단일 단계 녹색 합성 다기능 금 나노입자로 표적 종양 영상 및 치료 효율 극대화

초록

금 나노입자(GNP)는 독소루비신(DOX) 수송 벡터로 종양 진단·치료에 널리 쓰였으나, 기존 합성법은 화학적 환원법으로 GNP 제조 후 DOX나 특정 펩타이드 접합하는 다단계, 고비용, 시간 소모, 복잡한 제조·후처리 공통 문제 존재. 본 연구에서는 DOX 화학적 구성 기반 DOX 접합 GNP 단일 단계 제조 전략 최초 제시. 또한 DOX, RGD 펩타이드, 핵 위치 신호(NLS) 펩타이드 환원성 작용기 도움으로 다기능 GNP(DRN-GNP) 단일 단계 법 제조, 단 30분 소요. 산란 이미지, 세포 TEM 연구 결과 DRN-GNP가 HeLa 세포 핵 표적화 확인. 누드 마우스 종양·꼬리정맥 주사 DRN-GNP 종양 억제율 각각 66.7%, 57.7%로 대조군 대비 유의미 향상. 단일 단계 다기능 GNP 합성은 시간·재료 절약, 녹색 화학 발전 방향 부합, 향후 대규모 응용 기반 마련. 결과 제안 전략 효율적, 제조 DRN-GNP 생리계 우수한 콜로이드 안정성 보유, 자궁경부암 진단·치료용 잠재적 조영제 및 효율적 DOX 수송 벡터.

서론

독소루비신(DOX)은 혈액 악성 종양[1], 다양한 선암[2,3,4,5], 연조직 육종[6] 등 다양한 암 화학요법 널리 쓰이는 항암제. 하지만 장기 고용량 DOX는 약물 내성[7], 오심[8], 탈모[9], 급만성 독성[10] 유발, 울혈성 심부전 초래[11]. 따라서 좋은 생체적합성, 높은 약물 로딩 능력 약물 캐리어 개발 필수. 최근 양자점[12,13], 키토산[14,15], 실리콘 나노소재[16,17], 고분자 나노소재[18,19,20], 형광 나노입자[21,22,23,24], 금속 나노소재[25,26,27,28,29,30] 등 많은 나노소재 DOX 수송 벡터로 개발. 금 나노소재 독특한 화학적·광학적 특성, 저독성, 좋은 생체적합성, 표면 수정 제어 능력 등으로 이 중 널리 사용[31,32]. 현재 GNP 표면 DOX 접합 세 가지 접근법: (1) 히드라진[25], EDC[26], pH 감응제[27], DCC/NHS 시스템[28] 도움으로 DOX 접합; (2) GNP-DOX 최소 24시간 배양[29]; (3) GNP 표면 시트르산 DOX로 치환[30]. 이 DOX 접합 GNP 종양 치료 사용되나 충분한 특이성 부족으로 적용 제한. 최근 El-Sayed 그룹[27] DOX, RGD 펩타이드, 핵 위치 신호(NLS) 펩타이드로 GNP 기능화. 하이라이트: GNP가 RGD 펩타이드 수용체 매개 세포내섭취로 종양 세포 진입, NLS 펩타이드 도움 핵 진입, DOX DNA 합성 효과적 방해. 하지만 펩타이드/약물 층층이 GNP 결합 최소 120시간, 각 과정 최소 24시간 소요. 위 모든 방법 다단계, 고비용, 복잡한 제조·후처리 공통 문제 직면. 따라서 다기능 금 나노소재 단순 신속 합성법 개발 필요.

