현재 수술 내비게이션용 광학 조영제로 다양한 형광 나노물질이 설계 및 합성되었습니다. 그러나 실리콘 양자점(Si QD)을 이용한 폐암 수술 내비게이션용 형광 조영제 제조에 대한 보고는 없습니다. 본 연구에서는 Pi 등이 보고한 물분산성 Si QD 미셀을 개량 및 수정하여 Si QD 미셀-CKAP4를 제조했습니다. 데이터에 따르면 Si QD 미셀-CKAP4는 평균 수직경 약 78.8 nm의 구형 입자였습니다. Si QD 미셀-CKAP4의 UV-가시광 흡수는 200~500 nm 범위였습니다. 330 nm 흥분 파장에서 형광 방출 스펙트럼에서 640 nm에서 강한 형광이 관찰되었습니다. 레이저 공초점 현미경 및 형광 현미경 분석 결과 Si QD 미셀-CKAP4가 폐암 세포와 폐암 조직에 in vitro에서 좋은 표적 능력을 보였습니다. In vivo 형광 영상 분석 결과 Si QD 미셀-CKAP4가 간에서 대사되고 신장에서 배설됨을 보였습니다. 또한 Si QD 미셀-CKAP4는 정상 폐 조직에 비해 in vivo에서 폐암 조직을 특이적으로 표적화했습니다. 세포독성과 H&E 염색 분석 결과 Si QD 미셀-CKAP4가 in vitro와 in vivo에서 높은 생체적합성을 보였습니다. Si QD 미셀-CKAP4는 폐암 특이적 표적 영상제이며 향후 폐암 수술 내비게이션용 형광 조영제로 기대됩니다.
암은 전 세계적으로 인간 건강을 위협하는 주요 질병 중 하나입니다[1]. 그중 폐암의 발생률과 사망률은 모든 악성 종양 중 가장 높으며 매년 증가 추세입니다[2]. 수술적 절제는 고형 종양의 1차 치료법입니다. 그러나 악성 조직과 정상 조직을 구별하는 방법은 주로 촉각과 시각적 단서, 집도의 경험에 의존합니다[3].
최근 형광 유도 수술이 실시간 수술 중 종양 절제 가이드 연구 분야에서 인기를 끌고 있습니다[4]. 형광 조영제와 형광 영상 시스템의 도움으로 집도의는 실시간 영상 가이드를 통해 원발 종양을 절제하고 수술 강내 잔여 종양을 식별할 수 있습니다. 기존 생체 영상 방법과 비교하여 형광 영상 시스템은 전리 방사선 부재, 높은 공간 해상도 등 여러 이점을 제공합니다[3, 5, 6].
현재 연구자들은 생체 영상용 다양한 형광 나노물질을 보고했습니다[7, 8]. 그중 실리콘 양자점(Si QD)은 생체 영상 분야에서 인기를 끌고 있습니다[9-11]. 그러나 Si QD를 이용한 폐암 수술 내비게이션용 형광 조영제 제조 보고는 없습니다.
2014년 Pi 등은 새로운 물분산성 Si QD 미셀 합성법을 보고했습니다[12]. 연구 데이터에 따르면 Si QD 미셀은 제어 가능한 크기, 높은 형광 양자 효율, 우수한 광안정성 등의 장점을 보였습니다[12]. 본 연구는 Pi 등이 보고한 물용해성 Si QD 미셀을 개량 및 수정하여 새로운 형광 조영제를 제조하는 것을 목표로 하며, 이는 향후 폐암 수술 내비게이션용 형광 조영제로 사용될 것으로 기대됩니다.
2018년 Yanagita 등은 CKAP4가 폐암 환자의 혈청과 암 조직에서 고발현되며 폐암 조기 진단의 새로운 바이오마커로 사용될 수 있다고 보고했습니다[13]. 따라서 CKAP4 항체 결합 Si QD 미셀은 새로운 형광 조영제가 될 수 있으며, 폐암 수술 내비게이션용 형광 조영제로 사용될 수 있습니다.
본 연구에서는 DSPE-PEG-COOH를 사용하여 표면에 카복실기를 가진 Si QD 미셀을 제조했습니다. 그런 다음 EDC를 사용하여 CKAP4 항체를 Si QD 미셀과 결합시켰습니다. 결과적으로 Si QD 미셀-CKAP4가 수용액에서 잘 분산됨을 보였습니다. Si QD 미셀-CKAP4는 365 nm 자외선 조사 시 강한 적색 형광을 보였습니다. 항체 결합으로 인해 Si QD 미셀-CKAP4는 in vitro와 in vivo에서 폐암 세포와 조직에 좋은 표적 능력을 보였습니다. 또한 Si QD 미셀-CKAP4는 in vitro와 in vivo에서 높은 생체적합성을 보였습니다. 본 연구에서 우리는 폐암 수술 내비게이션용 잠재적 형광 조영제를 제조했습니다.
