에 의한 높은 입자 식균 작용은 나노 약물 운반체가 종양 부위에 들어가는 것을 크게 제한했습니다[15]. 따라서, 약물 전달의 생체 내 상황을 더 잘 모방하기 위해 암세포, 면역 세포 및 입자 간의 상호 작용을 연구하기 위해 고급 시험관내 모델을 확립하는 것이 매우 중요합니다. UM-SCC-17A는 원발성 후두암 표본에서 분리한 독특한 후두 편평상피암 세포주입니다[29]. 그러나 공동 배양 시스템(예: , 대식세포와 암세포의 동시 배양)은 여전히 ​​불충분하며, 생체 내 반응의 예측 능력을 향상시키기 위해 해결해야 하는 문제입니다. 또한, 입자 크기와 표면 코팅이 동물 모델 및 세포 배양에서 고형 종양, 질병 부위 및 암세포로의 전달 능력에 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었습니다[30,31,32,33]. 여기에서 우리는 단일 배양 및 공동 배양 시스템에서 세포 흡수 및 세포 내 분포에 대한 입자 크기의 영향을 조사하기 위해 UM-SCC-17A 암종 세포에 3가지 크기의 PLGA를 적용했습니다.

이 연구는 단일 배양 THP-1에 대한 WST-1(4-[3-(4-요오도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠 디설포네이트) 방법을 사용하여 세포 생존율을 결정했습니다. 및 UM-SCC-17A 세포, 뿐만 아니라 두 유형의 세포의 공동 배양. 테스트된 모든 농도에서 100 및 500nm PLGA로 처리한 그룹에서 명백한 세포 사멸이 발생하지 않았음에도 불구하고 최고 농도(20µg/mL)에서 500nm 및 1µm PLGA 입자는 단일 배양 UM-SCC-17A에서 세포 생존력을 유의하게 감소시켰습니다. 세포(그림 2a). 예상대로 THP-1 세포 생존율은 5–20µg/mL 농도에서 세 가지 유형의 PLGA와 함께 24시간 배양 후 크게 영향을 받지 않았습니다(생존율이 100%로 간주되는 처리되지 않은 세포와 비교하여 ≥ 95% 생존율). , 그림 2b). 단일 배양 UM-SCC-17A 세포의 결과와 동일하게, 공동 배양 시스템의 세포 생존율은 여기에 사용된 3가지 용량의 100 및 500nm PLGA 입자의 존재에 의해 변경되지 않은 반면, 20개를 처리한 그룹에서는 유의하게 감소했습니다. µg/mL 1 µm PLGA(그림 2c).

WST 분석을 활용하여 단일 배양 및 공동 배양 세포에서 세포 생존 능력의 결정. UM-SCC-17A(a ) 및 THP-1 세포(b ) 및 공동 배양된 UM-SCC-17A 및 THP-1 세포(c ) 3가지 크기의 PLGA 입자를 다양한 농도(5~20µg/mL)로 처리했습니다.

LDH assay를 이용한 입자 세포독성 평가는 세포 외 LDH의 양을 측정하여 세포막의 누출 여부를 판단하는 것이다[9]. 이 세포질 효소의 세포 배양 상청액으로의 방출은 세포막 손상의 특징이며, 이는 돌이킬 수 없는 세포 사멸을 초래합니다. 다양한 용량의 1µm PLGA로 처리된 단일 배양 UM-SCC-17A 세포에서 더 높은 용량으로 LDH 수준이 약간 향상되었음에도 불구하고 20µg/mL의 최고 농도에서도 세포에 대한 뚜렷한 세포 독성은 관찰되지 않았습니다(그림 3a). . 여기에 다양한 용량으로 사용된 3가지 크기의 PLGA 모두 상청액으로 상당한 LDH 방출을 유도할 수 없었으며, 이는 단일 배양 THP-1 세포에 대한 독성 효과가 미미함을 나타내며, 이는 위에서 설명한 세포 생존율 결과와도 매우 일치합니다(그림 2a). . 3b). 공배양 실험에서 농도가 다른 모든 입자는 방출된 LDH 수준 측면에서 두 세포에 대해 우수한 생체적합성을 보였다(그림 3c). 일반적으로 여기에서 사용된 100nm에서 1μm의 넓은 입자 크기 범위는 리포솜, 미셀, 덴드리머, 폴리머 및 미니 셀과 같은 나노운반체(50~200nm)의 일반적인 크기를 포함합니다. 이 범위는 또한 서브미크론 크기의 입자를 포함합니다(500nm 입자는 여전히 NP로 간주될 수 있습니다. 예: 크기가 약 500nm인 입자는 10–100nm 및 마이크론 크기 1µm의 NP와 동일한 제거 경로를 폐에서 가지고 있습니다. 이러한 PLGA 입자 중 어느 것도 단일 배양 및 공동 배양 시스템에서 THP-1 및/또는 UM-SCC-17A 세포에 대해 명백한 세포독성을 나타내지 않았습니다. 단, UM-SCC-에 대한 최고 농도의 500 nm 및 1 µm PLGA 입자는 예외였습니다. 17A 및 공동 배양 세포(그러나 85% 이상의 세포가 생존함)는 약물 전달 시스템에 적용하기에 유리함을 나타냅니다.

