표면 개질된 고체 상태 나노포어를 통한 과산화수소 검출 향상

초록

분자 검출에는 많은 기술이 있지만, 용액 내 고체 상태 나노포어를 통한 검출은 오늘날 유망한 고처리량, 저비용 기술 중 하나이다. 본 연구에서는 과산화수소(H₂O₂) 검출을 위한 고체 상태 나노포어 플랫폼을 제작하였다. H₂O₂는 라벨 프리 생성물일 뿐만 아니라 산화환원 반응의 중요한 참여자이다. 초점 Ga 이온 빔을 사용하여 지름 ~50 nm의 실리콘 나이트라이드(Si₃N₄) 나노포어를 성공적으로 제작하였고, 나노포어 내면을 카르보디이미드 커플링 화학으로 과산화물분해효소(HRP)로 개질하였다. 고정화된 HRP 효소는 단일 나노포어 채널 내에서 산화환원 반응을 유도할 수 있다. 또한 실시간 단일 응집 ABTS^•+ 분자 이동 이벤트를 모니터링하고 조사하였다. 설계된 고체 상태 나노포어 바이오센서는 가역적이며 H₂O₂를 다중 검출에 적용할 수 있다.

배경

나노포어 검출 기술은 쿨터 카운터와 세포 이온 채널에서 유래하였다. 나노포어는 용액 내 존재하는 하전 분자가 통과할 때 검출한다. 나노포어 내 분자 출현은 포어의 전도도를 명백히 변화시켜 전류 신호의 변화를 초래한다. 전류 변화는 포어 내 분자의 크기와 농도 정보를 제공하여 분자 이동 동역학 과정을 밝힌다. 나노입자, 바이러스, 단백질 분자, DNA 서열 등 다양한 나노스케일 물체를 나노포어로 검출할 수 있다. 나노포어는 생물학적 나노포어와 고체 상태 나노포어로 나뉜다. 생물학적 나노포어는 신호대잡음비(SNR)가 낮고 분해능이 높으며, 작고 접히지 않은 단백질 검출에 적합하다. 고체 상태 나노포어는 크기 조절 가능하고 안정성이 높다. 고체 상태 나노포어는 일반적으로 박막에 드릴링되어 유체 셀을 두 부분으로 나눈다. 나노포어를 포함한 얇은 막에 바이어스 전압을 인가하면 한 셀에서 다른 셀로 이온 전류가 흐른다. 접힘 및 비접힘 구조를 포함한 단백질 분자를 고체 상태 나노포어로 검출 및 분석할 수 있다. 단백질 간 상호작용과 단백질 동역학 검출도 가능하다. 검출 범위 한계를 해결하기 위해 화학적으로 개질된 고체 상태 나노포어가 광범위하게 적용되어 왔으며, 단일 가닥 DNA와 단백질 검출에 활용되었다.

H₂O₂ 검출을 위한 많은 정량적 방법이 이미 적용되어 왔으며, 대부분 분광법, 화학발광, 전류측정법, 전기화학 기반이다. 기존 분광법과 화학발광법은 일반적으로 시간과 비용이 많이 든다. 고체 상태 나노포어 센서는 소모가 적고 구조가 간단하며 작은 분자 검출에 활용할 수 있다.

여기서 우리는 과산화물분해효소(HRP)로 개질된 고체 상태 나노포어 유형을 제시한다. HRP가 고체 상태 나노포어 내면에 고정화되었으며, H₂O₂ 존재 하에서 단일 나노포어 채널 내부에서 발생하는 산화환원 반응에서 고정화된 HRP가 활성을 유지한다. 산화환원 반응에서 생성된 ABTS^•+가 응집된 후, 응집된 ABTS^•+가 나노포어를 통과한다. 이동 이벤트를 검출할 수 있다. 과산화수소 검출을 위해 고체 상태 구조는 간단하며, 낮은 시약 소모로 응집된 ABTS^•+를 검출할 수 있다. 이 HRP 효소 개질 고체 상태 나노포어는 응집된 ABTS^•+ 검출을 통해 과산화수소(H₂O₂)를 간접적으로 센싱할 수 있다. 이는 단일 분자 검출과 고체 상태 나노포어 내 분자 조립에 의의를 가진다.