우혈청알부민(BSA, ≥98%, Sigma, Missouri, USA), 테트라하이드로푸란(THF, 99.9%, Adamas-beta, Basel, Switzerland), DSPE-PEG-COOH(Aladdin, Shanghai, China), CKAP4 항체(0.55 mg/mL, Abcam, Cambridge, UK), Dulbecco 변형 독수리 배지(DMEM)와 인산염 완충 식염수(PBS, Hyclone, Utah, USA), 태아소혈청(FBS)과 트립신(Gibco, New York, USA), 파라포름알데히드(4%), 트리톤 X-100 함유 면역염색 투과 버퍼, 면역염색 차단 버퍼(Beyotime, Shanghai, China), 글리세린(≥99%, Solarbio, Beijing, China), 트립신(0.25%, Kingmorn, Shanghai, China).
투과 전자 현미경(TEM) 이미지는 JEM-2100F 전자 현미경(JEOL, Tokyo, Japan)으로 촬영했습니다. 수직경은 JEM Zetasizer Nano-ZS90(Malvern Instruments, Malvern, UK)으로 측정했습니다. UV-Vis 흡수 스펙트럼은 Cary 50 분광광도계(Varian, Palo Alto, CA, USA)로 얻었습니다. 형광 방출 스펙트럼은 F-182 4500 분광광도계(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)로 얻었습니다. X선 광전자 분광법(XPS)은 RBD 업그레이드된 PHI-5000C ESCA 시스템(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)으로 수행했습니다. 광발광(PL) 양자 수율(QY)은 형광 분광계(FLS1000, Edinburgh Instruments, Livingston, England)로 추정했습니다. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)은 Thermo IS50(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)으로 수행했습니다. X선 회절(XRD)은 SmartLab(Rigaku Corporation, Tokyo, Japan)으로 테스트했습니다.
A549와 293 T 세포주는 Shanghai Institute of Cell Biology(Shanghai, China)에서 구매했습니다.
먼저, 수소실릴화 반응으로 도데실-Si QD를 제조하고 기존 보고 방법[12]에 따라 THF에 용해시켜 도데실-Si QD 용액(15 mg/mL)을 제조했습니다. 그런 다음 20 mg DSPE-PEG-COOH를 10 mL 탈염수에 용해 혼합하여 DSPE-PEG-COOH 용액(2 mg/mL, 10 mL)을 제조했습니다. 이후 도데실-Si QD 용액(15 mg/mL, 66 µL)을 10 mL DSPE-PEG-COOH 용액에 방울방울 천천히 첨가했습니다. 3분간 초음파 교반 후 맑고 투명한 용액을 얻었습니다. 이후 흄후드에서 암실에서 12시간 교반했습니다. 이후 24시간 투석하고 3일간 동결건조하여 Si QD 미셀을 얻었습니다.
본 연구에서는 EDC로 카복실기를 활성화하여 CKAP4 항체를 Si QD 미셀과 결합시켰습니다[14]. 방법은 다음과 같습니다: 4 mg Si QD 미셀을 900 µL PBS에 분산시켜 Si QD 미셀 용액을 제조했습니다. EDC(10 mg)를 100 µL PBS에 첨가해 EDC 용액을 제조했습니다. 그런 다음 100 µL EDC 용액을 900 µL Si QD 미셀에 천천히 첨가하고 5분간 초음파 교반했습니다.さらに, 20 µL CKAP4 항체를 천천히 첨가하고 암실에서 실온에서 2시간 교반했습니다. 생성물을 4000 rpm으로 15분 초여과했습니다. PBS로 3회 세척 후 생성물을 Si QD 미셀-CKAP4라 칭했습니다.
본 연구에서는 트립판 블루로 나노물질의 생체적합성을 테스트했습니다[15]. A549와 293 T 세포를 24웰 플레이트(1 × 10⁶/well)에 37°C에서 12시간 배양했습니다. 배양액을 버린 후, Si QD 미셀 또는 Si QD 미셀-CKAP4의 일련의 농도(Si 농도: 0~152 µg/mL)를 24웰 플레이트에 첨가하고 37°C에서 2시간 배양했습니다. 배양액을 버린 후 세포를 수집하고 PBS로 2회 세척했습니다. 트립판 블루를 세포 현탁액과 1:1 비율로 혼합했습니다. 살아있는 세포와 죽은 세포 수를 Countstar로 검출 기록했습니다. 세포 생존율(%) = 살아있는 세포 수/(살아있는 세포 수 + 죽은 세포 수) × 100. 3회 생물학적 반복을 사용했습니다. Prism 소프트웨어(버전 7.01, GraphPad Software, San Diego, CA, USA)로 통계 분석했습니다. 데이터는 Dunnett 사후 검정을 동반한 양방향 ANOVA로 분석했습니다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정했습니다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.
Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4의 폐암 세포 in vitro 표적 능력을 다음과 같이 검출했습니다: 먼저 A549 세포를 레이저 공초점 접시(3 × 10⁵ cells/dish)에 37°C에서 12시간 배양했습니다. 배양액을 버린 후 세포를 PBS로 3회 세척했습니다. 이후 1 mL 파라포름알데히드(4%)를 첨가하고 25°C에서 10분 배양했습니다. 파라포름알데히드를 버린 후 PBS로 3회 세척했습니다. 다음 1 mL 트리톤 X-100 함유 면역염색 투과 버퍼를 첨가하고 25°C에서 10분 배양했습니다. 버퍼를 버린 후 PBS로 3회 세척했습니다. 이후 1 mL 면역염색 차단 버퍼를 첨가하고 25°C에서 10분 배양했습니다. 버퍼를 버린 후 PBS로 3회 세척했습니다. 그런 다음 200 µL Si QD 미셀 또는 Si QD 미셀-CKAP4(Si 농도 150 μg/mL)를 첨가하고 37°C에서 2시간 배양했습니다. 나노물질을 버린 후 PBS로 3회 세척했습니다. 레이저 공초점 현미경(Leica, Wetzlar, Germany)으로 사진을 촬영했습니다. 흥분광은 405 nm, 방출 파장은 630 nm로 설정했습니다.
Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4의 정상 세포 in vitro 표적 능력은 다음과 같이 검출했습니다: 먼저 293 T 세포를 1.5 mL Eppendorf 튜브에 1 × 10⁶ cells/tube 밀도로 수집했습니다. 1000 rpm으로 5분 원심분리 후 상층액을 버렸습니다. 다음 1 mL 파라포름알데히드(4%)를 첨가하고 실온에서 10분 배양했습니다. 1000 rpm으로 5분 원심분리 후 상층액을 버렸습니다. 세포를 PBS로 3회 세척했습니다. 그런 다음 1 mL 트리톤 X-100 함유 면역염색 투과 버퍼를 첨가하고 25°C에서 10분 배양했습니다. 1000 rpm으로 5분 원심분리 후 상층액을 버리고 PBS로 3회 세척했습니다. 이후 1 mL 면역염색 차단 버퍼를 첨가하고 25°C에서 10분 배양했습니다. 1000 rpm으로 5분 원심분리 후 상층액을 버리고 PBS로 3회 세척했습니다. 이후 200 µL Si QD 미셀 또는 Si QD 미셀-CKAP4(Si 농도 150 μg/mL)를 첨가하고 37°C에서 2시간 배양했습니다. 1000 rpm으로 5분 원심분리 후 상층액을 버리고 침전물을 PBS로 3회 세척했습니다. 세포를 수확하여 현미경 슬라이드를 제조했습니다. 레이저 공초점 현미경으로 현미경 검사를 수행했습니다. 흥분광은 405 nm, 방출 파장은 630 nm로 설정했습니다.
3회 독립 실험을 수행했습니다. 평균 형광 강도의 정량 분석은 ImageJ 소프트웨어(Bethesda, MD, USA)로 수행했습니다. Prism 소프트웨어(버전 7.01)로 통계 분석했습니다. 데이터는 Dunnett 사후 검정을 동반한 일원 ANOVA로 분석했습니다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정했습니다. ***P < 0.001.
10마리 수컷 누드 마우스(5~6주령)를 Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 구매했습니다. 모든 마우스는 Tongji 대학 실험동물센터(Shanghai, China)에서 특정 병원체 자유(SPF) 조건으로 사육했습니다. 종양 보유 마우스 모델 구축을 위해 마우스에 1 × 10⁶ A549 세포를 피하 주사했습니다. 종양 직경이 6 mm에 도달하면 실험에 사용했습니다. 모든 마우스 실험은 기관 지침에 따라 수행되었으며 Tongji 대학 실험동물 사용 및 관리 위원회 승인을 받았습니다.
종양 보유 마우스를 마취 하에 희생시켰습니다. 종양과 정상 폐 조직을 수집하여 파라핀 절편을 제조했습니다. 탈수, 항원 회수, 혈청 차단 후 Si QD 미셀 또는 Si QD 미셀-CKAP4(Si 농도 150 µg/mL)를 조직에 첨가하고 37°C에서 2시간 배양했습니다. 나노물질을 버린 후 PBS로 3회 세척했습니다. 조직을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 10분 염색했습니다. PBS로 3회 세척 후 항페이드 매질을 첨가하고 25°C에서 5분 배양했습니다. 항페이드 매질을 버린 후 PBS로 3회 세척했습니다. 형광 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 흥분 파장 405 nm, 방출 파장 630 nm에서 사진을 촬영했습니다. 3회 독립 실험을 수행했습니다. 평균 적색 형광 강도의 정량 분석은 ImageJ 소프트웨어로 수행했습니다. Prism 소프트웨어(버전 7.01)로 통계 분석했습니다. 데이터는 Dunnett 사후 검정을 동반한 일원 ANOVA로 분석했습니다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정했습니다. ***P < 0.001.
