다중벽 탄소나노튜브가 산화질소 신호전달을 통해 토마토 측근 발달을 촉진하는 메커니즘

초록

다중벽 탄소나노튜브(MWCNTs)가 식물에 독성이 있음이 많은 연구로 밝혀졌습니다. 그러나 MWCNTs가 측근(LR) 형성에 영향을 미치는지, 만약 그렇다면 어떻게 영향을 미치는지는 논란이 있습니다. 측근 형성은 근계가 다양한 환경 신호에 적응하는 중요한 구성 요소이기 때문입니다. 본 보고서에서 우리는 MWCNTs가 토마토 묘목 뿌리로 들어갈 수 있음을 발견했습니다. MWCNTs 투여는 토마토 측근 형성을 대략 농도 의존적으로 촉진했습니다. 내인성 산화질소(NO) 생성이 MWCNTs에 의해 유도됨은 그리이스 시약법, 전자 상자성 공명(EPR), 레이저 주사 공초점 현미경(LSCM), NO 청소제와 함께 확인되었습니다. MWCNTs 유도 NO 합성과 측근 형성이 내인성 NO 제거제인 청소제로 현저히 차단됨으로써 MWCNTs와 NO 사이에 측근 발달 유도에 인과 관계가 존재합니다. 질산염 환원효소(NR) 활성이 MWCNTs 반응으로 증가했습니다. 텅스테이트에 의한 NR 저해는 NO 생성을 손상시킬 뿐 아니라 MWCNTs 유도 측근 형성도 폐지했습니다. 포유류 산화질소 합성효소(NOS) 유사 효소 억제제인 N^G-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(l-NAME) 첨가는 측근 형성에 영향을 주지 않았습니다. 종합적으로 NO가 MWCNTs의 측근 발달 조절에서 하류 신호 분자로 작용하며, 적어도 부분적으로 NR을 경유함을 제안합니다.

서론

탄소나노튜브는 많은 생물학적, 의생명공학적 응용이 있습니다[1, 2]. 세포막을 쉽게 관통하는 독특한 능력으로 탄소나노튜브 생체안전성은 항상 논쟁 주제입니다[3, 4]. 한편 탄소나노튜브 생산과 사용이 급증함에 따라 인간, 포유류, 최근에는 식물에서의 세포독성 세부 메커니즘 규명이 중요해졌습니다[3,4,5,6,7,8,9]. 식물과 식물 군집은 인간과 환경에 매우 중요하며, 바이오솔리드 비료 살포로 토양에 축적되어 탄소나노튜브 노출 위험에 처해 있습니다[6, 10, 11]. 탄소나노튜브 중요 구성원인 다중벽 탄소나노튜브(MWCNTs, 그래핀 다중 층이 말린 구조)는 독성이 널리 조사되었습니다. 포유류 연구에서 MWCNTs와 단일벽 탄소나노튜브 노출이 사람 각질세포와 A549 세포에서 산화적 손상과 NF-κB 활성화 유도[9, 12]. MWCNTs와 단일벽 탄소나노튜브가 세포막과 융합해 지질 과산화와 산화 스트레스로 세포 손상 유발[9, 11, 13, 14]. MWCNTs 유도 세포독성, 산화 스트레스, 완만한 염증 반응이 사람 탯줄 정맥 내피세포에서 관찰됨[15]. 선행 연구에서 적색 시금치에서 MWCNTs 1차 독성이 주로 반응성 산소종(ROS) 과생성에 기인하며, 아스코르빈산 보충으로 독성 효과 역전 가능[7]. 이 의미에서 MWCNTs는 동물이나 식물에서 생물체에 새로운 스트레스 인자로 간주됩니다.