방법

화학물질 및 재료

과산화물분해효소(HRP) 분자(1 mg/mL, EC No.1.11.1.7, 44 kDa)를 Xiya Reagent(중국 청두)에서 구입하였다. 시료(HRP)를 0.02 µm 여과된 0.1 M PBS에 용해하고 4°C에서 보관하며 제조 후 2일 이내에 사용하였다. 염화칼륨(KCl), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드(EDC), N-하이드록시석시나마이드(NHS), 2,2'-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS, 98%)를 DiBo 화학기술(중국 상하이)에서 구입하였다. 과산화수소(H₂O₂, 30%)는 Sinopharm 화학시약에서 구입하였다. (3-아미노프로필)트리에톡시실란(3-APTES)은 Sigma-Aldrich(미국 세인트루이스)에서 구입하였다. 실험은 Milli-Q 정수 시스템(저항률 18.2 MΩ/cm, 25°C, Millipore Corporation, 미국 빌레리카)에서 얻은 초순수를 사용하였으며, 0.02 µm 여과 후 FEI Strata 201 FIB 시스템(FEI Co., 미국 힐스보로), 제타사이저(Malvern Zetasizer Nano ZS), Axopatch 700B(Molecular Devices, Inc., 미국 서니베일)에서 수행하였다. 사용 기기 사진은 보충 자료(추가 파일 1: 그림 S1)에 추가하였다.

고체 상태 나노포어 제작 및 전기적 측정

먼저 300 µm 두께의 Si 기판 위에 100 nm 두께의 Si₃N₄ 얇은 막을 증착하였다. 이어서 포토리소그래피(개방 창 크기 500×500 µm²)를 수행하였다. 그런 다음 막 표면을 FEI Strata 201 FIB 시스템(FEI Co., 미국 힐스보로)에서 가속 전위 30 kV로 Ga⁺ 이온으로 폭격하였으며, 전류는 1 pA로 측정되었다. 밀링 시간은 스팟 모드에서 1.5초였다. 마지막으로 고체 상태 나노포어 칩을 얻고, 80°C에서 30분간 신선한 피라냐 용액으로 세척한 후 초순수로 헹구었다. 세척 후 칩을 맞춤형 테플론 셀에 두 개의 Viton O-링으로 조립하여 칩의 양면을 분리하고, 이온 전류가 나노포어를 통해서만 흐르도록 두 개의 저수조를 형성하였다. 사용 장치 사진은 보충 자료(추가 파일 1: 그림 S2)에 추가하였다. 전극(Ag/AgCl)을 유체 셀과 패치 클램프 앰프(Axopatch 700B, Molecular Devices, Inc., 미국 서니베일)에 연결하여 일정 전압에서 이온 전류를 측정 가능하게 하였으며, 신호에 대해 100 kHz 샘플링 속도를 사용하였다. 앰프 내부 8극 베셀 로우패스 필터를 10 kHz로 설정하였다. 전체 장치를 이중 패러데이 케이지 인클로저에 배치하였다.

결과 및 논의

나노포어에 HRP 고정화

지름 ~50 nm의 선택된 나노포어를 80°C에서 30분간 피라냐 용액에 담갔다. 피라냐 용액 처리 후 나노포어 내면은 실리콘 하이드록실 기를 갖게 된다. 이후 박막 전체를 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(3-APTES)으로 활성화하였다. 3-APTES 처리 결과 막 표면에 아미노(-NH₂) 기가 생성되었다.

3-APTES 활성화 후 나노포어 칩을 0.1 M PBS 용액의 EDC(10 mM)와 NHS(20 mM)에 담갔다. 이후 나노포어 칩을 과산화물분해효소(HRP, 10 ng/ml)에 도입하였다. 우리 그룹의 선행 연구 결과[3]에 따르면, 0.1~2 M KCl, pH 7.0의 다양한 염 농도에서 HRP는 응집되지 않았다. 과산화물분해효소의 pI 값이 4.3 ± 0.2이므로, 0.1 M KCl pH 6.0과 pH 7.0에서도 HRP가 응집되지 않음을 입증하였다. EDC 시약은 HRP의 카르복실(-COOH) 기를 고반응성 o-아실아이소우레아 중간체로 활성화하였다. 또한 중간체는 NHS 존재 하에서 더 안정한 석시니미딜 아민 반응성 에스테르로 전환되었다[58]. 결과적으로 나노포어 내면에서 생성된 (-NH₂)와 공유 결합하여 안정적인 아마이드 결합을 형성하였다(그림 1).

