황금 나노 입자의 생물 제조 및 세포 독성 평가를 위한 쑥, 마치현 및 심상추 추출물의 항산화 잠재력

결과 및 토론

추출물의 항산화 활성

각 식물의 공중 부분의 수성 추출물을 초음파 처리하여 얻었다. A의 추출 수율. 모세혈관 , 피. 올레라시아 , 및 P. 저속한 각각 14.1%, 39.12%, 28.6%였다. 가장 높은 추출 수율은 P에 표시되었습니다. 올레라시아 , 뒤에 P. 저속한 그리고 마지막으로 A. 모세혈관 . 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위해 자유 라디칼 소거 활성, 환원력 및 총 페놀 함량을 측정했습니다. 추출물의 자유 라디칼 소거 활성은 DPPH 및 ABTS 분석에 의해 결정되었습니다. DPPH 라디칼은 항산화제에 의해 환원될 때 흡광도를 잃는 안정적인 자유 라디칼이기 때문에 DPPH는 페놀 화합물의 항산화 활성을 평가하는 데 널리 사용됩니다. ABTS 분석은 ABTS와 강한 산화제의 반응에 의해 생성된 라디칼을 소거하는 항산화제의 능력을 측정합니다. 수소 공여 특성을 가진 항산화제에 의한 ABTS 라디칼의 흡광도 감소가 평가됩니다. 수성 추출물은 용량 의존적으로 소거 활성을 나타냈다. 테스트된 농도(15.63μg/mL, 31.25μg/mL, 62.5μg/mL, 125μg/mL 및 250μg/mL)에서 P. 저속한 (IC₅₀ DPPH 라디칼에 대해 50.35 ± 1.22μg/mL; IC₅₀ ABTS 라디칼에 대해 38.6 ± 0.44 μg/mL)가 DPPH 및 ABTS 라디칼에 대해 가장 강력한 활성을 나타내었고 그 다음으로 A 추출물이었다. 모세혈관 (IC₅₀ DPPH 라디칼에 대해 156.72 ± 0.97μg/mL; IC₅₀ ABTS 라디칼에 대해 147.28 ± 2.95μg/mL), 그 다음 P. 올레라시아 (IC₅₀ DPPH 라디칼에 대해 247.33 ± 1.57μg/mL; IC₅₀ ABTS 라디칼에 대해 305.54 ± 4.86μg/mL). 특히, P. 저속한 BHT보다 더 강력한 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 나타냄(IC₅₀ 71.37 ± 0.84μg/mL), 이는 표준으로 사용되었습니다(표 1 및 그림 1a, b). P의 추출물. 저속한 세 가지 추출물 중 가장 높은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 보였다. 이 결과는 P에 더 많은 항산화 화합물이 존재할 가능성이 있음을 의미합니다. 저속한 A보다. 모세혈관 및 P. 올레라시아.

A의 수성 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 및 환원력. 모세혈관 , 피. 올레라시아 , 및 P. 저속한 . 아 DPPH 라디칼 소거 활동. ㄴ ABTS 과격한 청소 활동. ㄷ 추출물의 힘을 줄입니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 별표는 표준(BHT 또는 비타민 C)에 대한 차이의 중요성을 나타냅니다. *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001. 결과는 세 가지 독립적인 실험을 나타냅니다.

우리는 또한 via 추출물의 항산화 활성을 조사했습니다. 환원력 분석. 항산화제가 있는 경우 페리시안화칼륨(Fe ³⁺ )는 페로시안화칼륨(Fe ²⁺ )으로 전환됩니다. ), 이것은 염화 제2철과 반응하여 제2철-제1철 복합체를 형성합니다. ferric-ferrous complex는 700nm에서 최대 흡광도를 가지며, 이는 항산화제의 환원력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 현재 보고서에서 환원력은 700nm에서 흡광도가 0.7인 각 추출물의 농도(μg/mL)로 표시됩니다. 그림 1c와 같이 P. 저속한 (162.98 μg/mL)는 A보다 현저히 높은 환원력을 발휘했습니다. 모세혈관 (235.38μg/mL) 및 P. 올레라시아 (396.16μg/mL). 앞에서 언급한 바와 같이 환원력의 결과는 P에 더 많은 항산화 화합물이 존재할 가능성이 있음을 나타냅니다. 저속한 A보다. 모세혈관 및 P. 올레라시아.

