실리카 나노입자의 폐 및 고환 조직에서 유전자 발현과 DNA 메틸화에 미치는 영향

요약

나노기술이 급속히 발전하여 첨단 의료 치료제에 널리 활용되고 있습니다. 그러나 나노입자(NP) 노출이 다양한 전신 질환을 유발할 수 있다는 우려가 커지고 있으며, 후성유전적 메커니즘이 점점 더 많은 질병과 연관되고 있습니다. NP의 후성유전체 수정 역할은 질병 병인학에서 중요합니다. 본 연구는 SiO₂ NP에 세포를 노출시켜 폐와 고환 세포의 손상 후성유전적 메커니즘을 규명하는 것을 목표로 했습니다. 수컷 C57BL/6 마우스를 이용해 SiO₂ NP가 폐와 고환 세포에 미치는 손상 효과와 각인된 Dlk1/Dio3 도메인 영역의 메틸화 상태 변화를 특성화했습니다. SiO₂ NP에 노출된 A549 세포에서 세포 사멸이 관찰되었고, SiO₂ NP에 노출된 수컷 마우스에서 폐와 고환 조직 변화가 나타났습니다. 각인 도메인 Dlk1/Dio3 영역의 유전자들이 두 조직 모두에서 변화했으며, Dlk1, Rtl1, Dio3은 고환에서 상향 조절되었고, Dlk1과 Dio3은 폐 조직에서도 상향 조절되었습니다. 수컷 성체 폐와 고환의 아황산염 시퀀싱 PCR 결과 대부분 저메틸화되었으며, 소수의 CpG는 고메틸화되었습니다. 이러한 발견은 나노입자가 각인 유전자의 DNA 메틸화에 중요한 역할을 함을 시사합니다.

배경

이산화 규소는 화학식 SiO₂인 규소 산화물로, 자연에서 석영으로 가장 흔하게 발견되며 다양한 유기 환경에도 존재합니다[1]. 공학 나노입자는 나노기술의 급속한 성장과 하이테크 산업 응용으로 널리 보급되었습니다. 이 특정 나노입자는 큰 비표면적, 풍부한 반응성 부위, 높은 표면 에너지, 불포화 화학 결합, 강한 흡착 능력, 금속 및 유기물과의 강한 상호작용 경향 등 물리화학적 특성으로 전자제품, 플라스틱 제품, 의료, 화장품, 코팅 재료 등 다양한 소비재에 널리 사용되며, 이로 인해 환경 내 오염물질과 그 이동을 변화시킵니다[2]. 다양한 소비재에 SiO₂ 나노입자(NP)가 존재함으로써 환경 방출과 인체 접촉 가능성이 증가합니다.

이전 실험 연구에서 금속 및 금속 산화물 나노입자 종의 단일 기관내 주입 또는 다중 복강 내 주입이 세포에서 전신 및 개체 수준까지 독성 효과를 유발함을 보였습니다[3]. SiO₂ NP 처리는 사멸 증가와 세포 운동성 감소로 유방암 세포주 성장을 억제합니다. 또한 SiO₂ NP 노출은 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 현저히 교란시킵니다[4]. 세 가지 크기의 TiO₂ NP로 처리한 랫트 모델에서 대조군과 비교 시, 큰 응집체(>100 nm) 에어로졸의 기관지폐포 세척액(BALF) 처리는 급성 염증 반응을 유발한 반면, 작은 응집체(<100 nm) 에어로졸은 유의한 산화 스트레스 손상과 세포독성을 생성했습니다[5].

나노입자 생식 독성 연구는 성장하는 분야입니다. 한 연구에서 동일 처리 용량 하에서 Ni NP가 C. elegans에서 Ni 마이크로입자(MP)보다 더 높은 생식 독성을 유발함을 보였습니다. C. elegans에서 관찰된 생식 독성에는 산란 수 감소, 수정란 감소, 정자 활성화 감소가 포함됩니다[6]. 특정 환경 효과가 정자 게놈 변화 없이 부계 경로를 통해 자손에게 전달될 수 있다는 증거가 늘고 있습니다[7,8]. 부계 정보는 게놈뿐만 아니라 관련 특정 후성유전 표지자, mRNA 함량, 비코딩 RNA에도 존재합니다.