본 논문에서는 DOX 화학적 구성 기반 DOX 접합 GNP 단일 단계 전략 최초 제시. 또한 DOX 더 잘 작동하게 다기능 DOX 수송 벡터 편리 합성법 제시, 종양 진단·치료 활용. 우리 연구 타 연구 차이점: DOX, RGD 펩타이드, NLS 펩타이드 환원제·안정제로 사용해 GNP 제조와 동시에 세 물질 GNP 표면 접합해 DRN-GNP 형성. 선행 연구[33,34,35] RGD 등 펩타이드 금 이온 환원 금 나노소재 제조 가능 입증. NLS N-말단 시스테인-시스테인-티로신(CCY) 서열 수정해 CCYNLS 구성, 금 이온 환원하면서 NLS 표적 효과 유지[36]. 또한 DOX 강염기 조건에서 강한 환원성 가진 두 페놀 수산기(6, 11번 탄소) 보유[37,38], 금 이온 환원 GNP 형성 가능. 한편 DOX 항종양 효과 영향 없을 것: DNA 끼워맞춤 7번 탄소 아미노기, 9번 탄소 수산기 이용[39]. 동시에 펩타이드, DOX 상 황, 산소, 질소 GNP와 결합 콜로이드 안정 유지[33]. 결과 DRN-GNP 성공적 제조, 종양 영상·진단·치료 잘 작동(Scheme 1). 우리 지식으론 DOX, RGD, NLS 펩타이드 접합 다기능 GNP 단일 단계 합성법 및 종양 진단·치료 적용 최초 보고.

재료 및 방법

재료

HAuCl₄·4H₂O Sinopharm Chemical Reagent(중국) 구입. 고리형 RGD 펩타이드(아미노산 서열 아르기닌-글리신-아스파르트산-티로신-글루탐산, c(RGDyE)), 수산화나트륨 ref.[35] 동일. 독소루비신 Sangon Biotech(상하이) 구입. CCYNLS 펩타이드(아미노산 서열 시스테인-시스테인-티로신-프롤린-프롤린-라이신-라이신-라이신-아르기닌-라이신-발린, CCYPPKKKRKV) China Peptides(상하이) 공급. HeLa, MCF-7 세포주 Guangzhou Youdi Biological Technology 제공. 태아소혈청(FBS), 델베코 변형 이글 배지(DMEM) GibcoBRL Life Technologies 구입. 증식·세포독성 분석 키트(MTT) Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology 구입.

DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP 합성

DOX-GNP 제조: DOX 용액(0.2 mg/mL, 1.0 mL) 염화금산 용액(0.86 mM, 1.0 mL) 자기 교반 중 첨가, NaOH(2 M, 5 μL) 첨가 pH 조절. NLS-GNP 제조: CCYNLS 펩타이드 용액(0.5 mM, 1.0 mL) 염화금산 용액(3.44 mM, 1.0 mL) 자기 교반 중 첨가, NaOH(2 M, 20 μL) pH 조절. DR-GNP 제조: DOX 용액(0.2 mg/mL, 1.0 mL), RGD 펩타이드 용액(1.0 mM, 1.0 mL) 염화금산 용액(1.72 mM, 2.0 mL) 자기 교반 중 첨가, NaOH(2 M, 15 μL) pH 조절. DN-GNP 제조: DOX 용액(0.2 mg/mL, 1.0 mL), CCYNLS 펩타이드 용액(0.5 mM, 1.0 mL) 염화금산 용액(1.72 mM, 2.0 mL) 자기 교반 중 첨가, NaOH(2 M, 20 μL) pH 조절. DRN-GNP 제조: DOX 용액(0.2 mg/mL, 1.0 mL), CCYNLS 펩타이드(0.5 mM, 1.0 mL), RGD 펩타이드(1.0 mM, 1.0 mL) 염화금산 용액(1.72 mM, 3.0 mL) 자기 교반 중 첨가, NaOH(2 M, 35 μL) pH 조절. 모든 반응 100°C 환류 시스템 자기 교반 30분 지속, pH 10-12. 모든 GNP 55,000 rpm 30분 원심분리(Optima MAX-TL, Beckman Coulter) 정제. 상등액 제거 후 초순수 재분산.