각 추출물의 총 페놀 함량도 조사했습니다. 페놀 화합물은 잠재적인 항산화제이며 하이드록실 그룹으로 인해 라디칼을 제거하는 능력을 가지고 있다는 것은 잘 알려져 있습니다. 따라서 식물 추출물의 항산화 활성은 페놀 함량과 잘 관련될 수 있습니다. 갈산을 사용하여 표준 검량선을 작성했으며 이 곡선은 선형 관계(y =6.0617x + 0.1293, r ² =0.9983). 표준 곡선을 사용하여 총 페놀 함량을 계산하고 추출물 그램당 갈산 당량(GAE) 밀리그램으로 표시합니다. 추출물의 총 페놀 함량은 P에 대해 90.53 ± 6.81mg GAE/g이었습니다. 저속한 , A의 경우 39.88 ± 4.55mg GAE/g 모세혈관 , 및 P의 경우 18.32 ± 2.76mg GAE/g. 올레라시아 . 총 페놀 함량은 P에서 가장 높았다. 저속한 세 가지 추출 중.

총 페놀 함량과 라디칼을 소거하는 추출물의 능력 또는 환원력 사이에는 양의 상관관계가 있었습니다. 종합하면, A의 수성 추출물. 모세혈관 , 피. 올레라시아 , 및 P. 저속한 상당한 항산화 활성을 보였다. 특히, P. 저속한 DPPH와 ABTS 라디칼 모두에 대해 가장 큰 라디칼 소거능, 가장 강한 환원력, 가장 높은 총 페놀 함량을 나타내어 P. 저속한 AuNPs의 biofabrication을 위한 환원제로서 가장 강력한 활성을 발휘할 것입니다. 세 가지 추출물을 사용한 AuNPs의 생체 제조의 이러한 흥미로운 결과는 다음 섹션에서 논의될 것입니다.

AC-AuNP, PO-AuNP 및 PV-AuNP의 생물 제작

우리는 추출물의 항산화 활성이 AuNPs의 생체 제조 과정에 큰 영향을 미친다고 제안했습니다. 항산화 활성이 Au 염을 AuNP로 환원시키는 주요 원동력이기 때문에 P. 저속한 , 가장 높은 항산화 활성을 갖는 가 가장 효율적인 환원제가 될 수 있다. AuNPs는 가시광선-근적외선 파장 범위에서 독특한 SPR을 가지고 있기 때문에 생물 가공 공정은 UV-가시광선 분광광도법으로 이어졌습니다. AuNPs의 biofabrication은 Au 염을 각 추출물 용액과 혼합하여 수행되었습니다. 각 추출물에는 Au 염을 AuNPs로 환원시키는 데 매우 효율적인 다양한 파이토케미컬이 포함되어 있습니다.