측근(LR) 형성은 근계 구조 결정 중요 인자로, 다양한 스트레스에 대한 적응 반응 지표로 여겨집니다[16]. 고등식물에서 LR 형성은 식물호르몬과 수분 가용성, 영양분, 저산소, 중금속 스트레스 등 비생물적 스트레스를 포함한 광범위한 환경 신호 영향을 받습니다[17,18,19]. 한편 충분한 증거가 LR 형성이 물리적 지지만이 아니라 물과 영양분 흡수에도 기여해 식물 생장 발달에 기여함을 확인합니다[19,20,21]. 다양한 환경 단서는 측근 형성 촉진과 주근 신장 억제 등 특정 스트레스 유도 형태 발생 반응(SIMR) 표현형을 유발할 수 있습니다[17]. LR 형성 조절은 옥신 등 식물호르몬에 의해 엄격히 제어되며, 옥신 반응으로 세포주기 조절 유전자 활성화가 제안되었습니다[19, 22]. 한편 오이, 토마토, 대두, 유채 식물에서 옥신 유도 뿌리 기관 형성에 일부 작은 분자 관여가 확인되었습니다[23,24,25,26,27]. 이 작은 분자들에는 과산화수소(H₂O₂), 산화질소(NO), 일산화탄소(CO), 수소 가스(H₂)가 포함됩니다.

이 중 NO는 자유 라디칼 기체로 식물에서 다중 생리 기능이 있음이 밝혀졌습니다[28, 29]. 스트레스 적응 향상 외에 NO 기능에는 근모 발달 촉진, 부정근 형성, 측근 형성 촉진이 포함됩니다[30,31,32,33]. 다만 앞서 말한 과정에서 NO 생합성 효소적 자원은 불명확합니다. 동물에서 L-아르기닌으로부터 NO 합성은 헤모 함유 효소 산화질소 합성효소(NOS)에 의해 촉매됩니다[34]. 식물에서 NOS 유전자는 확인되지 않았으나 포유류 NOS 유사 활성이 널리 검출되며[35, 36], 포유류 NOS 억제제인 N^G-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 염산염(l-NAME)이 식물에서 NO 생성 억제 가능[25, 33, 36,37,38,39]. 중요하게도 충분한 유전적 증거로 NO가 질산염 환원효소(NR)에 의해 생성될 수 있음이 밝혀졌습니다. NR은 식물 질소 대사 책임 잘 알려진 효소입니다[28]. NR 매개 NO 생성이 기공 폐쇄와 냉순응 관여가 유전적으로 입증됨[37, 38]. 우리 이전 연구에서 NR 의존적 NO 합성이 옥신 유도 수소 가스 매개 측근 형성에 관여함 보임[39].

지금까지 다양한 식물 종에서 나노소재(MWCNTs[40,41,42,43], 금 나노입자(Au NP[44]), 산화아연 나노입자(ZnO NP[45, 46]), 이산화티타늄 나노입자(TiO₂ NP[46]), 산화그래핀(GO[47,48,49])) 보충 시 측근 형성 촉진 또는 억제 등 상반된 반응이 보고되었습니다(표 1). 그러나 NO가 위 반응에서 역할한다는 결정적 증거 제공 연구는 없습니다. 본 연구에서 그리이스 시약법, 레이저 주사 공초점 현미경(LSCM), 전자 상자성 공명(EPR) 분석으로 내인성 NO 검출 결과 MWCNT 처리 토마토 묘목에서 NO 수준 증가함을 밝혔습니다. 이후 측근 형성을 관찰했습니다. NO 청소제와 NR, 포유류 NOS 유사 활성 억제 길항제를 사용해 내인성 NO 수준 조작으로 MWCNTs 유도 측근 형성에서 NO 관여를 추가 연구했습니다. 추가 실험으로 NR 의존적 NO가 MWCNTs 반응 측근 형성에 적어도 부분적으로 필수적임이 밝혀졌습니다. 이 연구는 식물에서 나노소재 생물학적 효과 이해 새 지평을 엽니다.