실험에서 9마리 종양 보유 마우스를 3그룹(Si QD 미셀-CKAP4 주입 그룹, Si QD 미셀 주입 그룹, 생리식염수 주입 그룹)으로 나누었습니다. Si QD 미셀-CKAP4 주입 그룹 마우스에 200 µL Si QD 미셀-CKAP4(Si: 4 mg/kg)를 정맥 주사했습니다. Si QD 미셀 주입 그룹 마우스에 200 µL Si QD 미셀(Si: 4 mg/kg)을 정맥 주사했습니다. 생리식염수 주입 그룹 마우스에 200 µL 생리식염수를 정맥 주사했습니다. 서로 다른 시간점(0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 h)에서 형광 이미지를 획득했습니다. Si QD 미셀-CKAP4 주입 그룹 마우스를 4시간에 마취 및 안락사시켜 심장, 간, 비장, 폐, 신장, 종양의 형광 신호를 검출했습니다. 본 연구에서 VISQUE Invivo Smart-LF(VIEWORKS, Gyeonggi-do, Korea)로 PE 필터 세트(λ_excitation 450~500 nm, λ_emission 600~650 nm)를 사용하여 형광 영상을 수행했습니다. Prism 소프트웨어(버전 7.01)로 통계 분석했습니다. 데이터는 Dunnett 사후 검정을 동반한 일원 ANOVA로 분석했습니다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정했습니다. *P < 0.05; **P < 0.01.
본 연구에서 12마리 종양 보유 마우스에 생리식염수(200 µL), Si QD 미셀(Si: 4 mg/kg, 200 µL), 또는 Si QD 미셀-CKAP4(Si: 4 mg/kg, 200 µL)를 꼬리 정맥으로 주사했습니다. 24시간 후 마우스를 안락사시켰습니다. 심장, 간, 비장, 폐, 신장에 H&E 염색을 수행했습니다. 광학 현미경으로 병리적 변화를 관찰했습니다[14, 16].
먼저, 기존 보고[12]에 따라 수소실릴화 반응으로 도데실-Si QD를 제조했습니다(Scheme 1, Step 1). 보고된 데이터와 유사하게 우리 그룹에서 합성한 도데실-Si QD는 메틸벤젠에 잘 분산되었습니다[12]. TEM 결과 도데실-Si QD는 비교적 균일한 크기의 구형이었습니다. ImageJ 소프트웨어로 TEM 이미지의 도데실-Si QD 크기를 측정했습니다. 데이터에 따르면 도데실-Si QD 직경은 4.1~5.3 nm 범위, 평균 직경 약 4.7 nm였습니다(그림 1a). 도데실-Si QD 확대 이미지에서 명확한 격자 무늬를 관찰할 수 있습니다(그림 1a). 본 연구에서 ImageJ 소프트웨어로 격자 간격을 측정했습니다. 데이터에 따르면 격자 무늬 간 평균 거리는 약 0.35 nm로, 기존 보고된 도데실-Si QD(0.34 nm)와 거의 동일합니다. 따라서 본 연구에서 합성된 도데실-Si QD는 좋은 결정성을 보였습니다[12]. 동적 광산란(DLS) 결과 도데실-Si QD의 수직경은 4.8~13.5 nm 범위, 평균 6.5 nm였습니다(그림 1b).
Si QD 미셀-CKAP4 제조 및 폐암 조직 표적 생체 영상 개략도
a 도데실-Si QD TEM 이미지; b 도데실-Si QD 수직경 분포; c Si QD 미셀 TEM 이미지; d Si QD 미셀 수직경 분포; e Si QD 미셀-CKAP4 TEM 이미지; f Si QD 미셀-CKAP4 수직경 분포; g Si QD 미셀 C1s XPS 스펙트럼; h Si QD 미셀-CKAP4 C1s XPS 스펙트럼
물분산성 Si QD 미셀 제조를 위해 도데실-Si QD를 DSPE-PEG-COOH의 자기조립으로 수정했습니다(Scheme 1, Step 2)[12]. 여기에서 F127 대신 DSPE-PEG-COOH를 사용하여 표면에 카복실기를 가진 Si QD 미셀을 제조했습니다. 결과적으로 Si QD 미셀이 물에 잘 분산되었습니다. TEM 이미지에서 Si QD 미셀은 Si QD가 삽입된 구형 입자였습니다. Si QD 미셀 직경은 22.7~54.6 nm 범위, 평균 직경 약 34.3 nm였습니다(그림 1c). DLS 결과 Si QD 미셀의 수직경은 43.8~615.9 nm 범위, 평균 58.7 nm였습니다(그림 1d). Si QD 미셀의 평균 제타 전위는 약 -20.7 mV였습니다. 본 연구에서 FTIR로 Si QD 미셀 조성을 조사했습니다(추가 파일 1: Figure S1A). 데이터에 따르면 N-H, C-H, O-H, C=O의 신축 진동 흡수 피크가 각각 3430, 2920, 2850, 1640 cm⁻¹에, C-H와 O-H의 굽힘 진동 흡수 피크가 각각 1460, 1400 cm⁻¹에, Si-C, C-O, P-O-C의 신축 진동 흡수 피크가 각각 1250, 1100, 951 cm⁻¹에, Si-H와 O=C-N의 굽힘 진동 흡수 피크가 각각 850, 526 cm⁻¹에 나타났습니다. 이 데이터는 DSPE-PEG-COOH의 특성 기(N-H, O-H, C=O, C-O, P-O-C, O=C-N)와 도데실-Si QD의 특성 기(Si-C, Si-H)가 Si QD 미셀 FTIR 스펙트럼에서 발견됨을 보여주며, 도데실-Si QD가 DSPE-PEG-COOH 자기조립 미셀에 성공적으로 캡슐화되었음을 나타냅니다. 또한 Si QD 미셀을 XRD로 특성화했습니다(추가 파일 1: Figure S1B). Si QD 미셀의 회절 피크가 날카로워 결정성이 좋음을 나타냅니다. XRD 패턴에서 2θ 27.073, 28.451, 56.598, 73.145의 피크는 실리콘의 (100), (002), (112), (203) 결정면에 해당합니다(PDF #80-0005), Si QD가 Si QD 미셀에 성공적으로 캡슐화되었음을 나타냅니다. 2θ 31.692, 45.431, 66.200, 75.260, 83.955의 피크는 NaCl의 (200), (220), (400), (420), (422) 결정면에 해당합니다(PDF #77-2064). Si QD 미셀에 NaCl이 존재하는 합리적 설명은: Si QD 미셀 제조 후 PBS에 용해시켰기 때문에 NaCl이 존재할 수 있습니다.
