인테그린 β1은 분화, 이동, 조직 복구 등 핵심 과정을 조율합니다. 원자력 현미경(AFM)을 이용해 인간 지방유래 줄기세포(hADSCs)의 초기 연골분화 과정에서 인테그린 β1 리간드와 CD29 수용체 간 상호작용을 정량화했습니다. AFM 이미징은 길쭉한 방추형 세포에서 다각형 세포로의 전이를 보여주며, 길이/폭 비율 감소와 표면 거칠기 증가를 확인했습니다. 0, 6, 12일에 걸쳐 1,200개 이상의 힘-거리 곡선을 수집한 결과, 파열 힘(61.8 ± 22.2 pN → 67.2 ± 22.0 pN)과 결합 확률(19.6% → 33.4%)이 증가함을 보였습니다. 이 데이터는 AFM이 인테그린 β1-CD29 결합, 세포 초미세구조, 형태를 연골분화 진행의 신뢰할 수 있는 표지자로 추적할 수 있음을 입증합니다.
골관절염(OA)은 관절 연골을 침식하는데, 이 조직은 무혈관이고 자가 복구 능력이 제한적입니다. 줄기세포 기반 조직공학은 연골 기능 회복에 유망하지만, 연골분화를 이끄는 정확한 신호 전달 사건은 여전히 불분명합니다. 특히 인테그린 β1(CD29)은 세포-기질 상호작용을 매개하고 줄기세포 운명을 결정하는 Wnt/β-카테닌, PI3K, mTOR 등 경로를 활성화합니다. 연골 생물학에서의 중추적 역할과 다양한 α 소단위체와의 상호작용 때문에 인테그린 β1에 초점을 맞췄습니다.
단일분자 힘 분광법(SMFS)과 결합된 AFM은 살아있는 세포의 나노미터 해상도 이미징과 리간드-수용체 힘의 직접 측정을 제공합니다. AFM 팁을 인테그린 β1 항체로 기능화해 연골분화 유도 중 hADSCs에서 결합 사건을 탐침으로써, 기존 분석법으로는 얻을 수 없는 동역학적 및 구조적 통찰을 제공합니다.
hADSCs는 IRB 승인 프로토콜 하에 평균 연령 20세의 세 기증자 피하 지방에서 분리했습니다. 저당 DMEM에 10% 열불활성화 FBS, 항생제, 피루브산 나트륨, L-글루타민을 보충해 증식시키고 37 °C, 5% CO₂에서 유지했습니다.
연골분화를 위해 4-8 패시지 세포를 10 mL당 2 × 10⁵ 세포 밀도로 파종하고, 1% FBS, ITS, 10 ng/mL TGF-β1, 100 ng/mL IGF-1, 10⁻⁷ M 덱사메타손, 50 µg/mL 아스코르브산이 포함된 연골분화 배지에서 배양했습니다. 배지는 2일마다 교체했습니다. 알시안 블루와 톨루이딘 블루 염색으로 연골 기질 침착을 확인했습니다.
골분화와 지방분화는 덱사메타손, 아스코르브산, β-글리세롤 인산, IBMX, 하이드로코르티손, 인도메타신 등 표준 프로토콜로 수행하고, 각각 알리자린 레드와 오일 레드 O 염색으로 평가했습니다.
CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD106, HLA-DR, CD105 항체로 표지해 분석하며 중간엽 표현형을 확인했습니다.
단백질 추출물을 β-카테닌, 인테그린 β1, 콜라겐 II, GSK-3β, SOX, β-액틴으로 프로빙했습니다. 면역형광으로 인테그린 β1 분포와 F-액틴 구성을 알렉사 플루오르 488과 팔로이딘-알렉사 플루오르 573으로 각각 시각화했습니다.
질화 실리콘 팁을 세척하고 1% 3-APTES로 실란화, 글루타르알데히드로 가교 결합한 후 1 mg/mL 항-인테그린 β1 항체로 하룻밤 배양해 리간드 기능화 프로브를 제조했습니다.
세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 PBS에서 이미징했습니다. 10 µm² 이미지 15개 이상에서 형태와 표면 거칠기(Ra, Rq)를 정량화했습니다. SMFS는 500 nm/s 속도로 접근-후퇴 모드로 수행했으며, 실험당 400개 이상의 힘 곡선(시점당 약 1,200개)을 수집했습니다. 결합 사건은 파열 힘 >800 pN과 0.058 ± 0.006 N/m로 보정된 힘 임계값으로 식별했습니다.