AuNPs의 뚜렷한 SPR 밴드는 초기에 옅은 노란색 용액의 색상을 PO-AuNPs의 경우 진한 파란색, AC-AuNPs의 경우 형광 갈색, PV-AuNPs의 경우 포도주색으로 변경했습니다(그림 2). . UV 가시 스펙트럼은 각 AuNP 세트의 뚜렷한 SPR 밴드를 관찰하기 위해 5시간 동안 건조한 오븐에서 37°C로 배양한 후 기록되었습니다(그림 3). 최대 흡광도는 PV-AuNP의 경우 530nm에서, AC-AuNP의 경우 555nm에서 관찰되었습니다. PO-AuNP의 경우 500~700nm에서 넓은 SPR 밴드가 관찰되었습니다. 세 가지 추출물은 UV 가시 스펙트럼에서 특징적인 SPR 밴드를 갖는 AuNP를 생성했습니다. 뚜렷한 SPR 밴드와 함께 각각의 색상 변화는 각 추출물로 AuNP의 성공적인 바이오 제조를 분명히 지원했습니다. 우리는 항산화 활성과 관련된 세 가지 요소(자유 라디칼 소거 활성, 총 페놀 함량 및 환원력)가 AuNP 바이오 제조에 영향을 미친다고 제안했습니다. P의 추출물. 저속한 세 가지 요소 모두에서 가장 높은 점수를 받았고 A가 그 뒤를 이었습니다. 모세혈관 그리고 마지막으로 P. 올레라시아 . 흥미롭게도 PO-AuNP는 주변 온도(25°C)에서 30분 동안 보관한 후 응집되는 것으로 나타났습니다. 이 결과는 PO-AuNPs가 P의 항산화 활성, 총 페놀계 화합물의 양, 환원력으로 가장 불안정함을 시사하였다. 올레라시아 이 세 가지 추출물 중 가장 낮았습니다. 대조적으로 PV-AuNP는 가장 높은 흡광도와 투명한 와인 레드 용액을 보였다. AC-AuNP의 흡광도는 PO-AuNP와 PV-AuNP의 흡광도 사이였다. 따라서 이러한 관찰을 바탕으로 P의 자유 라디칼 소거 활성, 총 페놀 함량 및 환원력이 더 높은 것으로 결정되었다. 저속한 추출물은 A의 추출물에 의해 생성된 AuNP에 비해 더 안정적인 AuNP의 합성을 초래했습니다. 모세혈관 및 P. 올레라시아 . 종합적으로, 최대 SPR 밴드는 추출물의 항산화 활성이 감소함에 따라 bathochromic 및 hypochromic 이동을 보였다. 또한, SPR 밴드의 형태는 항산화 활성이 감소함에 따라 넓어지는 경향을 보였다. 따라서, PV-AuNPs는 HR-TEM, HR-XRD, 유체역학적 크기 및 제타 전위 측정에 의해 추가로 특성화되었습니다. 반응 수율을 결정하기 위해 ICP-OES 분석을 수행했습니다. FBS의 유무에 따른 항산화 활성 및 세포 독성을 암세포에 대해 추가로 평가했습니다.

PO-AuNP, AC-AuNP 및 PV-AuNP의 디지털 사진

PO-AuNPs(검정색 선), AC-AuNPs(빨간색 선) 및 PV-AuNPs(파란색 선)의 UV 가시 스펙트럼

PV-AuNP의 HR-TEM 이미지

현미경 기술은 나노 입자를 시각화하는 가장 효과적인 도구입니다. HR-TEM과 함께 주사 전자 현미경 및 원자력 현미경은 일반적으로 크기, 형태, 지형 및 2차원/3차원 구조를 결정하는 데 사용됩니다. PV-AuNPs의 크기와 형태는 HR-TEM으로 조사되었다. 그림 4와 같이 구, 삼각형, 막대, 마름모, 육각형 등 다양한 형태가 관찰되었다(그림 4a~e). 막대(그림 4f, g)와 삼각형(그림 4h)의 격자 구조 관찰은 PV-AuNP가 본질적으로 결정질임을 분명히 보여주었습니다. 이 결과는 후속 HR-XRD 분석 결과에 의해 강력하게 뒷받침되었습니다. 각 입자 모양의 크기는 HR-TEM 이미지에서 측정되었으며, 그 결과로 생성된 크기 히스토그램은 그림 5에 나와 있습니다. 모든 히스토그램은 가우스 분포를 나타냅니다. 이미지의 개별 나노 입자는 각 모양의 평균 크기를 얻기 위해 무작위로 선택되었습니다. 구체의 직경은 250개의 나노입자로부터 23.8 ± 1.3nm로 결정되었습니다(그림 5a). 흥미롭게도 정삼각형이 생성되었습니다. 따라서 64개의 나노 입자(25.7 ± 2.2nm, 그림 5b)의 높이를 측정했습니다. 평균 길이를 결정하기 위해 27개의 막대 모양의 나노 입자가 무작위로 선택되었습니다(28.4 ± 0.4 nm, 그림 5c). 막대의 길이를 너비로 나눈 평균 종횡비는 2.4로 결정되었습니다. 마름모 모양의 경우 이미지에서 38개의 마름모가 무작위로 선택되었습니다. Fig. 5d, e와 같이 장대각선과 단대각선의 평균길이는 각각 22.0 ± 0.6 nm와 15.4 ± 0.3 nm로 측정되었다. 다양한 형태의 PV-AuNPs는 30nm 이하의 크기를 가지며, 다음 섹션에서 유체역학적 크기와 크기를 비교하였다.