UV-가시광 흡수 스펙트럼에서 Si QD 미셀 흡수는 200~500 nm 범위였습니다(그림 2a). 330 nm 흥분 파장에서 Si QD 미셀 형광 방출 스펙트럼에서 650 nm에서 강한 형광이 관찰되었습니다(그림 2b). Si QD 미셀 수용액(Si 농도: 80 µg/mL)은 자연광에서 투명하고 맑았으나 365 nm 자외선에서 강한 적색 형광을 방출했습니다(그림 2c). 본 연구에서 절대 PL QY를 형광 분광계(FLS1000)로 테스트했습니다. 흥분 파장은 365 nm였습니다. 데이터에 따르면 Si QD 미셀의 절대 PL QY는 약 14.49%였습니다.
a Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4의 UV-가시광 흡수 스펙트럼; b Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4의 형광 방출 스펙트럼; c 자연광(좌)과 365 nm 자외선(우)에서 Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4 이미지
EDC로 CKAP4 항체를 Si QD 미셀과 결합시켰습니다(Scheme 1, Step 3)[14]. TEM 이미지에서 Si QD 미셀-CKAP4는 Si QD가 삽입된 구형 입자였습니다. Si QD 미셀-CKAP4 직경은 24.4~67.7 nm 범위, 평균 직경 약 35.5 nm였습니다(그림 1e). DLS 결과 Si QD 미셀-CKAP4의 수직경은 58.7~824.9 nm 범위, 평균 78.8 nm로 Si QD 미셀보다 약간 컸습니다(그림 1f). 이 증가는 CKAP4 항체 결합 때문일 수 있습니다. C1s XPS 스펙트럼에서 C1s 영역에 6종류의 탄소 원자가 나타났습니다: C(O)O(288.81 eV), C=O(286.5 eV), C-O(285.76 eV), C-N(285.25 eV), C-C(284.88 eV), C-H(284.34 eV)(그림 1g). 그러나 Si QD 미셀-CKAP4 XPS 스펙트럼에서 C(O)O 피크가 거의 사라져 카복실기와 일차 아민 간 결합이 성공했음을 나타내며, 따라서 CKAP4 항체가 Si QD 미셀과 성공적으로 결합되었습니다(그림 1h). Si QD 미셀-CKAP4의 평균 제타 전위는 약 -10.7 mV로 Si QD 미셀보다 높았습니다. 이 현상에 대한 설명: Si QD 미셀 표면에 많은 카복실기가 있어 강한 음전성을 띠지만, Si QD 미셀-CKAP4에서 CKAP4 항체 결합으로 표면 카복실기가 감소하여 평균 제타 전위가 증가했습니다.
UV-가시광 흡수 스펙트럼에서 Si QD 미셀-CKAP4 흡수는 200~500 nm 범위로 Si QD 미셀 결과와 유사했습니다(그림 2a). 330 nm 흥분 파장에서 Si QD 미셀-CKAP4 형광 방출 스펙트럼에서 640 nm에서 강한 형광이 관찰되었습니다(그림 2b). 이 결과는 항체 결합이 Si QD 미셀-CKAP4 형광 특성에 유의미한 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. Si QD 미셀-CKAP4 수용액(Si 농도: 80 µg/mL)은 자연광에서 투명하고 맑았으며, 365 nm 자외선에서 강한 적색 형광을 방출하여 Si QD 미셀 결과와 일치했습니다(그림 2c). PL QY 테스트 결과 Si QD 미셀-CKAP4의 절대 PL QY는 약 16.96%였습니다.
인간 폐암 세포주 A549와 인간 신장 상피 세포주 293 T를 표적 세포로 사용하여 Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4의 생체적합성을 조사했습니다. 본 연구에서 Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4의 서로 다른 농도(Si 농도 0, 2.375, 4.75, 9.5, 19, 38, 76, 152 µg/mL)를 먼저 A549 또는 293 T 세포와 37°C에서 2시간 배양했습니다. 세포 생존율을 트립판 블루로 검출했습니다(그림 3)[15]. GraphPad 소프트웨어로 Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4의 ID50을 얻었습니다. 데이터에 따르면 Si QD 미셀의 ID50은 A549와 293 T 세포에서 152 µg/mL 초과였습니다. Si QD 미셀-CKAP4의 ID50은 A549 세포에서 25.94 µg/mL, 293 T 세포에서 72.69 µg/mL였습니다. 이 결과는 Si QD 미셀-CKAP4의 세포독성이 Si QD 미셀보다 유의미하게 높고, A549 세포에서 293 T 세포보다 유의미하게 높음을 나타냅니다. 이 현상은 보체 의존성 세포독성 때문일 수 있습니다[17]. 또한 이 결과는 Si QD 미셀-CKAP4가 정상 세포보다 폐암 세포에서 더 높은 생물학적 안전성을 보임을 나타내며, 이는 in vivo 응용의 기반이 됩니다.