특성화

GNP 스펙트럼 특성화 UV 3150 분광광도계(Shimadzu, 일본), Nicolet Avatar FTIR 모델 330 분광기(Thermo, 미국), ESCALab250 X선 광전자 분광법(XPS, ref.[35] 동일 분석 조건) 사용. GNP 투과전자현미경(TEM) 이미지 JEM-2100F(JEOL, 일본) 200 kV 가속 전압 획득.

동적 빛 산란 및 제타 전위 측정

제타 PALS 제타 전위 분석기(Brookhaven Instrument Corporation) DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP 동적 빛 산란(DLS) 측정, 90° 각도, 고체 레이저(λ=670 nm), 실온 작동. AQ-827 전극 장착 시 GNP 제타 전위 측정.

ICP 분석

GNP 내 Au 정량 분석 ref.[35] 동일.

DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP PBS, HCl, NaOH, NaCl 용액 분산 안정성

침전 GNP 100 μL, 고농도 0.2 M PBS, 0.5 M HCl, 0.5 M NaOH, 1.0 M NaCl 용액 각각 500 μL 혼합. 12시간 후 사진 촬영, UV 흡수 스펙트럼 측정.

세포 배양

HeLa, MCF-7 세포 5% CO₂ 평형 공기 가습 인큐베이터 37°C 24시간 배양. 배지 DMEM 10% FBS. 살아있는 세포 수 세포 계수판 계수.

자유 DOX 및 DRN-GNP 세포독성 분석

지수기 HeLa, MCF-7 세포 96웰 플레이트 웰당 ~5×10³ cells 첨가 24시간 배양. DRN-GNP 농도 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL(해당 DOX 농도 0.0, 7.8, 15.6, 23.4, 31.2, 39.0 μg/mL) 각 웰 배양 24시간. 대조군 PBS 완충액만 첨가, 생존율 100% 설정. MTT(20 μL, 5 mg/mL) 각 웰 첨가 37°C ~4시간 배양. 배지 조심히 제거, 웰당 150 μL 디메틸 설폭사이드 첨가 10분 결정 완전 용해. 마이크로플레이트 리더(Thermo Multiskan Mk3) 490 nm OD 값 측정. 그룹당 3웰 준비, 계산값 평균 ± 표준편차 표현.

유세포분석 실험

지수기 HeLa, MCF-7 세포 12웰 플레이트 2개 웰당 ~5×10⁴ cells 첨가 24시간 배양. DRN-GNP 용액 최종 농도 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL 각 웰 첨가 37°C 24시간 배양. 배지 제거, 트립신(EDTA 함유) 용액 첨가 세포 소화. 트립신 제거, 배지 첨가, 세포 원심관 이송. 1000 g 5분 원심 후 상등액 제거, 각 관 세포 PBS 용액 수집 계수. ~5-10×10⁴ 세포 다른 원심관 이송 다시 1000 g 5분 원심. 상등액 제거, AnnexinV 완충액 100 μL 첨가. AnnexinV-FITC 5 μL, 요오드화 프로피디움 5 μL 첨가 부드럽게 혼합. 관 실온(20-25°C) 암소 15분 배양 후 유세포분석기(BD Accuri C6) 측정.

세포 배양 광학 암시야 산란 영상 및 투과전자현미경 연구

HeLa, MCF-7 세포 8홀 세포 배양 슬라이드 웰당 ~7×10³ cells 이식. DRN-GNP 최종 농도 35 μg/mL 각 웰 첨가. 24시간 배양 후 PBS 3회 세척 물리적·자유 흡착 GNP 제거. 4% 파라포름알데히드 20분 고정, 글리세롤 몇 방울 코팅, 다른 커버슬립으로 8홀 슬라이드 밀봉. 암시야 현미경(Zeiss Imager Z1) ×200 배율 반사 모드 세포 평가. 밝은영상/암시야 이미지 노출 시간 5V 전압서 1 ms, 400 ms.