산화 스트레스는 나노입자 독성의 중요한 메커니즘으로, DNA 손상, 염증, 단백질 변성, 지질 과산화를 유발할 수 있습니다[9]. 이러한 생물학적 효과는 크기, 표면적, 모양, 표면 화학, 관능화, 용해도 등 나노입자의 물리화학적 특성에 영향을 받습니다[10,11]. 나노입자 노출이 저용량, 비세포독성 용량에서도 조직과 세포에서 후성유전적 변화를 유발할 수 있다는 증거가 명확히 늘고 있습니다[12,13]. 후성유전학은 DNA 서열 변화 없이 유전자 기능의 유전적 변화를 연구하는 분야로 DNA 메틸화, 유전자 각인, 히스톤 변형, 비코딩 RNA 조절을 포함합니다[14]. 이러한 후성유전적 변화는 수많은 병리적 상태와 질병의 발달 및 진행과 연관됩니다[15]. 따라서 후성유전적 효과는 세포 수준에서 환자 위험 평가 스크리닝의 중요한 부분입니다.

Dlk1/Dio3 각인 도메인에는 부계 메틸화된 세 개의 알려진 차이 메틸화 영역(DMR)이 있습니다: 유전자간 DMR(IG-DMR), 모계 발현 3-DMR(Gtl2-DMR), Dlk1-DMR[16]. 이전 연구에 따르면 IG-DMR이 Gtl2 프로모터 DMR의 대립 유전자 메틸화 상태를 결정하며, 이는 전체 클러스터의 유전자 발현을 제어합니다[17]. 마우스 게놈에는 12번 염색체 말단 영역의 Dlk1/Dio3 도메인에 많은 수의 각인 유전자가 있습니다. Dlk1과 Gtl2 사이에 위치한 IG-DMR은 남성 생식세포에서 특이적으로 메틸화되며 각인 유전자 영역의 부계 대립유전자 특이적 발현을 조절합니다[18]. IG-DMR 메틸화 상태는 출생 전에 확립되어 남성의 평생 동안 남성 생식세포 분화 중 남성 생식세포에서 유지되며, 즉 IG-DMR 메틸화는 성숙 고환의 정원세포와 정모세포에서 유지됩니다.

본 연구 목적은 전사 및 번역적 침묵 이전에 정자 형성 중 남성 생식세포 유전자 발현 변화를 찾아 환경 변화를 통한 부계 자손 영향을 설명하는 것입니다. 환경 요인은 정자 전사적 수정을 변화시켜 자손 발달 변화를 초래할 수 있습니다. 이 조사를 위해 세포주와 마우스를 모델로 SiO₂ NP 독성 효과 스크리닝에 사용했습니다. 우리 지식으로는 나노입자가 폐와 고환 조직 모두에서 Dlk1/Dio3 각인 영역의 후성유전적 손상 메커니즘을 입증한 최초의 연구입니다.

실험 방법

실험 동물

동물 관리는 난징 의과대학 해당 동물 이용 프로토콜 하에서 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었습니다. 마우스는 베이징 바이탈 리버 실험동물 기술 유한회사에서 구입했습니다. 모든 동물은 23°C, 12시간 명주기에서 사육되었습니다. 멸균수와 쥐 사료를 자유 섭취했습니다. 마우스 활동과 행동을 매일 모니터링했습니다. 2주 후 나노 크기 SiO₂ 12.5 mg/kg을 주입했습니다.