PV-AuNP의 HR-TEM 이미지. 눈금 막대는 a를 나타냅니다. 50nm, b 50nm, c 50nm, d 50nm, e 10nm, f 2nm, g 2nm 및 h 2nm

PV-AuNP의 크기 히스토그램. 아 구체의 직경. ㄴ 정삼각형의 높이. ㄷ 막대의 길이. d 마름모의 길이(긴 대각선). 이 마름모의 길이(짧은 대각선)

PV-AuNP의 유체역학적 크기 및 제타 전위

유체역학적 크기와 제타 전위는 추가 응용을 위한 나노입자 연구에서 중요한 특성입니다. 일반적으로 HR-TEM 이미지에서 측정된 크기는 유체역학적 크기보다 작은데, 이는 유체역학적 크기가 나노입자 표면에 결합된 생체분자를 반영하기 때문이다. 그림 6a에서 볼 수 있듯이 유체역학적 크기는 0.258의 다분산 지수와 함께 45 ± 2 nm로 결정되었으며, 이는 HR-TEM 이미지(250개 나노입자에서 23.8 ± 1.3 nm)에서 측정된 구체의 크기보다 큽니다. . 이 결과는 추출물의 파이토케미컬이 PV-AuNP의 표면에 결합하여 안정화되었음을 분명히 시사한다. 또한 PV-AuNP는 - 13.99mV의 음의 제타 전위를 가지고 있었습니다(그림 6b). 이러한 결과는 음전하를 가진 파이토케미컬이 음의 제타 전위에 가장 크게 기여했을 가능성이 있음을 보여주었습니다. This negative zeta potential gives repulsive forces in a colloidal solution of PV-AuNPs endowing its stability. Therefore, one of our future works will include the phytochemical screening on the extract of P. vulgaris to elucidate the exact compounds which contribute to the negative zeta potential.

Hydrodynamic size and zeta potential of PV-AuNPs. 아 Hydrodynamic size. ㄴ Zeta potential

HR-XRD Analysis of the PV-AuNPs

X-ray diffraction analysis is generally employed to obtain crystallographic information about metallic nanoparticles. The characteristic diffraction patterns in terms of the Bragg reflections obtained from HR-XRD showed that the PV-AuNPs possessed a crystalline structure. The diffraction peaks (2θ values) observed at 38.1°, 44.5°, 64.8°, and 77.4° corresponded to the (111), (200), (220), and (311) planes, respectively, of a face-centered cubic structure in the PV-AuNPs (Fig. 7). The Scherrer equation (D  = 0.89·λ/W·cosθ ) was used to determine the approximate size of the PV-AuNPs. We selected the most intense (111) peak for application in the equation. The definition of each term in the equation is as follows:D is the size of the PV-AuNPs determined from the (111) peak, θ is the Bragg diffraction angle of the (111) peak, λ is the X-ray wavelength that was utilized, and W is the full width at half maximum (FWHM) of the (111) peak, in radians. From the Scherrer equation, the approximate size of the PV-AuNPs was determined to be 16.7 nm. The size determined from the Scherrer equation was smaller than the sizes measured from both HR-TEM images and the hydrodynamic size. The hydrodynamic size was the largest, possibly due to the fact that phytochemicals in the extract bound to the surface of the PV-AuNPs.

HR-XRD analysis of PV-AuNPs

Reaction Yield of the PV-AuNPs

ICP-OES was used to estimate the reaction yield. First, the total concentration of Au was obtained by analyzing the PV-AuNP solution. Second, the PV-AuNPs were centrifuged and the supernatant was collected. The supernatant was analyzed to ascertain the concentration of unreacted Au in the reduction reaction. Then, the reaction yield was estimated as follows:reaction yield (%) = 100 − [Au concentration in the supernatant/Au concentration in the colloidal solution] × 100.

Based on ICP-OES analysis, the concentrations of Au in the colloidal PV-AuNP solution and the supernatant were determined to be 96.337 ppm and 0.679 ppm, respectively. Therefore, the reaction yield of the PV-AuNPs was determined to be 99.3%. From the ICP-OES results, we concluded that the reaction condition was optimal which produced a high reaction yield of PV-AuNPs.