TEM 연구: HeLa, MCF-7 세포 DRN-GNP(35 μg/mL) 24시간 세포 배양 플라스크 배양. 배양 후 배지-DRN-GNP 혼합액 제거, PBS 3회 세척, 트립신 소화. 세포 소량 DMEM 배지 원심관 이송. 1500 rpm 10분 원심, DMEM 조심히 제거, 3% 글루타르알데히드 용액(통상 물질 부피 40배) 관 바닥 세포 1시간 이상 고정. 1% 사산화오스뮴 1시간 추가 고정, 에탄올 탈수, Spurr(Sigma-Aldrich, 미국) 포매. 관 꺼내 섹션 절단, 수용성 초산우라닐, 구연산납 염색, 구리 그리드(300 메쉬) 마운트. 시편 FEI TECNAI-12 투과전자현미경(작동 전압 120 kV) 측정.

동물 실험

실험 동물

면역결핍 암컷 누드 마우스 동물실험센터(남부의과대학, 중국 광저우) 구입 in vivo 종양 치료 테스트용. 모든 동물 실험 중국 보건부 실험동물 관리 규칙(문서 번호 55, 2001), 중국약과대학 실험동물 관리·사용 지침 준수 수행.

종양 보유 마우스 자유 DOX 및 접합체 치료 효능

5-6주령, 16-18g 누드 마우스 36마리 무작위 6그룹 분할. 우측 액와와 5×10⁶ HeLa 세포(PBS 현탁) 피하 주입. 5일 후 대조군 식염수(0.154 mol/L, 0.2 mL) 꼬리정맥 주사. 자유 DOX, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP 그룹 마우스 동일 꼬리정맥 주사. DRN-GNP 정맥 주사-종양 주사 항종양 효능 비교 위해 동일량 DRN-GNP 종양 부위 주사 그룹 추가. 5그룹 마우스당 0.3 mg/kg 자유/접합 DOX 동일 용량 유지. 매일 1회 꼬리정맥/종양 주사. 마우스 체중, 종양 부피 매일 14일간 모니터링. DOX, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP 치료 효과 추가 조사 위해 14일 치료 후 6그룹 종양 절제 병리 분석. 마우스 심장, 간, 비장, 폐, 신장 내부 장기 분리, 10% 중성 완충 포르말린 고정, 파라핀 포매. 종양 조직 절편 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색 올림푸스 광학 현미경 검사.

결과 및 논의

DOX-GNP, NLS-GNP, DN-GNP, DR-GNP, DRN-GNP 합성 및 특성화

DOX-GNP 합성 시 NaOH 용액 DOX-염화금산 혼합액 첨가 즉시 용액 색 주황→연한 보라→100°C 환류 시스템 자기 교반 1분 와인 레드 변화, DOX-GNP 형성 지시. 결과 DOX 환원 능력 매우 강함 입증: DOX 강염기 조건 강한 환원성 가진 두 페놀 수산기(6, 11번 탄소) 보유. 반응 30분 색 변화 없을 때까지 지속.

DOX 주황-적색, GNP 와인 레드 색 혼동 피위해 UV 흡수 스펙트럼 추가 증거 제시(그림 1a). DOX 485 nm 근처 특성 흡수 피크, 530 nm 피크 보유. 그러나 생성물 용액 스펙트럼 480 nm 피크 사라지고 GNP 특성 표면 플라즈몬 공명(SPR) 흡수 피크 520 nm 출현. 그래도 GNP 형성 520 nm(GNP), 530 nm(DOX 피크) 사이 아직 완전히 확정 안됨. 고속 원심분리 GNP 침전, DOX 분자 비침전 고려: 원심관 바닥 보라색 침전물 생성물(그림 1a 인셋 3-4), DOX 없음(인셋 1-2).