LDH 분석을 사용하여 단일 배양 및 공동 배양 세포에 대한 세포독성 측정. UM-SCC-17A(a ) 및 THP-1 세포(b ) 및 공동 배양 세포(c )는 PLGA 입자로 처리되었습니다. 단일 배양 및 공동 배양 시스템 모두에서 입자(여기에 사용된 다양한 크기 및 농도 사용) 및 세포의 24시간 배양 후 유의미한 세포 사멸이 관찰되지 않았습니다.

단일 배양 및 공동 배양 시스템에서 PLGA의 세포 흡수 능력

그림 4는 단일 배양 및 공동 배양에서 세포 형태(그림 4a,d,g), 세포 핵 및 100nm NP(그림 4b,e,h) 및 병합된 확대 이미지(그림 4c,f,i)를 보여줍니다. 문화 시스템. 대조군의 미처리 세포에서는 입자가 관찰되지 않았다(추가 파일 1:S2). 거대하고 큰 크기의 100nm PLGA NP 응집체가 대식세포 단일 배양 세포의 세포질에서 관찰되었습니다(그림 4c). 한편, 단일 배양 UM-SCC-17A는 세포막 내부에서 관찰되는 밝은 녹색 형광 신호에 의해 입증된 100nm PLGA의 우수한 흡수 능력을 나타냈습니다(그림 4f). THP-1 또는 UM-SCC-17A 세포에서 PLGA 입자의 세포내 축적과 공동 배양에서 세포외 입자를 더 잘 설명하기 위해 명시야 이미지와 형광 이미지의 오버레이가 추가 파일 1:S3)에서와 같이 적용되었습니다. 공동 배양 시스템에서 두 세포 유형은 명시야 이미지에서 형태 및 세포 크기 측면에서 구별 가능하며, 대식 세포는 둥근 모양과 작은 크기를 나타내는 반면 암세포는 큰 크기와 길쭉한 모양을 나타냅니다. 그러나 암세포는 공동 배양 시스템에서 대식세포에 의한 100nm PLGA의 높은 흡수로 인해 불충분한 세포 섭취를 보였습니다. 이는 대식세포가 외부 미생물, 알레르겐 및 입자를 제거하는 식균작용 기능을 수행하는 효율적이고 특정한 유형의 면역 세포로 간주되기 때문으로 예상된다. 유사하게, 그림 5와 그림 6은 각각 단일 세포 또는 혼합 세포 배양에서 500nm 및 1μm PLGA 입자의 세포 흡수 능력에 대한 정성 분석을 보여줍니다. 여기에 사용된 10mg/mL 농도에서 서로 다른 크기의 PLGA 입자로 처리한 후 두 세포 형태가 모두 변경되지 않았다는 점은 주목할 만합니다(그림 4a,d,g, 그림 5a,d,g 및 그림 6a, d,g). 500nm 및 1µm PLGA 입자는 단독 THP-1 세포(그림 5b,c, 그림 6e,f)보다 단독 UM-SCC-17A 세포(그림 5e,f 및 그림 6e,f)에서 더 강한 형광 강도를 나타냈습니다. . 6b,c). 공동 배양 인큐베이션(그림 5h,i 및 그림 6h,i)에서 입자 형광 강도가 대식세포보다 낮은 것으로 밝혀진 암세포에서 명백한 신호 감소가 있습니다. 대식세포는 모든 유형의 입자를 빠르고 효과적으로 식세포하여 공동 배양 시스템에서 암세포가 충분한 입자를 섭취할 수 없습니다. 다양한 크기의 PLGA 입자에 대한 암세포의 흡수 능력에 대한 식균 작용의 영향을 정량화하기 위해 반정량적 광학 분석을 수행했습니다. 간단히 말해서, 입자 형광 강도는 예를 들어 50개의 개별 입자 함유 세포를 기반으로 계산되어 두 세포 유형에 대한 평균값을 달성하고 암세포의 흡수 지수는 암당 세포내 입자 형광 강도를 평균화하여 결정되었습니다. 대식세포의 세포로 정규화됨(그림 7). 단일 배양에서 100nm PLGA에 대한 암세포 흡수 지수는 약 1.34 ± 0.19로 밝혀졌으며, 이는 단일 세포 배양에서 암세포가 대식세포에 의해 섭취된 입자보다 더 많은 입자를 섭취했음을 시사합니다(그림 7). 이것은 PLGA 입자의 점도가 높고 후두암 세포의 크기가 더 크기 때문에 놀라운 일이 아닙니다. 유사하게, 500 nm 및 1 µm PLGA는 단일 배양에서 각각 약 1.5 ± 0.25 및 1.4 ± 0.31의 흡수 지수를 갖는 암세포에 의해 크게 내재화되었습니다. 큰 입자에 대한 흡수 지수는 공동 배양 시스템에서 대식세포의 존재하에 실질적으로 감소했습니다(0.59 ± 0.12 및 0.47 ± 0.1). 한편, 혼합 세포 배양에서 100nm PLGA 입자를 24시간 배양한 후 두 세포 유형에 대해 동일한 세포 내재화 기능이 나타납니다. Overall, the results accumulated here suggested that the ingestion of particles by cancer cells and macrophages might depend on different routes of uptake pathway in single-cell culture and co-culture environment. Moreover, the presence of macrophages reduced the cellular internalization of PLGA particles by cancer cells particularly for large ones, a biological event that has been observed in in vivo nanomedicine drug delivery studies [3, 15].