a 카르보디이미드 커플링 화학을 통한 단일 나노포어 채널에서 HRP의 공유 결합 개략도. HRP의 카르복실(-COOH) 기가 EDC 용액으로 활성화되어 나노포어 칩 표면에서 생성된 (-NH₂)와 반응 가능하게 함. b 고정화된 HRP 과산화수소 센서 개략도, 센서 내면이 HRP로 개질됨. H₂O₂와 ABTS 존재 시 ABTS^•+ 생성. HRP 결정 구조는 저자 허가 하에 사용[3]

이러한 과정은 단일 나노포어 내면에 HRP를 고정화하는 데 이르게 한다. 기능화 공정의 실현은 개질 전후 단일 나노포어의 전류-전압(I-V) 곡선 측정으로 확인하였다(그림 2).

0.1 M KCl, 0.1 M PBS로 pH 7.0 완충된 조건에서 비개질(원본) 및 HRP 개질 나노포어의 전형적인 전류-전압(I-V) 곡선. 검은 선은 비개질 나노포어의 I-V 곡선, 빨간 선은 HRP 개질 나노포어의 I-V 곡선. 삽입도는 단일 나노포어(지름 ~50 nm cis)와 나노포어 센서의 SEM 이미지. 100 nm 스케일

HRP 개질 고체 상태 나노포어 특성 분석

단일 Si₃N₄ 나노포어 채널의 형상은 원통형이다. 그림 2는 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0에서 비개질(원본) 및 개질 나노포어의 전형적인 I-V 곡선을 보여준다. 나노포어 내면을 HRP 효소로 개질한 후 포어 크기가 작아졌다.

Wanunu 등에 따르면, 나노포어 외부의 전도도를 고려하여 고체 상태 나노포어의 직경을 다음 방정식으로 계산할 수 있다.

d = (1 + √(1 + 16σl/πG)) G/2σ (1)

여기서 d와 l은 포어의 직경과 길이, G는 개방 포어 전도도, σ는 이온 용액의 전도도이다.

기하학적 효과를 고려하면, HRP 효소로 고체 상태 나노포어 개질 후 유효 크기를 계산할 수 있다. 단일 나노포어의 직경은 방정식 (1)을 기반으로 계산할 수 있다. 비개질 고체 상태 나노포어의 I-V 곡선에서 전도도 값(G_unmodified) ~15 nS를 얻을 수 있다. 0.1 M KCl(25°C), 0.1 M PBS로 pH 7.0 완충된 이온 용액의 전도도(σ)는 ~1.28 S/m이다. 따라서 비개질 나노포어의 직경은 ~51 nm로, 측정된 직경과 유사하다. 동일한 방법으로 개질 나노포어의 전도도(G_modified) ~7.5 nS를 얻고, 개질 나노포어의 직경(~34 nm)을 계산하였다. 직경 감소는 두 가지 이유 때문이다: 첫째, (3-아미노프로필)트리에톡시실란(3-APTES)으로 나노포어 내면 처리하여 (-NH₂) 아미노 기를 도입. 둘째, HRP 효소의 유체역학적 직경(D_h)이 ~8 nm[3]로, 고정화된 HRP가 포어 직경을 감소시킬 수 있다. 여기서는 직경 ~34 nm의 HRP 개질 고체 상태 나노포어를 과산화수소 검출 채널로 사용한다.

산화환원 반응 원리

산화환원 반응은 단일 개질 나노포어 내부에서 수행되었으며, 다음 제시된 반응 과정은 제안된 산화환원 반응[58]과 잘 일치한다. H₂O₂(0.5 mM) 존재 하에서 나노포어 내면에 고정된 HRP 효소가 즉시 화합물 1로 전환된다. 화합물 1은 환원 기질 분자인 ABTS(1.5 mM)로부터 전자 1개를 받아 화합물 2를 생성한다. 이후 화합물 2는 또 다른 기질 분자 ABTS로부터 전자 1개 이동으로 휴지 효소로 환원된다.

산화환원 반응의 양이온 생성물(ABTS^•+)이 단일 나노포어에 축적된다. 축적된 분자가 나노포어 채널에서 이동하면 전도도(G)가 변화하고, 이에 따라 전류 변화(ΔI_b)를 관찰할 수 있다.