시약

나노 크기 SiO₂(99.5% 트레이스 메탈 기준, 입자 크기 10-20 nm)는 시그마-알드리치 케미칼(세인트루이스, MO, USA)에서 구입했습니다. 나노입자를 RPMI 1640 배지에 현탁해 스톡 용액을 만들고, 초음파 진동으로 20분 분산, 적정 농도로 희석 후 추가 20분 분산했습니다.

SiO₂ NP 특성

크기와 제타 전위는 말번 제타사이저 나노 ZSP로 기록했습니다.

RNA 추출 및 qRT-PCR

폐와 고환 시료를 액체 질소에 급속 동결 후 약 4시간 후 -80°C에 보관했습니다. 시료 해동 후 추출했습니다.

TRIzol 시약(Invitrogen Life Technologies, USA) 1 mL로 시료에서 총 RNA를 분리했습니다. 혼합물을 80% 파워로 5분 초음파 처리, 0.2 mL 클로로포름 첨가, 4°C에서 12,000g/min으로 15분 원심분리했습니다. 단백질 제거를 위해 페놀/클로로포름 정제 3단계를 추가했습니다. 260 nm와 280 nm에서 UV 흡광도로 각 시료의 RNA 함량과 품질을 측정했습니다. mRNA 프라이머 서열은 추가 파일 1: 표 S1, S2에 나와 있습니다. qRT-PCR은 제조사 지침에 따라 수행했습니다[19]. 실시간 PCR은 SYBR Green(Vazyme)으로 수행했습니다. PCR 사이클: 95°C 30초 초기 변성, 95°C 15초 변성, 60°C 15초 어닐링, 72°C 30초 신장 40 사이클. β-actin으로 정규화 후 2^-ΔCt법으로 표적 유전자 양 분석했습니다.

DNA 추출, 아황산염 처리 및 아황산염 시퀀싱 PCR

DNA는 고환과 폐 조직에서 DNA 키트(QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. No.51304; USA)로 제조사 권장사항에 따라 분리했습니다. 500 ng 전체 게놈 DNA의 아황산염 전환은 키트(EpiTect® Bisulfite kit; Qiagen. No. 59104; USA)로 제조사 권장사항에 따라 수행했습니다. 서로 다른 CpG 메틸화 올리고뉴클레오티드는 Methyl Primer Express v1.0 소프트웨어로 설계했으며 서열은 다음과 같습니다: P1-F 5′-TTGGGTTTTGAGGAGTAGTA-3′, P1-R 5′-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3′; P2-F 5′-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3′, P2-R 5′-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3′; P3-F 5′-TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3′, P3-R 5′-ACCCATAACAAACCACAACA-3′; P4-F 5′-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3′, P4-R 5′-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3′.

각 DNA 시료를 다음과 같이 PCR 증폭했습니다: 2.5 µL 10× PCR 버퍼, 500 ng 아황산염 처리 DNA, 0.5 µL씩 전방/역방향 프라이머, 0.5 µL dNTP 믹스, 0.5 µL rTaq(500 U, dNTP, Mg²⁺)(Takara Bio, Tokyo, Japan), ddH₂O로 25 µL까지 조절. 94°C 10분 중합효소 활성화 후 94°C 30초, 58°C 30초, 72°C 1분, 최종 신장 72°C 10분으로 40 사이클 수행.

세포 배양 및 처리

A549 세포는 ATCC(매너서스, VA, USA)에서 구입해 10% 태아 소 혈청(FBS) 첨가 1640 배지에서 37°C, 5% CO₂, 습도 조절 인큐베이터로 배양했습니다. 세포를 96웰 플레이트에 접종하고 SiO₂ NP를 62.5, 125, 250, 500, 1000, 2000 µg/ml 농도로 24시간 처리했습니다.

세포 생존율 분석

세포 생존율은 CCK8 증식 분석으로 평가했습니다. 세포를 96웰 플레이트 웰당 1.5×10⁴ 밀도로 접종하고 하룻밤 배양했습니다. 다양한 농도 SiO₂ NP 노출 후 각 웰에 100 µL CK8 첨가, 37°C에서 30분 배양해 CCK8 대사 허용. 마지막으로 450 nm에서 흡광도 측정. 세포 억제율을 계산해 SPSS 15.0으로 IC₅₀로 변환했습니다.