Microscopic examination of cellular internalization of 100 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 100 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , 지 ) and fluorescent channels (b, e, and h) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular uptake of 100 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , f , i ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A (red arrows). In the co-culture system, 100 nm PLGA nanoparticles were still highly ingested by macrophages but less efficient for cancer cells compared to single cultured cells

Microscopic examination of cellular internalization of 500 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-cultured cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 500 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , 지 ) and fluorescent channels (b , e , h ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular ingestion of 500 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , f , i ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A cells (red arrows). In the co-culture system, 500 nm PLGA nanoparticles were still highly uptake by macrophages, while cancer cells had inadequate particle internalization

Microscopic examination of cellular internalization of 1 µm PLGA particles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 1 µm PLGA particles for 24 h at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , 지 ) and fluorescent channels (b , e , h ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. A large amount of particle uptake and tremendous accumulation of 1 µm PLGA particles can be visualized in magnified images (c , f , i ) for monoculture THP-1 (yellow arrows) and UM-SCC-17A laryngeal cancer cells (red arrows). In the co-culture system, 1 µm PLGA particles were still efficiently uptake by macrophages, while cancer cells had insufficient particle ingestion

Quantitative analysis of PLGA particle internalization in UM-SCC-17A cells in monoculture and co-culture systems. The percentage of particle fluorescent intensity in UM-SCC-17A cells normalized to that in THP-1 cells for solely and mixed cultured cells