HRP(Fe³⁺)Porp + H₂O₂ → HRP(Fe⁴⁺=O)Porp^•+(화합물 1) + H₂O

HRP(Fe⁴⁺=O)Porp^•+ + ABTS → HRP(Fe⁴⁺=O)Porp(화합물 2) + ABTS^•+

HRP(Fe⁴⁺=O)Porp + ABTS → HRP(Fe³⁺)Porp + ABTS^•+ + H₂O

이동 이벤트 검출

실험은 개질 포어 직경(~34 nm)의 HRP 개질 나노포어를 사용하여 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0에서 수행하였다. 2,2'-아지노비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설포네이트)(ABTS)(1.5 mM)와 과산화수소(H₂O₂)(0.5 mM)를 나노포어의 트랜스 컴파트먼트에 첨가하였다. ABTS와 H₂O₂ 첨가 후 -100~-800 mV 바이어스 전압으로 실험을 수행하고 100 kHz로 샘플링하였다. 전압이 -400 mV로 증가할 때까지 이동 이벤트가 없었다. 그림 3은 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0에서 -400~-800 mV 다양한 전압에서의 이동 이벤트 대표 이온 전류 트레이스를 보여준다. 다양한 전압에서의 장시간 이동 이벤트 실험 데이터는 보충 자료(추가 파일 1: 그림 S3)에 추가하였다.

a-e -400~-800 mV 다양한 전압에서의 이동 이벤트 개략도. 적용 전압이 -400 mV에서 -800 mV로 증가함에 따라 이동 이벤트 빈도 증가. f 전류 진폭이 전압에 선형적으로 증가. h 지수 감쇠 함수(t_d ~ e^-v/v0)를 사용하여 체류 시간의 전압 의존성 피팅

0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0 조건에서 밀리초 전류 차단 이벤트가 관찰되었다. 트랜스컴파트먼트에 H₂O₂와 ABTS 시약을 첨가하여 단일 나노포어 채널 내면에 고정된 HRP 효소에서 산화환원 반응이 발생하였다. 다량의 ABTS^•+ 분자가 생성되었으며, 단일 작은 ABTS^•+ 분자는 시스템 분해능[3]으로 우리 고체 상태 나노포어에서 검출되지 않을 수 있다. 그러나 이 분자들은 생성 후 응집한다. 따라서 ABTS^•+ 분자 검출이 가능하다. 여기서 음전압을 유지하였고, 응집된 ABTS^•+ 분자가 나노포어를 통과하였다. 음전압 인가 시 전기영동 및 전기삼투 흐름이 발생하였다. HRP는 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0에서 음전하[3]를 띠므로 이중 전기층이 생성되고, 전기삼투는 음전극 방향으로 향한다. 이 때문에 전기영동과 전기삼투가 같은 방향(음전극 방향)으로 작용한다. 단일 나노포어 채널 내 응집된 ABTS^•+가 고체 상태 나노포어를 통해 음전극 방향으로 이동한다.

이동 이벤트 통계 분석

바이어스 전압이 응집된 ABTS^•+ 이동에 핵심 역할을 하므로, 적용 전압에 따른 HRP 개질 나노포어를 통과하는 응집된 ABTS^•+의 전류 차단 영향을 논의하였다. 이동 이벤트 발생 빈도는 전압 증가에 따라 크게 향상되었다(그림 3f). 전압 증가에 따라 전류 진폭도 증가한다. 그러나 바이어스 전압이 -300 mV 이하로 유지되면 이동 이벤트가 점차 사라지며, 이는 응집된 ABTS^•+가 HRP 개질 나노포어를 통과하기 위해 -300 mV 임계 전압이 필요함을 시사한다. 그림 4는 다양한 전압에서 응집된 ABTS^•+에 대한 평균 전류 진폭의 히스토그램을 보여준다. 피팅 곡선 기반으로 전류 차단 피크 값(ΔI_b)은 -400, -500, -600, -700, -800 mV에서 각각 308.4 ± 27.795 pA, 419.1 ± 20.354 pA, 478.8 ± 32.857 pA, 528.1 ± 36.98 pA, 606.9 ± 40.916 pA이다. 전류 진폭 값은 1차 다항식 함수로 피팅되어 기울기 -0.706, 절편 49.262를 생성한다. 그러나 피팅 곡선 기반으로 체류 시간 값은 -400, -500, -600, -700, -800 mV에서 각각 54.5 ± 21.374 ms, 42.8 ± 20.181 ms, 10.3 ± 3.05 ms, 6.0 ± 1.744 ms, 4.0 ± 1.441 ms이다. 그림 3h에서 지수 감쇠 함수(t_d ~ e^-v/v0)를 사용하여 체류 시간의 전압 의존성을 피팅하였다. 이동 이벤트 체류 시간 히스토그램은 보충 자료(추가 파일 1: 그림 S4)에 추가하였다.