통계 분석

모든 계산은 SPSS 15.0 소프트웨어로 수행했습니다. 그룹 간 비교는 무관 t-검정과 BSP용 피어슨 카이제곱 검정으로 수행했습니다. 데이터는 평균 ± SD로 제시했습니다. 모든 경우 p < 0.05를 통계적 유의성으로 간주했습니다.

결과

SiO₂ NP 특성화

실험 조건에서 SiO₂ NP를 특성화했습니다. 배양 배지(10% FBS)에서 SiO₂ NP의 평균 유체역학적 반경과 제타 전위는 각각 371.77 ± 18.46 nm, 18.83 ± 2.12 mV였습니다(그림 1).

현탁액에서 SiO₂ NP 특성화. 입자를 10% FBS 세포 배양 배지에 현탁. a, b 제타사이저 나노 ZSP로 SiO₂ NP 크기와 제타 전위 평가. c 다양한 농도 SiO₂ NP 24시간 노출 후 CCK8 분석으로 세포 생존율 결정. 중복 실험 평균 ± SD, 각 실험 3회 기술적 반복. *** p < 0.001

SiO₂ NP가 A549 세포주에 미치는 영향

SiO₂ NP 독성을 결정하기 위해 A549 세포로 증식 시험을 수행해 SiO₂ NP의 A549 세포 IC₅₀을 결정했습니다. 그림 1c에서 SiO₂ NP가 농도 의존적으로 A549 세포 생존율을 감소시킴을 볼 수 있습니다. 62.5 µg/ml 초과 SiO₂ NP 농도에서 생존율 감소가 유의했습니다(p < 0.001). 화학물질의 IC₅₀ 24h는 24시간 노출 후 50% 세포에 영향을 주는 농도로 정의됩니다. SiO₂ NP의 IC₅₀ 24h는 4942 µg/ml로 결정되었습니다.

SiO₂ NP가 마우스 폐와 고환에 미치는 영향

12.5 mg/kg 체중 용량 SiO₂ NP 노출이 마우스 모델에서 폐막 손상과 고환 손상을 초래하는지 확인했습니다. 그림에서 볼 수 있듯 SiO₂ NP 노출은 폐 조직학적 단면에서 층상체 파괴(그림 2a, b)와 고환에서 대조군 대비 미토콘드리아 크리스타 손상(그림 2c, d)을 유발했습니다. 이어서 SiO₂ NP가 Dlk1/Dio3 각인 영역의 활성화에 미치는 폐와 고환 영향을 조사했습니다.

SiO₂ NP 노출 랫트 폐와 고환 조직 TEM 이미지. a SEM으로 평가한 대조군 폐 조직 형태. b SEM으로 평가한 처리군 폐 조직 형태. c SEM으로 평가한 대조군 고환 조직 형태. d SEM으로 평가한 처리군 고환 조직 형태. 스케일 바 2.0 µm

마우스 폐와 고환에서 각인 유전자 발현

폐와 고환 변화를 설명하기 위해 이 조직들에서 각인 유전자를 검출했습니다. 24개 각인 유전자를 선택했습니다: Dio3, Ddc, Dlk1, Gpr1, Gtl2, H19, Igf2, Igf2as, Igf2r, Inpp5f, Magel2, Magi2, Mest, Mir296, Mir298, Ndn, Nnat, Peg10, Plagl1, Pwcr1, Rasgrf1, Rtl1, Snrpn, Snurf. 이 중 13개 유전자가 폐와 고환 모두에서 발현됨: Dio3, Dlk1, Gpr1, Gtl2, Igf2r, Igf2, Inpp5f, Peg10, Ndn, Nnat, Rasgrf1, Rtl1, Snrpn (그림 3a, b). 주요 초점인 Dlk1/Dio3 각인 영역 차이 발현 유전자는 Dlk1, Gtl2, Rtl1, Dio3을 포함합니다.