A549 a와 293 T b의 세포 생존율: Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4의 서로 다른 농도(Si 농도: 0, 2.375, 4.75, 9.5, 19, 38, 76, 152 µg/mL)로 2시간 배양(n=3; 평균±SD; 양방향 ANOVA with Dunnett 사후 검정; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)
Si QD 미셀-CKAP4의 폐암 세포 in vitro 표적 기능을 더 조사하기 위해 A549와 293 T 세포를 표적 세포로 사용했습니다. Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4를 먼저 A549와 293 T 세포와 37°C에서 2시간 배양했습니다. 표적 효과를 레이저 공초점 현미경으로 검출했습니다(그림 4). 결과적으로 Si QD 미셀-CKAP4 배양 A549의 적색 형광이 Si QD 미셀-CKAP4+293 T 공동 배양 그룹, Si QD 미셀+A549 공동 배양 그룹, Si QD 미셀+293 T 공동 배양 그룹보다 유의미하게 높았습니다. 이 결과는 Si QD 미셀-CKAP4가 in vitro에서 A549 세포를 특이적으로 표적화할 수 있음을 나타냅니다.
Si QD 미셀-CKAP4의 A549 세포 in vitro 표적 능력 검출. a A549와 293 T를 Si QD 미셀-CKAP4와 Si QD 미셀(Si 농도 150 µg/ml)과 37°C에서 2시간 배양. 상층액 제거 및 2회 세척 후 공초점 레이저 주사 현미경으로 촬영(Bar, 25 µm). b ImageJ로 측정한 평균 형광 강도 정량 분석(n=3; 평균±SD; 일원 ANOVA with Dunnett 사후 검정; ***P<0.001)
Si QD 미셀-CKAP4의 폐암 조직 표적 가능성을 탐구하기 위해 A549 조직에 대한 Si QD 미셀-CKAP4 표적 특성을 검증하는 in vitro 실험을 설계했습니다. 본 연구에서 A549 세포를 마우스에 피하 접종했습니다. 종양 형성 후 A549 종양 조직과 정상 폐 조직을 수집하여 Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4와 37°C에서 2시간 배양했습니다. 표적 효과를 레이저 공초점 현미경으로 검출했습니다(그림 5). 결과적으로 Si QD 미셀-CKAP4 배양 A549 조직이 405 nm 흥분 파장에서 강한 적색 형광을 방출했습니다. 그러나 Si QD 미셀 배양 A549 조직, Si QD 미셀-CKAP4 배양 정상 폐 조직, Si QD 미셀 배양 정상 폐 조직에서는 약한 적색 형광만 관찰되었습니다. Si QD 미셀-CKAP4 배양 A549 조직의 적색 형광이 다른 세 그룹보다 유의미하게 높았습니다. 이 데이터는 Si QD 미셀-CKAP4가 in vitro에서 폐암 조직을 효과적으로 표적화할 수 있음을 나타내며, 잠재적 폐암 형광 조영제가 될 것으로 기대됩니다.
Si QD 미셀-CKAP4의 A549 조직 in vitro 표적 능력 검출. a A549 조직과 정상 폐 조직을 Si QD 미셀-CKAP4와 Si QD 미셀(Si 농도: 150 µg/ml)과 37°C에서 2시간 배양. 2회 세척 후 DAPI로 핵 염색. 공초점 레이저 주사 현미경으로 촬영(Bar, 200 µm). b ImageJ로 측정한 평균 적색 형광 강도 정량 분석(n=3; 평균±SD; 일원 ANOVA with Dunnett 사후 검정; ***P<0.001)
9마리 종양 보유 마우스를 3그룹(Si QD 미셀-CKAP4 주입 그룹, Si QD 미셀 주입 그룹, 생리식염수 주입 그룹)으로 나누었습니다. Si QD 미셀-CKAP4 주입 그룹 마우스에 200 µL Si QD 미셀-CKAP4(Si: 4 mg/kg) 정맥 주사. Si QD 미셀 주입 그룹 마우스에 200 µL Si QD 미셀(Si: 4 mg/kg) 정맥 주사. 생리식염수 주입 그룹 마우스에 200 µL 생리식염수 정맥 주사. 서로 다른 시간점(0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 h)에서 형광 이미지 획득. 3그룹 모든 마우스 폐암 조직에서 유의미한 형광 신호는 관찰되지 않았습니다(데이터 미표시). 이는 Si QD 미셀-CKAP4와 Si QD 미셀의 약한 형광 투과 때문일 수 있습니다.