0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0에서 다양한 전압(-400, -500, -600, -700, -800 mV)으로 응집된 ABTS^•+에 대해 측정된 이동 이벤트 평균 전류 진폭 히스토그램. 모든 히스토그램은 가우시안 분포로 피팅됨

각 응집된 ABTS^•+에 대한 전류 차단 대 이벤트 체류 시간을 2차원 산점도로 피팅하였다(그림 5). -400~-800 mV에서 모든 응집된 ABTS^•+는 이벤트 클러스터를 보이며, 주요 이벤트 클러스터는 응집된 ABTS^•+가 HRP 개질 고체 상태 나노포어를 통과함에 기인한다.

다양한 전압에서 각 응집된 ABTS^•+에 대한 전류 차단 대 이벤트 체류 시간 2차원 산점도. 해당 히스토그램은 오른쪽과 위에 배치. 모든 히스토그램은 가우시안 분포로 피팅됨

또한 모든 전압에서 단일 이동 이벤트를 분석하였고, 전류 차단이 동일한 크기와 전하를 가진 물질에 의해 유도됨을 확인하였다. 따라서 모든 이동 이벤트는 단일 응집된 ABTS^•+에 의해 유도된 것으로 간주된다. 실험에서 응집된 ABTS^•+의 이동 시간 분석을 위해, 전류 차단 지속 시간 t_d를 생성 위치에서 나노포어 출구까지 단일 응집된 ABTS^•+의 체류 시간으로 간주한다. 또 다른 조건으로, 나노포어 입구에 일부 HRP 효소가 고정되어 산화환원 반응을 촉매할 수 있다. 따라서 산화환원 반응이 입구가 아닌 단일 나노포어 내면에서 발생함을 검증하기 위해 다른 실험을 수행하였다. HRP로 개질하지 않은 나노포어를 적용 분석하였다. 이 나노포어들은 3-APTES로 활성화되었다. 동일한 농도 HRP(10 ng/ml), ABTS(1.5 mM), H₂O₂(0.5 mM)를 나노포어 트랜스 컴파트먼트에 첨가하고, 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0에서 음 바이어스 전압을 인가하였다. 전기영동 힘으로 HRP는 나노포어를 통과할 수 없다. 산화환원 반응으로 응집된 ABTS^•+가 생성되었으나 이동 이벤트는 발견되지 않았다. 응집된 ABTS^•+가 HRP와 정전기적 효과를 일으켜 나노포어 통과를 방해할 가능성이 있다.

그림 6은 다양한 전압에서 각 응집된 ABTS^•+에 대한 전도도 변화(ΔG) 대 이벤트 체류 시간 2차원 산점도를 보여준다. 전도도 변화(ΔG)가 주로 0.8 nS에 집중됨을 알 수 있다. 이동 이벤트 형태는 거의 동일하다. ΔG의 평균값은 다양한 전압에서 ~0.8 nS이다. 모든 응집된 ABTS^•+ 분자의 부피 배제 효과가 거의 동일함을 추측할 수 있다. 응집된 ABTS^•+ 분자의 정전기적 및 입체 효과가 이온 전류를 변화시킬 수 있다. 분석 후 양전하를 띤 응집된 ABTS^•+ 이동에서 두 가지 전형적인 전류 트레이스 형태를 관찰하였다(그림 7). -700 mV 이동 이벤트를 대표로 하였다. 두 유형 이벤트의 비율을 분석한 결과, 유형 1 이벤트 비율은 전압 증가와 함께 증가하는 반면, 유형 2 이벤트 비율은 감소하였다. 더 높은 전압이 낮은 전압보다 이동을 더 빠르게 만든다고 판단된다.