RNA를 추출, 역전사 후 SYBR Green 화학으로 인테그린 β1과 GAPDH를 정량화했습니다. 상대 발현량은 2^(-ΔΔCT) 법으로 계산했습니다.
실험은 3회 반복 수행했습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시했습니다. 비교에는 t-검정 또는 일원분산분석(본페로니 사후 검정)을 사용했으며, p < 0.05를 유의미로 간주했습니다.
유세포 분석으로 중간엽 표현형(CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD34⁻, CD45⁻)을 확인했습니다. MTT 분석으로 패시지 전반에 걸친 강력한 증식을 입증했습니다.
AFM은 방추형에서 다각형 세포로의 명확한 형태적 전이를 보여주었으며, 6일과 12일에 길이/폭 비율이 유의미하게 감소했습니다(p < 0.01). 표면 거칠기 파라미터 Ra와 Rq가 현저히 증가해, ECM 리모델링에 의해 유도된 막 이질성 증가를 나타냈습니다.
공초점 이미징에서 F-액틴이 12일차에 종방향 배열에서 방사상, 말단 국소화 패턴으로 재구성됨을 보였으며, 이는 연골분화 전념과 관련된 세포골격 리모델링을 반영합니다.
인테그린 β1 기능화 팁을 이용한 SMFS에서 파열 힘과 결합 확률이 시간이 지남에 따라 증가했습니다(0일 19.6% → 12일 33.4%). 자유 항-인테그린 β1 항체로 차단 실험 시 힘 곡선이 ~90% 감소해 특이성을 확인했습니다.
웨스턴 블롯과 qRT-PCR에서 연골분화 중 인테그린 β1, 콜라겐 II, β-카테닌/SOX 경로 구성요소의 상향 조절을 확인했습니다. β-카테닌, SOX, GSK-3β 수치 증가는 인테그린 β1이 Wnt/β-카테닌 신호전달을 활성화해 연골 기질 합성을 촉진함을 시사합니다.
AFM은 인테그린 동역학, 형태, 막 거칠기를 연골분화의 실시간 지표로 모니터링하는 비파괴적 단일세포 접근법을 제공합니다. 향후 연구는 인테그린 구조 변화를 조사하고 인테그린 β1과 β-카테닌/SOX 신호전달 간 정확한 분자적 연결을 규명해야 합니다.
우리는 hADSC 연골분화 중 인테그린 β1-CD29 상호작용과 나노구조적 변화를 추적하는 강력한 도구로 AFM을 확립했습니다. 이 기술은 줄기세포 기반 연골 복구 전략에 정보를 제공할 동역학적 및 구조적 통찰을 제공합니다.
나노물질
요약 엘라스토머 나노구조는 명시적 기계적 역할을 수행하므로 그 기계적 특성이 재료 성능에 결정적입니다. 다양한 응용 분야로 인해 기계적 특성에 대한 철저한 이해가 요구됩니다. 특히 저밀도 폴리올레핀(LDPE)의 시간 의존적 기계적 거동은 아직 충분히 규명되지 않았습니다. 본 연구에서는 최첨단 피크포스 정량적 나노역학 매핑(PFQNM)을 포스 볼륨(FV) 및 고속 포스 볼륨(FFV)과 결합해 LDPE 시료의 탄성 계수를 시간 의존적으로 평가했습니다. 구체적으로 획득 주파수를 0.1 Hz에서 2 kHz까지 4개 주파수 대역으로 변화시켰
요약 파킨슨병(PD)은 중뇌 도파민 신경세포의 점진적 손실이 특징이며, 줄기세포 이식 방법이 치료에 유망한 전략을 제공합니다. 이러한 연구에서 이식된 세포의 생체 내 생물학적 거동 추적은 줄기세포 기능의 기본적 이해와 임상적 효과 평가에 필수적입니다. 본 연구에서는 열분해 법과 2단계 수정을 통해 폴리아크릴산(PAA)과 메톡시폴리에틸렌글리콜아민(PEG)으로 코팅된 새로운 초소형 초상자성 산화철 나노입자(USPIO-PAA/PEG NPs)를 개발했습니다. USPIO-PAA/PEG NPs는 TEM과 FTIR에서 보인 바와 같이 10.07