DOX 365 nm 자외선 조사 적색 형광, GNP 합성 후 DOX 형광 소멸. 두 가능성: (1) GNP 소광 계수 매우 강해 GNP 표면 근접(<5 nm) 분자 형광 소광 경향[40]. 거리 20 nm 이상 시 나노입자 플라즈몬 장 너무 멀어 형광 신호 소광 안함[41]. (2) DOX 형광기 환원제 역할 후 파괴. 그림 1c DOX-GNP 적외선 흡수 피크 수 DOX 대비 현저히 적으나 DOX 특성 다수 유지: 2910 cm⁻¹(C-H 신축)[42], 1631 cm⁻¹(카르보닐 신축)[43], 1114 cm⁻¹(C-O, C-N 신축)[44], 867 cm⁻¹(N-H, C-H 평면외 굽힘)[45] 대표 피크 DOX-GNP 스펙트럼에도 출현, DOX 성공적 결합 입증. 흥미롭게 1214 cm⁻¹ 페놀 수산기 C-O 신축 특성 피크[46] DOX-GNP 스펙트럼서 소실. 페놀기 Au 이온 환원 GNP 형성 후 카르보닐기로 전이. DOX 효과 영향 없을 것 추측: DNA 끼워맞춤 7번 탄소 아미노기, 9번 탄소 수산기 이용[39].

TEM 결과 DOX-GNP 입자 크기 ~6 nm 관찰(그림 1b). DOX-GNP XPS 스펙트럼 Au(I) 계산 비율 31.93%(그림 1d) 콜로이드 안정성 유지 충분. 하지만 DOX-GNP 침전물 0.2 M PBS 완충액 고속 원심분리 후 상등액 제거 시 용액 색 보라-흑색 변화, 불용성 플레이크 가시. DOX-GNP 고염 농도 환경 안정성 좋지 않음 지시. 설명: DOX 아미노기 1개만 보유, 설프하이드릴기 없어 Au-S, Au-N 결합으로 GNP 표면 연결 충분치 않음. DOX-GNP 조영제·항종양 소재 활용 시 추가 노력 필요.

DOX, RGD 펩타이드, NLS 펩타이드 환원·안정제로 DRN-GNP 합성. RGD 펩타이드 α_vβ₃ 인테그린 과발현 일부 종양 세포 특이적 표적화, NLS 펩타이드 핵 특이적 표적화. 그림 2a 제조 DOX-GNP, NLS-GNP, DRN-GNP UV-Vis 스펙트럼 표면 플라즈몬 흡수 피크 520-530 nm 특성[33]. 인셋 GNP 밝은 와인 레드 색 확인. TEM 이미지(추가 파일 1: 그림 S1) NLS-GNP, DRN-GNP 입자 크기 ~10 nm, ~5 nm, GNP 균일 분포, 명백한 응집 없음.

NLS-GNP, DRN-GNP 합성 검증 위해 NLS 펩타이드, GNP FTIR 스펙트럼 특성화(그림 2c). NLS 펩타이드 일부 FTIR 피크 NLS-GNP, DRN-GNP 스펙트럼서 발견: C-H 신축 진동 흡수 피크(2840-2972 cm⁻¹)[47], C=O 신축 진동 흡수 피크(1630-1700 cm⁻¹)[48], =C-H 평면내 굽힘 진동 피크(1300-1475 cm⁻¹)[49] CCYNLS 펩타이드 GNP 표면 성공적 접합 지시. 또한 NLS 펩타이드 티로신 말단 벤젠 골격 진동 피크 1529 cm⁻¹, 페놀 수산기 C-O 신축 진동 피크 1193 cm⁻¹[49] NLS-GNP, DRN-GNP 적외선 스펙트럼서 소실, 티로신 말단 벤젠 골격 환원제 역할 후 퀴논 구조 전이 의미.

DRN-GNP 고속 원심분리, 상등액 수집(거의 무색), UV-Vis 스펙트럼 그림 2b로 잔여 반응물 확인. RGD, NLS 펩타이드 UV 흡수 피크 티로신 잔기 유래, 275 nm 위치. 강염기 조건 페놀 수산기 음이온화, 벤젠 고리 전자 밀도 증가, 피크 292 nm 적색 편이. DRN-GNP 상등액 UV-Vis 스펙트럼 특성 피크 미관찰, 두 펩타이드 모두 반응 참여 의미. DOX 450-600 nm 범위 3 흡수 피크 보유, DRN-GNP 상등액 해당 피크 없음. 또한 DOX 강염기 조건 투명 연보라색이나 상등액 연갈색으로 DOX 미검출. 세 물질 거의 완전 반응 결론. 유사하게 DR-GNP, DN-GNP도 이 방식 설명(추가 파일 1: 그림 S2).