재료 및 방법

시약

별도 언급 없으면 기타 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구매했습니다. Sigma-Aldrich 구매 MWCNTs는 선행 기술[50]로 특성 분석되었습니다. 외경, 내경, 길이는 각각 6–12 nm, 2.5–5 nm, 1–9 μm입니다. 초음파 처리 후 얻은 균질 콜로이드 현탁액을 멸균해 사용했습니다.

기타 탄소 나노입자는 난징 XFNANO 재료 기술 유한회사(중국)에서 구매했습니다: 단일벽 탄소나노튜브(SWCNTs, XFS22; 순도 > 95%, 직경 1–2 nm, 길이 5–30 μm, 비표면적 > 1075 m²/g), 그래핀(XF001W; 순도 ~ 99%, 직경 0.5–5 μm, 두께 ~ 0.8 nm, 단일층 비율 ~ 80%, BET 비표면적 500~1000 m²/g; 전기 저항율 ≦ 0.30 Ω·cm), 활성탄(AC, XFP06; 순도 > 95%, 입자 크기 5 ± 1 μm, 기공 부피 1–1.2 cm³/g, 기공 크기 2.0–2.2 nm, 비표면적 ~ 1500–1700 m²/g).

또한 나트륨 니트로프루시드(SNP)를 NO 공급 화합물로 사용[30,31,32,33]. 2-(4-카복시페닐)-4,4,5,5-테트라메틸이미다졸린-1-옥실-3-옥사이드 칼륨염(cPTIO)을 NO 청소제로 사용[51,52,53,54]. 텅스테이트(Tg; NR 억제제[28, 33, 37, 55,56,57]), N^G-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 염산염(NAME; 포유류 NOS 유사 효소 억제제[25, 33, 36,37,38,39])도 적용했습니다. 본 연구에서 위 화학물질 농도는 유의미한 반응 관찰된 예비 실험에서 결정했습니다.

식물 재료, 생장 조건 및 측근 형성 측정

토마토(Solanum lycopersicum L.) 종자 "Jiangshu 14"는 중국 장쑤성 난징 장쑤 농업연구원에서 제공받았습니다. 크기 동일한 선별 종자를 25 ± 1°C 암조건에서 증류수 발아 3일간 했습니다. 자방 2–3 mm 동일 묘목을 6 mL 처리 용액(지시된 MWCNTs 농도, 200 nM 1-나프틸아세트산(NAA; 잘 알려진 옥신), 0.1 mM SNP, 0.2 mM cPTIO, 20 μM 텅스테이트(Tg), 0.2 mM NAME, 기타 탄소 나노입자 5 mg/mL SWCNTs, 그래핀, 활성탄(AC), 단독 또는 조합)에 옮겨 지시된 시간점까지 배양했습니다. 묘목은 조도 200 μmol m⁻² s⁻¹, 14/10 h(명/암) 광주기, 25 ± 1°C 조명 배양기에서 배양했습니다.

처리 후 사진 촬영, Image J 소프트웨어(https://rsb.info.nih.gov/ij/)[39, 58]로 묘목당 출현 측근(> 1 mm) 개수와 길이 측정했습니다. 선행 기술[58]에 따라 측근 유도 구간만 후속 분석에 사용했습니다.

투과전자현미경으로 MWCNT 분포 영상화

토마토 묘목 뿌리 내 MWCNT 분포를 투과전자현미경(TEM; JEOL, JEM-200CX, Tokyo, Japan)으로 특성 분석했습니다. TEM 분석용 시료 제조는 선행 프로토콜[59] 따랐습니다.

레이저 주사 공초점 현미경으로 내인성 NO 영상화

NO 영상화는 비교적 특이적 NO 형광 프로브 4-아미노-5-메틸아미노-2′,7′-디플루오로플루오레세인 디아세테이트(DAF-FM DA) 사용. 프로브 완전 세척 후 Zeiss LSM 710 공초점 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany, 여기 488 nm, 방출 500–530 nm, NO 분석)으로 영상 획득. 실험에서 처리당 20개 개별 시료 무작위 선정 측정. 사진은 동일 결과 대표입니다.