폐와 고환에서 각인 유전자 발현. a 폐에서 각인 유전자 발현. b 고환에서 각인 유전자 발현. *P < 0.05. **P < 0.01. 학생 t-검정

Dlk1/Dio3 각인 영역 발현

각인 Dlk1/Dio3 영역은 상속 대립유전자 상에 4개 단백질 암호화 유전자(Dlk1, Gtl2, Rtl1, Dio3)를 포함합니다[20](그림 4c). SiO₂ NP 처리에 대한 폐와 고환 조직 반응에서 Dlk1/Dio3 영역 역할을 밝히기 위해 대조군과 비교해 DMR 메틸화 패턴을 분석했습니다. 폐와 고환에서 서로 다른 유전자가 메틸화 표적이 됩니다. Dlk1과 Dio3 발현은 폐와 고환 모두에서 상향 조절되었으며, Rtl1은 고환에서만 상향 조절되었습니다(그림 4a, b).

Dlk1/Dio3 각인 영역 발현. a 폐에서 발현된 Dlk1/Dio3 영역 유전자. b 고환에서 발현된 Dlk1/Dio3 영역 유전자. c Dlk1/Dio3 영역 도식. *P < 0.05. **P < 0.01. 학생 t-검정

Dlk1/Dio3 DMR 영역 메틸화

유전자 발현 변화가 DNA 메틸화에 반응하는지 더 조사하기 위해 마우스 폐와 고환에서 이 영역의 메틸화 상태를 다뤘습니다. DNA 메틸화 분석에서 CpG 아일랜드 세 구간의 서열을 결정했습니다. 고환에서는 저메틸화되었으나 CpG 아일랜드 1에서 유의한 고메틸화 보임(그림 5). 폐에서는 고환과 전체 메틸화 패턴이 유사하나 CpG 아일랜드 2에서 고메틸화 보임(그림 6).

고환에서 Dlk1/Dio3 DMR 영역 메틸화. a 대조군과 처리 조직의 CpG 아일랜드 1 메틸화. b CpG 아일랜드 2 메틸화. c CpG 아일랜드 3 메틸화

폐에서 Dlk1/Dio3 DMR 영역 메틸화. a 대조군과 처리 조직의 CpG 아일랜드 1 메틸화. b CpG 아일랜드 2 메틸화. c CpG 아일랜드 3 메틸화

논의

나노소재 사용 증가는 인간 건강과 환경 영향에 대한 잠재적 우려를 높입니다. 이전 연구에서 SiO₂ NP가 폐와 심혈관 손상(노령 랫트에서 폐 염증, 심근 허혈 손상)을 유발할 수 있음을 보였습니다[21]. 또한 나노입자는 생식세포에 영향을 줄 수 있는데, 이러한 세포가 Ag NP 독성 효과에 더 민감해 낮은 용량 노출 후에도 부작용을 보이기 때문입니다. Ag NP 노출은 랫트 정자 세포 이상 증가를 유발하고 첨체와 세포막 무결성 감소, 미토콘드리아 활성 감소뿐만 아니라 정자 활성화 감소를 초래했습니다[22]. 우리 조사는 나노입자가 수컷 생물체와 심지어 노출되지 않은 자손을 표적으로 할 잠재력을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 사용하는 일련의 연구 일부입니다.

이전 in vitro 연구에서 일부 나노입자 단기 노출이 TM-4 세르톨리 세포에서 세포 사멸과 각인 유전자 비정상 발현을 유발함을 보고했습니다. 이는 각인 유전자 비정상 발현이 나노입자 생식 독성 유발 기저 메커니즘일 수 있음을 시사합니다[23]. 또한 이전 in vivo 연구에서 내분비 교란 물질 같은 일부 환경 요인이 노출된 개체뿐만 아니라 연속된 자손 세대에서도 표현형이나 질병 상태를 촉진할 수 있음을 보였습니다. 생식세포에서 영구적으로 프로그램된 에피돌연변이는 후성유전적 세대 간 표현형 전달을 허용합니다[19]. 본 연구 목적은 마우스 모델에서 SiO₂ NP 처리에 의한 후성유전적 상태 변화를 조사해 수컷 세대 간 효과의 메커니즘적 기초를 마련하는 것입니다.