Si QD 미셀-CKAP4 주입 그룹 마우스를 4시간에 마취 및 안락사시켜 심장, 간, 비장, 폐, 신장, 종양의 형광 신호 검출. 데이터에 따르면 간, 신장, 종양 조직에서 유의미한 형광 신호 관찰. 그러나 심장, 비장, 정상 폐 조직에서는 유의미한 형광 신호 없음(그림 6). 간과 신장에서의 유의미한 형광 신호는 Si QD 미셀-CKAP4가 간에서 대사되고 신장에서 배설됨을 나타냅니다. 또한 A549 종양 조직에서 형광 신호가 정상 폐 조직보다 유의미하게 높았습니다. 이 현상은 Si QD 미셀-CKAP4의 폐암 조직 표적 능력에 기인합니다. 이 결과는 Si QD 미셀-CKAP4가 폐암 조직을 특이적으로 표적화함을 나타내며, 향후 폐암 수술 내비게이션용 형광 조영제로 기대됩니다.
a Si QD 미셀-CKAP4 주입 마우스의 심장, 간, 비장, 폐, 신장, 종양 밝은 사진. b 형광 사진. c 심장, 간, 비장, 폐, 신장, 종양 조직 상대 형광 강도(n=3; 평균±SD; 일원 ANOVA with Dunnett 사후 검정; *P<0.05; **P<0.01)
마지막으로 Si QD 미셀-CKAP4의 in vivo 급성 독성을 조사했습니다. 본 연구에서 종양 보유 마우스(n=12)에 생리식염수(200 µL), Si QD 미셀(Si: 4 mg/kg, 200 µL), Si QD 미셀-CKAP4(Si: 4 mg/kg, 200 µL)를 정맥 주사하고 24시간 후 안락사시켰습니다. 심장, 간, 비장, 폐, 신장의 H&E 염색 이미지는 그림 7에 나와 있습니다. 생리식염수 주입 마우스와 비교하여 Si QD 미셀 주입 마우스와 Si QD 미셀-CKAP4 주입 마우스의 주요 장기에서 뚜렷한 병리적 변화 없었습니다. 위 데이터는 Si QD 미셀(Si: 4 mg/kg)과 Si QD 미셀-CKAP4(Si: 4 mg/kg)가 in vivo에서 유의미한 독성이 없음을 나타냅니다.
생리식염수, Si QD 미셀(Si: 4 mg/kg), Si QD 미셀-CKAP4(Si: 4 mg/kg) 주입 24시간 후 종양 보유 마우스의 심장, 간, 비장, 폐, 신장 H&E 염색 이미지(배율: 200×)
현재 수술 내비게이션용 광학 조영제로 다양한 형광 나노물질이 설계 및 합성되었습니다[3, 4]. 2020년 On 등은 형광체[인다시아닌 그린(ICG) 또는 시아닌 5.5(Cy5.5)] 결합 글리콜 키토산 나노입자(CNPs)를 폐암 수술 내비게이션용 형광 조영제로 제조했습니다[18]. 그러나 Si QD를 이용한 폐암 수술 내비게이션용 형광 조영제 제조 보고는 없습니다.
본 연구에서는 폐암 조직 표적 영상이 가능한 Si QD 미셀-CKAP4를 성공적으로 합성했습니다. Si QD 미셀-CKAP4는 향후 폐암 수술 내비게이션용 광학 조영제로 사용될 것으로 기대됩니다. Si QD 미셀-CKAP4의 장점은 다음과 같습니다: (1) Si QD를 이용하여 폐암 수술 내비게이션용 형광 조영제를 최초로 합성하여 폐암 수술 내비게이션 도구 라이브러리의 도구 상자를 확장했습니다. (2) Pi 등이 보고한 물분산성 Si QD 미셀을 최적화하여 Si QD 미셀에 표적 능력을 부여했습니다[12]. 이는 Si QD의 생물의학 분야 적용에 새로운 가능성을 제공합니다. (3) Si QD 미셀-CKAP4의 폐암 표적 원리는 폐암 조직에서 CKAP4 단백질 고발현에 기반합니다. CKAP4 항체 결합으로 Si QD 미셀-CKAP4가 능동적으로 폐암 조직을 표적화할 수 있습니다. EPR 효과로 종양을 수동적으로 표적하는 나노물질과 비교하여 Si QD 미셀-CKAP4는 폐암 조직에 더 강한 특이성을 보입니다. (4) Si QD 미셀-CKAP4는 특정 농도 범위에서 종양 세포에 선택적 독성을 보입니다. 따라서 합리적 약물 농도 범위에서 Si QD 미셀-CKAP4는 높은 생물학적 안전성을 보이며 잠재적 임상 적용 가치를 입증합니다.