그리이스 시약 분석으로 NO 함량 측정

선행 방법[50]에 따라 그리이스 시약 분석으로 NO 함량 측정. 중요하게는 식물 내 농축 질산염, 아질산염 간섭 회피 위해 동일 시료를 200 μM cPTIO(NO 청소제)로 30분 예비 배양한 것을 블랭크 시료로 간주. 그리이스 시약 첨가 30분 후 540 nm 흡광도 기록, NaNO₂ 표준 곡선과 비교해 NO 함량 결정.

전자 상자성 공명(EPR)으로 NO 측정

선행 방법[39, 55, 60]에 따라 전자 상자성 공명(EPR)으로 NO 수준 측정. 유기 용매층으로 브루커 A300 분광계(Bruker Instrument, Karlsruhe, Germany)에서 다음 조건으로 NO 측정: 상온; 마이크로파 주파수 9.85 GHz; 마이크로파 파워 63.49 mW; 변조 주파수 100.00 kHz.

질산염 환원효소(NR) 활성 측정

NR 활성은 선행 방법[57]에 따라 분광광도법으로 540 nm에서 측정. 생성된 아질산염은 1% (w/v) 설페닐아마이드 3 M HCl 1 mL와 0.02% (v/v) n-(1-나프틸)-에틸렌디아민 1 mL 첨가 후 540 nm에서 분광광도법 측정.

통계 분석

지시된 경우 결과는 3회 독립 실험, 각 3 생물학적 반복 평균 ± SE로 표현. 통계 분석은 SPSS Statistics 17.0 소프트웨어 사용. 던컨 다중 검정(p < 0.05) 선택.

결과

MWCNTs는 뿌리 세포 진입뿐 아니라 측근 형성 촉진

LR 형성은 근계 구조 주요 결정 인자입니다. MWCNTs가 LR 형성에 미치는 영향 조사 위해 3일령 토마토 묘목을 MWCNTs 농도 범위(0.05, 0.5, 5, 50 mg/mL)로 3일간 배양했습니다. 1-나프틸아세트산(NAA) 적용을 양성 대조군으로 했습니다. 실험에서 LR 개수와 길이를 LR 형성 두 파라미터로 측정했습니다. 그림 1에서 대조군 대비 외인성 MWCNTs가 대략 농도 의존적으로 측근 형성을 유의하게 유도했으며, 5, 50 mg/mL에서 최대 효과. 200 nM NAA 투여 시 유사한 유도 반응 관찰. MWCNTs 비용과 LR 형성 유도 반응 고려해 후속 실험에 5 mg/mL MWCNTs 적용.

MWCNT-induced tomato LR formation was in an approximately dose-dependent manner. Three-day-old tomato seedlings were treated with 200 nM NAA and the indicated concentrations of MWCNTs, respectively. The number and length of emerged lateral root (> 1 mm) per seedling were then determined after 3 days of treatment. There were 30 (10 × 3) plants in three biological replicates, and the experiments were conducted for 3 times. Data are the means ± SE. Within each set of experiments, bars denoted by the same letter did not differ significantly at p < 0.05 level according to Duncan's multiple test

MWCNTs 특이적 기능을 측근 형성 유도에서 검증하기 위해 다른 탄소 동소체도 유사한 유도 효과가 있는지 조사했습니다. 그림 2a에서 모든 탄소 나노소재가 생장 독성 효과 보임(데이터 미표시). 흥미롭게도 동일한 농도(5 mg/mL) MWCNTs, 단일벽 탄소나노튜브(SWCNTs), 그래핀, 활성탄(AC) 적용 시 화학물질 무처리 대조 식물 대비 LR 개수와 길이 증가가 차별적으로 나타남(그림 2b). 이 화학물질 중 MWCNTs 배양 토마토 묘목에서 최대 유도 반응 발견.