Antioxidant Activity of the PV-AuNPs

The DPPH radical scavenging activity was examined to evaluate the antioxidant activity of the PV-AuNPs. As shown in Fig. 8, the DPPH radical scavenging activity of the PV-AuNPs was nearly constant at a concentration of less than 20.9 μg/mL (based on the Au concentration). However, as the concentration increased (41.9~334.8 μg/mL based on the Au concentration), the DPPH radical scavenging activity also increased, suggesting that the activity was dose-dependent. IC₅₀ of the PV-AuNPs was observed to be 165.0 μg/mL, which was equivalent to the IC₅₀ of vitamin C (49.4 μM).

DPPH radical scavenging activity of PV-AuNPs. The concentration was expressed as Au concentration

Green-synthesized AuNPs or AgNPs have been known to possess antioxidant activity in terms of DPPH radical scavenging activity [20, 21]. Ginseng-berry-mediated AuNPs demonstrated antioxidant activity [20]. The absorption of phytochemicals in the ginseng berry extract on the surface of nanoparticles having a large surface area can be credited to the antioxidant activity of AuNPs [20]. Green-synthesized AuNPs using Angelica pubescens roots showed antioxidant activity with a dose-dependent manner [21]. Secondary metabolites in A. pubescens such as flavonoids, sesquiterpenes, and phenolic compounds are potential contributors for the free radical scavenging activity [21]. However, AgNPs demonstrated higher antioxidant activity than AuNPs in the two articles mentioned above.

Cytotoxicity of the PV-AuNPs

The cytotoxicity of the PV-AuNPs against three cancer cells from different tissue types (colon, pancreas, and breast) was evaluated to examine the tissue-specific cytotoxicity of the nanoparticles in the presence/absence of FBS (Fig. 9). When serum was present during the cell culture, various kinds of protein coronas formed. The protein corona was dependent on the characteristics of the nanoparticles, such as the size, shape, surface charge, and surface roughness [22]. The protein corona can either increase or decrease the cellular uptake and cytotoxicity of the nanoparticles [23]. However, there are controversial reports regarding whether the protein corona causes the cytotoxicity to increase or decrease. Thus, the cytotoxicity of the PV-AuNPs was evaluated in the presence and absence of FBS. In the absence of FBS, HT-29 showed the greatest cytotoxicity at the tested concentrations (29.9~478.3 μg/mL) among three cells (Fig. 9a), followed by MDA-MB-231 (Fig. 9b) and lastly by PANC-1 (Fig. 9c). However, in the presence of FBS, these cells demonstrated a different phenomenon. PANC-1 showed the highest cytotoxicity, followed by HT-29 cells. In the absence of FBS and with 478.3 μg/mL Au, both the PANC-1 and MDA-MB-231 cells did not show any significant cytotoxicity, while strong cytotoxicity was observed for the HT-29 cells (65.6% cytotoxicity). However, in the presence of FBS, cytotoxicity was observed for PANC-1 (37.5% cytotoxicity) at 478.3 μg/mL Au. In general, the PV-AuNPs surrounded by a protein corona strongly influenced the cytotoxicity against cancer cells, although the results were tissue-specific. The protein corona produced by FBS increased the cytotoxicity against PANC-1 when compared with the cytotoxicity in the absence of FBS; however, the cytotoxicity decreased in the presence of the protein corona for HT-29 when compared with the cytotoxicity without the protein corona.

In vitro cytotoxicity on cancer cells. 아 HT-29. ㄴ MDA-MB-231. ㄷ PANC-1

It has been reported that a variety of proteins bind to both positively and negatively charged AuNPs, while few proteins bind to AuNPs with a neutral charge [17, 24]. The negatively charged AuNPs showed a higher affinity and a slower release of fibrinogen protein than the positively charged AuNPs, suggesting the existence of specific binding sites for fibrinogen on the negatively charged AuNPs [17]. The PV-AuNPs possessed a negative zeta potential; thus, the binding of fibrinogen may affect the cytotoxicity against cancer cells. The investigation of the protein corona of nanoparticles is beneficial in nanomedicine research for future biomedical and clinical applications.