NLS-GNP, DRN-GNP Au 원자가 XPS 분광법 검증. 그림 3a, b 결합 에너지 ~83.6 eV, ~87.0 eV 두 피크 Au 4f_7/2, 4f_5/2 광전자 방출 일치[33]. 두 GNP Au 4f_7/2 결합 에너지 위치 거의 84.0 eV. NLS-GNP 디콘볼루션 Au(0)(83.5 eV), Au(I)(84.1 eV), 피크 면적 비율 각각 57%, 43%. DRN-GNP 동일 Au(0)(83.6 eV), Au(I)(84.4 eV), 비율 62%, 38% 더 높은 Au(I) 비율. 전하 Au(I)-S 복합체 형성, GNP 콜로이드 안정성 유지 도움. 흥미롭게 NLS-GNP, DN-GNP, DRN-GNP XPS 스펙트럼 3종 황 확인(추가 파일 1: 그림 S3). 파랑/검정 곡선 황 산화 상태, 보라 곡선 S-H 결합, 녹색 곡선 Au-S 결합. Au-S 결합 형성으로 3개 GNP 표면 NLS 펩타이드 성공적 접합 입증.

또한 XPS 스펙트럼 N 1s, C 1s, O 1s 피크로 펩타이드, DOX GNP 부착 입증(추가 파일 1: 그림 S4).

XRD 스펙트럼(추가 파일 1: 그림 S5) GNP 결정 구조 면심입방정계: 모든 XRD 스펙트럼 38.2°, 44.5°, 64.7°, 77.8° 4개 피크 (111), (200), (220), (311) 면 대응[33].

DRN-GNP 안정성

5개 GNP 동적 빛 산란(DLS), 제타 전위 데이터 표 1 표시. 수화 크기 TEM 특성화 크기보다 큼, 수용성 GNP 코어 주변 수화 분자 탓. 제타 전위 음성, GNP 표면 카르복실기 결합 탓. 제타 전위 절댓값 30 mV 초과 시 GNP 용액 좋은 콜로이드 안정성, 절댓값 클수록 안정성 우수. 표 1서 모두 좋은 콜로이드 안정성 보유 확인. 비교: NLS-GNP 제타 전위 절댓값 최고, 표면 NLS 펩타이드 가득해 티올기 통한 강한 Au-S 결합 형성 때문. DOX-GNP 제타 전위 절댓값 30 mV 근접, 앞서 언급 DOX-GNP PBS 분산 시 안정성 낮음과 일치. 스펙트럼 데이터 추가 파일 1: 그림 S6 표시.

GNP 특성 표면 플라즈몬 공명(SPR) 밴드 변화로 GNP 응집 판단 UV-Vis 분광법 활용[49]. DRN-GNP 고염(1 M NaCl, 0.2 M PBS), 강산(0.5 M HCl), 강염기(0.5 M NaOH) 용액 분산 시 UV-Vis 스펙트럼 측정, 사진 촬영(그림 3c). HCl 용액 제외 다양한 가혹 조건서 용액 색 변화, UV-Vis 스펙트럼 이동 미관찰. HCl 용액서 색 연보라 변화, UV 흡수 피크 ~20 nm 적색 편이, 강산 조건서 GNP 약간 응집 의미. 이유: 음전하 GNP 콜로이드 안정성 강산 조건 영향받음, 중성 PBS, 염기 환경 영향 안받음. DRN-GNP 고염, 염기 조건서 고안정성, in vitro 세포 영상, in vivo 항종양 치료 활용 기대 결론.