Changes in lateral root formation in response to different carbon nanoparticles. Three-day-old tomato seedlings were treated with distilled water (Con), 5 mg/mL MWCNT, single-walled carbon nanotubes (SWCNTs), graphene, and active carbon (AC), respectively, for another 3 days. a Representative photos were then taken. b The number and length of emerged lateral root (> 1 mm) per seedling were then determined as well. Scale bar = 50 mm. There were 30 (10 × 3) plants in three biological replicates, and the experiments were conducted for 3 times. Data are the means ± SE. Within each set of experiments, bars denoted by the same letter did not differ significantly at p < 0.05 level according to Duncan's multiple test

투과전자현미경(TEM) 도움으로 MWCNTs 분포 평가 가능. 그림 3 결과는 외인성 적용 시 MWCNTs가 토마토 묘목에 흡수될 수 있으며, MWCNTs 분포가 뿌리 세포에서 발견됨을 보여줍니다. 이 결과는 묘목 뿌리가 MWCNTs 함유 액체 용액에 직접 배양되므로 이해 가능합니다.

Distribution of MWCNTs in tomato roots. TEM images of 3-day-old tomato seedlings treated with distilled water (Con; a) or 5 mg/mL MWCNTs (b) for 1 day were taken. Red arrow indicates cell wall, while white arrow indicates MWCNTs

MWCNTs 유도 NO 합성 및 그에 이은 LR 형성이 cPTIO(NO 청소제)에 민감

NO가 MWCNTs 유도 측근 형성에도 관여하는지 조사하기 위해 NO 공급 화합물과 청소제로 내인성 NO 수준 조작해 NO 기능을 LR 형성에서 평가했습니다. 선행 결과[31]와 유사하게 나트륨 니트로프루시드(SNP) 투여가 측근 형성 유도 가능했으며, SNP와 MWCNTs 동시 적용 시 첨가 반응 관찰(그림 4). 2-(4-카복시페닐)-4,4,5,5-테트라메틸이미다졸린-1-옥실-3-옥사이드 칼륨염(cPTIO; NO 청소제) 첨가 시 MWCNTs 유도 측근 형성 촉진 반응이 현저히 손상됨. 단독 cPTIO도 화학물질 무처리 대조군 대비 측근 발달 억제, 내인성 NO가 뿌리 기관 형성에서 중요 역할 함 시사.

MWCNT-induced LR formation was sensitive to the removal of endogenous NO with cPTIO, its scavenger. Three-day-old tomato seedlings were treated with distilled water, 5 mg/mL MWCNT, 0.1 mM SNP, 0.2 mM cPTIO, alone or in combination for 3 days. Afterwards, the number and length of emerged lateral root (> 1 mm) per seedling were then determined. There were 30 (10 × 3) plants in three biological replicates, and the experiments were conducted for 3 times. Data are the means ± SE. Within each set of experiments, bars denoted by the same letter did not differ significantly at p < 0.05 level according to Duncan's multiple test

내인성 NO가 MWCNTs 반응에서 중요 역할 추가 평가 위해 그리이스 시약법으로 생체 내 NO 생성 시간 경과 최초 측정. 위 측정에서 동일 여과액을 cPTIO로 30분 전처리한 것을 정확한 결과를 위해 블랭크로 간주. MWCNT 처리 후 토마토 묘목 뿌리 NO 생성이 24시간까지 급격히 증가 후 초기 수준으로 회복(48시간; 그림 5a) 관찰. MWCNTs 24시간 처리 유도 내인성 NO 최대 수준이 cPTIO로 명백히 폐지됨, NO 특이적 역할 시사.