Quantification of cellular uptake by flow cytometry

Flow cytometry is widely used to determine of particle-cell interplay in a quantitative manner, for example, the size-dependent uptake of polystyrene particles with sizes ranging from 20 to 1000 nm by dendritic cells in vivo [35]. FACS was thus utilized for analysis of the percentage of NP-positive cells and particle number in those NP-positive cells in monoculture and co-culture systems. Then, average NP counts in a single cell were calculated by determining the total fluorescence intensity in particle-laden cells normalized to the fluorescence of total applied dose. For example, about 70% of 500 nm PLGA was deposited in the cancer cells, whereas the residual was kept in the supernatant of cell cultures (Additional file 1:S4). This fluorescence intensity measured by a Tecan reader was then compared to the average/total FACS signals (FITC signal values of P5 and P6 in Fig. 8,) to estimate the particle number in the co-culture system. As seeded in the co-cultured cells, about half of the cells were recognized as macrophages and the rest were considered as cancer cells. It was observed that approximately 13,000 of single 100 nm PLGA particles accumulated in cancer cells and 9700 particles in macrophages (Fig. 8i) in the monoculture, consistent with the above microscopic examinations. A much lower particle number (164 ± 30 and 45 ± 15) was ingested by monocultured cancer cells for 500 nm and 1 µm PLGA, with a slightly lower particle count in the respective macrophages (Fig. 8i). The number of particles ingested by single cells is in great agreement with the literature records [24]; for instance, an average 2500 of gold NPs coated with cetyltrimethylammonium bromide were deposited in epithelial cells, while PEG-modified gold NPs only had a few tens per cell [36]. In co-culture systems, unexpectedly, there is a slight increase of 100 nm particle number in cancer cells, despite a higher enhancement of NP internalization by macrophage. Comparing to the uptake index in the single-cell to mixed cell culture, it also reduces about 25% for 100 nm PLGA particles. The uptake indices were found to significantly decline with around 2.5 and 3 folds reduction in co-cultured system for 500 nm and 1 µm PLGA, respectively (Fig. 8i). Generally, it was found that the existence of macrophages largely affects the uptake ability of cancer cells especially for large particles, which is also in excellent agreement with the above observations.

Particle uptake quantification in monoculture UM-SCC-17A cells and co-culture with THP-1 cells by flow cytometry. Grating strategy to identify respective cell populations in mixed cell culture (a –h ). Gating is showing one representative experiment of cells exposure to 500 nm PLGA particles. With initial live gating in the y-axis with a side scatter (SSC-A) and x-axis with a forward scattering (FSC-A), P2 a were further gated with FSC-A versus APC-A to differentiate the THP-1 cells in P4 c from UM-SCC-17A cell population in P3 (monoculture cells (b ) and mixed cells (c )). The cell population of P3 further displayed as counts versus FITC plots (P5) in non-exposed cells (d ), monoculture cells (e ), and co-cultured cells (h ). Also, P6 is the counts versus FITC-A plot originated from P4 population in non-exposed cells (g ) and co-cultured cells (f ). Both types of cells efficiently ingested the 500 nm PLGA indicated by the solid histogram completed shifted to the right side of the x -axis, indicating particles are taken up by all exposed cells. Quantification of particle-laden numbers (i ) in both types of cells for mono-culture and co-culture systems

Currently, different uptake pathways by cancer cells in ingesting particles with different sizes and surface modifications like clathrin-mediated endocytosis, caveolae-mediated endocytosis, clathrin- and caveolae-independent endocytosis, micropinocytosis, and macropinocytosis have been claimed in the literature [37]. For instance, it has been proved that iron oxide aggregates with a size of < 200 nm are taken up by MCF-7 cells through the clathrin-mediated endocytosis, whereas larger aggregates tend to be ingested via macropinocytosis [38]. Another study has demonstrated that 100 nm plain polystyrene particles tended to be taken up mainly through macropinocytosis, whereas the internalization of carboxylated polystyrene particles prefer to occur via the clathrin-mediated endocytic route [25]. Phagocytosis is a classical uptake pathway for immune cells such as neutrophils, dendritic cells, and most importantly monocytes/macrophages. The uptake pathways tightly depend on various parameters of drug delivery vesicles, e.g. , the particle size, chemical composition, surface modification, proteins in the culture environment, as well as cell type. Usually, multiple uptake pathways can be involved in particle ingestion such as the caveolae-mediated endocytosis, clathrin-mediated endocytosis, and macropinocytosis, which has been found to participate in cellular internalization of 300–400 nm chitosan NPs in human HeLa cells [39]. It has also been observed that 63 nm cholesterol-modified pullulan NPs enter into the human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells via macropinocytosis and clathrin-mediated endocytosis [40]. Several previous studies showed that PLGA particle cell uptake involves different endocytic pathways, in which clathrin-independent endocytosis is the main route responsible for the internalization of PLGA in in vitro models [23, 24, 37]. Nevertheless, once they entered into the cells, PLGA particles applied here were highly potentially entrapped by the endo-lysosomal system consisting of early endosomes, recycling endosomes, late endosomes, and lysosomes [41]. It should be noted, however, that there is a lack of studies showing the cellular uptake mechanisms in co- or tri-cultured systems in vitro, a notion that has to be probe in the future.