후성유전적 상태는 DNA 서열 변경 없이 게놈 내에서 발생하는 화학적 수정을 정의하는 용어입니다[24]. DNA 메틸화, 각인 유전자, 히스톤 변형, 비코딩 RNA 발현 등 후성유전적 메커니즘은 외부 환경에서 게놈 기능에 영향을 줄 수 있습니다[25]. 우리 지식으로는 본 연구가 SiO₂ NP가 후성유전적 수준에서 폐와 고환 독성을 유발함을 조사한 최초 연구입니다.

먼저 인간 폐 상피 세포주인 A549 세포에서 SiO₂ NP 급성 독성을 조사했습니다. 그러나 실험 마우스에서 환경 농도 SiO₂ NP 접촉 후 박층 폐 II형 상피 세포 손상과 고환 미토콘드리아 크리스타 손상이 드러났습니다[26]. 폐와 고환 병리 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 각인 유전자를 발현시켰습니다. 게놈 각인은 DNA 메틸화 및/또는 히스톤 변형 같은 후성유전적 과정을 통해 배우자 기원에 따라 접합체의 한 부계 대립유전자를 침묵시키는 것을 말합니다[27]. 이전 연구에서 Dlk1/Dio3 도메인 각인 유전자 발현이 태아 성장[28], 인간 사춘기 시기[29], 대사 질환 감수성[30]에 중요함이 밝혀졌습니다. IG-DMR이 Gtl2 프로모터 DMR 대립유전자 메틸화 상태를 결정해 전체 Dlk1/Dio3 영역 유전자 발현을 제어한다는 연구가 있습니다[17]. 이 각인 조절 영역의 주요 기능은 생식세포 유도 DNA 메틸화를 배우자 신호로 상속하고, 나중에 체세포 내 후속 대립유전자 특이적 DNA 메틸화 패턴을 유지하는 것입니다[31]. 본 연구는 SiO₂ NP가 폐와 고환 조직 모두에서 Dlk1/Dio3 영역 발현 변화를 유도함을 입증했습니다. Dlk1/Dio3 영역에서 부계 발현 유전자(Dlk1, Rtl1, Dio3)가 NP 처리 후 대조군 대비 특히 비정상적이었습니다. 아황산염 시퀀싱 결과 폐와 고환에서 다양한 수준의 저메틸화가 나타났습니다. 처리 조직에서 IG-DMR 메틸화 상태가 일반적으로 낮으며, 이 저메틸화가 각인 유전자 차이 발현 메커니즘을 나타낼 수 있습니다.

결론

결론적으로, 본 결과는 SiO₂ NP 노출이 세포 손상을 유발하는 중요한 DNA 메틸화 변화를 유도할 수 있으며, 이러한 변화가 Dlk1/Dio3 각인 유전자 클러스터 발현에 매우 중요함을 나타냅니다. 중요하게도 DNA 메틸화 변화가 폐와 고환 조직 모두에 영향을 미칩니다. 이 결과는 노출 모델 자손에게 유전되는 나노입자 후성유전체 효과와 그러한 후성유전적 변화를 매개하는 분자 메커니즘 규명을 위한 향후 연구에 중요한 역할을 합니다.

약어

BALF:

기관지폐포 세척액

CCK-8:

세포 계수 키트-8

DMRs:

차이 메틸화 영역

EGFR:

표피 성장 인자 수용체

IG-DMR:

유전자간 DMR

MPs:

마이크로입자

NPs:

나노입자