다양한 전압에서 각 응집된 ABTS^•+에 대한 ΔG 대 이벤트 체류 시간 2차원 산점도 개략도. 해당 피팅 곡선은 위에 위치. 삽입도는 -400~-800 mV 다양한 전압의 이동 이벤트

a -700 mV 전압에서 두 유형 이동 이벤트 개략도. b -400, -500, -600, -700, -800 mV 다양한 전압에서 두 유형 이벤트 비율

전류 차단 신호는 단일 나노포어 채널을 통과하는 응집된 ABTS^•+의 크기, 형태, 상호작용을 드러낸다. 전류 형태 변화에 대해 변화 과정을 추측하였다. 이벤트 1의 경우, 전류 신호는 깊은 강도의 전형적인 변동 부분과 짧은 체류 시간을 가진다. 응집된 ABTS^•+가 생성된 위치에서 나노포어를 통과했을 가능성이 있다. 응집된 ABTS^•+가 나노포어를 통과하면 나노포어의 이온 전류가 원래 레벨(베이스라인, I₀)로 복원된다. 이벤트 2의 경우, 전류 신호는 깊은 강도의 변동 부분 후 수평 단계를 가진다. 이 신호 형태는 나노포어 출구에서 HRP와의 응집된 ABTS^•+ 정전기적 상호작용에 기인할 수 있으며, 전류가 천천히 베이스라인으로 회복된다. 전류 변화를 더 잘 이해하기 위해, 염 농도(0.1 M KCl)에서 개방 포어 전도도 변화(G_pore)부터 시작해야 한다. 이전 연구들에서 논의된 바와 같이, 직경 d, 길이 l인 음전하 나노포어의 저염 농도에서 개방 포어 전도도 방정식은 다음과 같이 기술될 수 있다.

G_pore = (πd_pore²/4l_pore)[(μ_K⁺+μ_Cl^-)n_KCl·e + μ_K4σ_p/d_pore] (2)

여기서 μ_K와 μ_Cl은 K⁺와 Cl^-의 전기영동 이동도, n_KCl은 K⁺와 Cl^-의 수 밀도, e는 기본 전하, σ_p는 나노포어 표면의 표면 전하 밀도이다. 이 실험에서 고체 상태 나노포어는 화학적으로 개질되어 직경이 변경되었다. 나노포어 표면의 표면 전하 밀도(σ_p)를 정확히 구할 수 없으므로, 개방 포어 전도도(G_pore)는 방정식 (1)을 기반으로 계산하였다. 방정식 (1)에 따라 개방 포어 전도도(G_pore)는 ~7.5 nS이다. 전도도 변화는 두 가지 이유[15]로 기인한다고 추측된다. 첫째, 나노포어 내 이온의 부피 배제가 응집된 ABTS^•+ 분자에 의해 점유되어 고체 상태 나노포어의 전도도가 감소(ΔG^-). 둘째, 일부 이온이 응집된 ABTS^•+ 분자에 의해 나노포어에서 빠져나와 고체 상태 나노포어의 전도도를 증가. 이 실험에서 ABTS^•+가 나노포어 내부에서 생성되었고 이온이 유입되지 않았으므로, 고체 상태 나노포어의 전도도 변화(ΔG)는 부피 배제에 의해서만 유도된다. 따라서 총 전도도 변화는 다음과 같이 기술된다.

ΔG = ΔG^- (3)

고체 상태 나노포어의 전도도 감소는 부피 배제에 의해 유도되며 다음 방정식으로 계산할 수 있다.

ΔG^- = σ γΛ/(l+0.8d)² (4)

여기서 γ는 입자 형상 인자로, 구와 입자의 동일 부피 표면적 비율이다. 이 연구에서 응집된 ABTS^•+ 분자를 구형 물체로 단순화하였으므로 γ=1이고 Λ는 부피 배제이다. 벌크 용액 전도도 σ는 1.28 S/m, 0.1 M KCl(25°C)이다.

부피 배제(Λ)에 대해 다른 분자들의 이동 이벤트로부터 유추할 수 있다. 고체 상태 나노포어를 기반으로 전해질 용액의 부피 변화에 옴의 법칙을 적용하여 전도도 변화(ΔG)를 분자의 물리적 특성과 연결할 수 있다[59]. 원통형 고체 상태 나노포어에서 분자의 이동 이벤트 발생 시 전류가 순간적으로 감소한다. 고체 상태 나노포어의 저항이 전체 회로 저항일 때, 전도도 변화(ΔG)는 다음 방정식으로 기술될 수 있다.