Induction of cell fusion by PLGA NPs

Extensive scientific evidence has shown that the fusion of monocytes/macrophages into multinucleated giant cells (MGCs) occurred in a broad range of biological processes [42, 43]. Generally, implantation of biomaterials into the body causes a foreign body response characterized by the fusion of macrophages into MGCs and fibrotic encapsulation [44]. A wide type of human and murine primary cells like alveolar macrophages, splenic macrophages, microglia, bone-marrow-derived macrophages, and blood monocytes, as well as cell lines such as RAW264.7 and UG3 were also frequently observed to form MGCs in vitro [26, 45]. It is well-known that the macrophages form a fusogenic phenotype when they are unable to ingest foreign materials via phagocytosis because of the large size of particles or implants. So far, it is unclear whether in vitro macrophage cell fusion relates to the particle size in the range 100–1000 nm, which can be easily phagocytized. Here, the cell fusions were observed in all groups by microscopic examination (Fig. 9). The cellular fusion was confirmed only when multiple nuclei were found to share the same cytoplasm in both fluorescence images and bright-field images. Spontaneous formation of giant cells by THP-1 cells was occurred in the control group without particle treatment (Fig. 9a), with a fusion percentage of about 10% of the total cells (Fig. 9h), as reported in the literature [46]. Size-dependent cellular fusion was found for 100 and 500 nm PLGA particles, whereas 1 µm PLGA-induced insignificant enhancement of fusions in monoculture. This may be due to the small number of 1 µm PLGA particles exposed to cells (approximately 60 particles exposed to each cell at a concentration of 10 µg/mL). When the macrophages were co-cultured with cancer cells, the percentages of MGC formation were increased in all groups in comparison with the corresponding monoculture groups. In particular, there is a significant increment of cellular fusion for 1 µm PLGA (19%) in the mixed cell culture. The most prominent increase in fusion occurred in co-cultured 500 nm PLGA particles, which might be attributed to the large size of particles and sufficient particle numbers ingested per cell.

Visualization and quantification of THP-1 cell fusion in monoculture and co-culture systems. Cell fusion occurred in all groups including the control group without particle treatment for THP-1 cells (a ). Monocultured (b , ㄷ ) 100 nm and 500 nm NP-induced significant cell fusion compared to 1 µm PLGA group (d ), which has a slightly higher level than that of the control group. In co-cultured systems, 100 nm (g ) and 1 µm (e ) PLGA had an identical percentage of cellular fusion, which is apparently smaller than that of 500 nm group (f ). Quantification of cell fusion for all groups after 24 h incubation was displayed in h

The molecular machinery involved in macrophage fusion has been widely probed, achieving substantial progress [43]. For example, the formation of macrophage fusion receptors CD47and CD44 together allowed mediating the process of macrophage fusion, and subsequent the differentiation of giant cells [42] and miR-223 delivery by a NP vesicle permitted attenuating it [47]. Hence, further study should focus on the determination of key molecules in regulating particle-induced macrophage fusion and the dominant receptors expressed in the giant cell membrane. Another important concern is the fate of MGCs. It is believed that MGCs fused with particles or stimuli might subsequently experience the process of apoptosis or necrosis [48]. This may lead to the release of undigested particles or other giant materials to the other cells in vitro or biological tissues in vivo, further inducing the long-term inflammatory response or granulomas. On the other hand, the macrophage fusion itself may be benefit for NP drug delivery, for example, in tumorous tissues, the re-release of drugs from macrophages to the cancer cells might represent an enhanced tumor killing ability. More importantly, future nanomedicine study should address how to exploit the application of macrophage fusion for nanocarrier drug delivery to improved disease diagnosis and therapy. This is because not only macrophages an abundant type of immune cells in the body with the excellent uptake ability of nano-drugs, but also they may be used in targeted gene delivery for repair of injured tissues.