본 연구에서 PL QY 테스트 결과 Si QD 미셀 절대 PL QY는 약 14.49%, Si QD 미셀-CKAP4 절대 PL QY는 약 16.96%였습니다. Pi 등의 연구에 따르면 도데실-Si QD PL QY는 약 26%로, 700 nm 미만 PL 피크를 가진 적색 발광 Si QD로는 매우 높았습니다[12, 19, 20]. 그러나 본 연구 Si QD 미셀 PL QY는 약 14.49%로 도데실-Si QD보다 낮았습니다. 이는 에멀전 공정 중 도입된 표면 결함 때문일 수 있으며, Pi 등이 보고한 Si-QD 미셀(F127 자기조립 미셀에 캡슐화된 도데실 패시베이션 Si QD)에서 PL QY 감소와 거의 일치합니다[12, 21]. 본 연구에서 Si QD 미셀-CKAP4 PL QY는 약 16.96%로 Si QD 미셀(14.49%)보다 약간 높았습니다. 이는 Si QD 미셀-CKAP4에서 CKAP4 항체 결합이 Si QD 미셀 일부 표면 결함을 복구하여 PL QY를 약간 향상시켰기 때문일 수 있습니다.
우리 모두 알다시피 Si QD 생체 영상 응용에는 도전 과제가 있습니다: Si 자체는 독성이 적지만, Si 입자 크기가 일정 수준 이하로 감소하면 세포독성을 나타낼 수 있습니다. 본 연구에서 세포독성 테스트 결과 Si QD 미셀-CKAP4가 9.5~19 µg/mL에서 폐암 세포에 선택적 세포독성을 보였습니다. 따라서 CKAP4 항체 결합 결과 Si QD 미셀-CKAP4의 정상 세포 세포독성이 폐암 세포보다 유의미하게 낮아, Si QD 미셀-CKAP4 생물학적 응용에 강력한 조건을 제공합니다.
본 연구에서 인간 폐암 세포주 A549와 인간 신장 상피 세포주 293 T를 표적 세포로 사용하여 Si QD 미셀과 Si QD 미셀-CKAP4 표적 능력을 조사했습니다. A549와 293 T 세포는 각각 부착성, 반부착성 세포입니다. 실험 중 반복 원심분리와 세척으로 293 T 세포 수가 감소했습니다. 따라서 그림 4에서 293 T 세포 수가 A549 세포보다 적게 보입니다.
또한 A549 세포가 p53 야생형 폐암 세포주임을 유의해야 합니다. 따라서 A549 세포만으로는 Si QD 미셀-CKAP4의 폐암 표적 능력을 완전히 반영할 수 없습니다. 향후 p53 음성 세포주(예: H1299)에서 Si QD 미셀-CKAP4 표적 능력과 영상 효과를 테스트하여 임상 적용을 위한 확실한 실험적 기반을 제공할 예정입니다[22].
본 연구에서는 Pi 등이 보고한 Si QD 미셀을 개량 및 수정하여 물분산성 Si QD 미셀-CKAP4를 제조했습니다. Si QD 미셀-CKAP4는 평균 수직경 약 78.8 nm의 구형 입자였습니다. Si QD 미셀-CKAP4의 UV-가시광 흡수는 200~500 nm 범위였습니다. 330 nm 흥분 파장에서 형광 방출 스펙트럼에서 640 nm에서 강한 형광이 관찰되었습니다. Si QD 미셀-CKAP4는 in vitro와 in vivo에서 폐암 세포와 폐암 조직에 좋은 표적 능력을 보였습니다. 또한 in vivo 형광 영상 분석에서 Si QD 미셀-CKAP4가 간에서 대사되고 신장에서 배설됨을 보였습니다. 세포독성과 H&E 염색 분석 결과 Si QD 미셀-CKAP4가 in vitro와 in vivo에서 높은 생체적합성을 보였습니다. Si QD 미셀-CKAP4는 폐암 특이적 표적 영상제이며 향후 폐암 수술 내비게이션용 형광 조영제로 기대됩니다.
현재 작업의 데이터와 분석은 합리적 요청 시 교신 저자로부터 이용 가능합니다.
나노물질
요약 비소세포폐암(NSCLC)은 전 세계에서 두 번째로 많이 진단되는 악성 종양입니다. 암 치료 전략 개발을 위한 나노물질 연구의 일환으로, 본 연구에서는 우수한 시너지 광열/광역학 특성을 가진 새로운 CoFe₂O₄ 양자점(QDs)을 구축했습니다. 이 나노물질은 명백한 독성 없이 NSCLC를 효율적으로 억제했습니다. CoFe₂O₄-QDs와 근적외선(NIR) 조사 병용이 NSCLC 세포의 세포사멸을 유도함을 보였습니다. 또한 이 병용 치료가 PI3K/AKT 경로 조절을 통해 활성산소종(ROS) 생성을 촉진해 세포사를 유발함을 확인했습
초록 빠르고 통제 불가능한 세포 성장이 합병증과 조직 기능 장애를 유발하는 질병인 암의 유병률 증가는 과학자와 의사들에게 심각하고 긴급한 관심사 중 하나입니다. 요즘 암 진단과 특히 효과적인 치료는 지난 세기 보건의료 분야에서 가장 큰 도전 과제 중 하나로 여겨지고 있습니다. 약물 발견과 전달에서 상당한 발전에도 불구하고, 많은 부작용과 불충분한 특이성 및 민감성은 보통 건강한 조직과 장기에 손상을 주어 약물 사용에 큰 장벽이 되어왔습니다. 이러한 치료제의 투여 기간과 양의 제한도 도전적입니다. 반면, 화학요법과 방사선요법 같은 전