ΔG(t) = -G_pore Λ(t)/H_effA_p [1 + f(d_m/D_p, l_m/H_eff)] (5)

이 방정식에서 A_pH_eff = V_p는 고체 상태 나노포어의 부피, f(d_m/D_p, l_m/H_eff)는 보정 인자(표면 전하 효과 무시), 우리 실험에서 응집된 ABTS^•+ 분자를 구형 물체로 단순화하였으므로 보정 인자는 1이다. d_m/D_p는 분자 직경과 나노포어 직경 비율, l_m/H_eff는 분자 유효 길이와 나노포어 유효 길이 비율이다. 식 (5)는 다음과 같이 단순화될 수 있다.

ΔG/G_pore ≈ Λ/V_p (6)

이동 이벤트의 평균 전도도(G_pore)를 분석하였다. 식 (5)에서 다양한 전압(-400, -500, -600, -700, -800 mV)에서 평균 부피 배제(Λ) 값을 구할 수 있다. 한편 사용된 나노포어 크기를 알므로 나노포어 부피(V_p)는 ~90746 nm³이다. 식 (4)에 따라 전도도 변화(ΔG^-) 값은 ~0.6 nS로 계산된다. 다양한 전압(-400, -500, -600, -700, -800 mV)에서 이동 이벤트 실험으로부터 얻은 전도도 변화 평균값은 ~0.784 nS이다. 계산값이 실험값과 가까움을 알 수 있다.

일부 선행 연구에서 과산화수소 분자를 다양한 기술로 검출한 바 있다. 그러나 나노채널로 과산화수소 검출은 드물다. Tan 등[3]은 HRP가 나노포어에 스레딩될 때 ABTS와 H₂O₂가 KCl 용액에 존재하는 조건에서 상이한 이벤트 신호를 구별하였으며, HRP 이동과 함께 나타나는 다양한 유형 신호를 ABTS^•+의 나노포어 통과로 간주하였다. 효소 촉매 기질 생성물의 이동에 대한 6가지 전형적 이벤트를 분석하고 각 유형의 가능성 있는 과정을 추측하였으나, 이를 입증할 충분한 증거는 없었다. Mubarak Ali 등은 단일 원뿔형 나노채널 내부에서 산화환원 반응 생성물을 검출하는 데 성공하였다[58]. 그들은 양이온 라디칼 ABTS^•+가 원뿔형 나노채널에서 전압 의존적 방식으로 이온 전류를 감소시킴을 발견하였으며, 이는 원뿔형 나노채널의 전압 의존적 이온 농도와 일치한다. 전류 차단 크기는 용액 내 H₂O₂ 농도와 상관관계가 있었다.

결론

결론적으로, 우리는 FIB를 사용하여 Si₃N₄ 나노포어를 성공적으로 제작하였으며, 공유 결합으로 연결된 HRP 효소로 표면이 개질된 단일 나노포어 시스템을 구축하였다. 기질 H₂O₂와 ABTS 존재 하에서 발생하는 산화환원 반응 생성물(ABTS^•+)을 조사함으로써 단일 고체 상태 나노포어 내 고정화된 HRP 효소의 과산화수소(H₂O₂) 센서로서의 효과를 입증하였다. 고체 상태 나노포어 내부에서 생성된 응집된 양이온 라디칼 ABTS^•+가 HRP 개질 고체 상태 나노포어에서 이온 전류를 감소시키며, 이는 전압 의존성과 일치한다. 전류 차단 경향은 적용 바이어스 전압에 대해 선형 의존성을 보였다. 체류 시간 대 적용 바이어스 전압 관계는 지수 감쇠(t_d ~ e^-v/v0)를 따랐다. 한편 응집된 ABTS^•+가 HRP 개질 나노포어를 통과하기 위해서는 -300 mV 임계 전압이 필요하였다. 전도도 변화(ΔG)를 해석적으로 계산하여 측정된 실험값과 비교하였다. 이동 이벤트는 특정 크기의 응집된 양이온 라디칼 ABTS^•+에 의해 생성되었다. 고체 상태 나노포어 사용이 검출 한계를 낮추고 시스템 감도를 향상시킬 것으로 기대된다. 우리 고체 상태 나노포어 시스템은 구조가 간단하며, 파울링에 강하고 다중 사용이 가능하다.

약어

3-APTES:

(3-아미노프로필)트리에톡시실란

ABTS:

3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산

EDC:

N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드

FIB:

집속 이온 빔

HRP:

과산화물분해효소

KCl:

염화칼륨

NHS:

N-하이드록시석시나마이드

SEM:

주사 전자 현미경

SNR:

신호대잡음비