MWCNT-induced NO production was blocked by cPTIO, the scavenger of NO. Three-day-old tomato seedlings were treated with distilled water and 5 mg/mL MWCNTs with or without 0.2 mM cPTIO, respectively. a Changes in NR activity (left), and NO production (right) determined using Griess reagent method. b After treatment for 24 h, the NO signal was analyzed by LSCM (left) and EPR (right). Scale bar = 0.1 mm. Data are the means ± SE. Bars denoted by the same letter did not differ significantly at p < 0.05 level according to Ducan's multiple test

위 결과 확인 위해 LSCM과 ESR 추가 채택. 먼저 세포 투과성, 비교적 NO 특이적 형광 프로브 DAF-FM DA로 NO 표지 후 LSCM 영상화로 토마토 묘목 뿌리 내인성 NO 수준 변화 모니터링. 선행 결과(그림 5a)와 유사하게 cPTIO 존재 시 MWCNTs 유도 DAF-FM 의존 형광 강도 증가가 크게 폐지됨(그림 5b). 이 결과는 DAF-FM 유도 형광이 토마토 묘목 뿌리 내인성 NO 수준과 관련됨 시사.

MWCNTs 유도 NO 생성을 EPR 분광법으로 확인. 예상대로 24시간 MWCNTs 처리 묘목 뿌리에서 NO 복합체 전형적 초미세 구조 삼중항 신호 나타남. 그러나 cPTIO 첨가 시 위 신호 폐지, MWCNTs 노출이 강한 NO 생성 결과함 나타냄(그림 5b). 종합적으로 이 데이터는 NO 합성이 토마토 묘목 MWCNTs 유도 측근 형성에 필요할 수 있음을 시사.

NR이 MWCNTs 유도 NO 생성 및 그에 이은 LR 형성 책임질 수 있음

NR과 포유류 NOS 유사 효소가 식물 NO 합성 관련 두 주요 효소이므로, 텅스테이트(NR 억제제)와 NAME(포유류 NOS 억제제)를 후속 실험 적용. 텅스테이트 처리가 MWCNTs 처리 토마토 묘목 뿌리 측근 형성 촉진 실질적으로 억제(그림 6). 비교적으로 MWCNTs 유도 측근 형성 유도가 NAME 첨가로 강하게 억제되지 않음, 포유류 NOS 유사 효소가 MWCNTs 유도 NO 생성 책임 표적 NO 합성 효소가 아닐 수 있음 시사. 텅스테이트나 NAME 단독 적용 시 토마토 묘목 측근 형성에서 약간이지만 유의미하지 않은 감소 관찰.

Changes in LR formation in response to MWCNTs and two inhibitor of NO synthesis. Three-day-old tomato seedlings were treated with 5 mg/mL MWCNT, 20 μM tungstate (Tg), 0.2 mM NAME, alone or in combination for 3 days. Afterwards, the number and length of emerged lateral root (> 1 mm) per seedling were then determined. There were 30 (10 × 3) plants in three biological replicates, and the experiments were conducted for 3 times. Data are the means ± SE. Within each set of experiments, bars denoted by the same letter did not differ significantly at p < 0.05 level according to Duncan's multiple test

NR이 MWCNTs 유도 측근 형성에서 역할 추가 조사 위해 MWCNTs 단독 또는 텅스테이트 동시 적용 시 NO 생성 모니터링. 내인성 NO 생성 변화(그림 5a)와 비교해 NR 활성 시간 경과 분석도 유사 경향 보임(그림 7a), MWCNTs 처리 후 24시간 피크. 이 결과는 MWCNTs 유도 NO 생성 증가가 주로 NR 활성 증가 결과일 수 있음 시사. 일관되게 텅스테이트에 의한 NR 의존적 NO 생성 저해가 그리이스 시약법(그림 7b), LSCM, EPR(추가 파일 1: Figure S1)로 확인됨.

MWCNT-induced NO production was blocked by tungstate, an inhibitor of NR. Three-day-old tomato seedlings were treated with distilled water and 5 mg/mL MWCNTs with or without 20 μM tungstate (Tg). Changes in NR activity (a) and NO production (b) determined using Griess reagent method. Data are the means ± SE. Bars denoted by the same letter did not differ significantly at p < 0.05 level according to Ducan's multiple test

고찰

식물독성은 나노입자 잠재적 환경 영향 이해에 중요한 고려사항[4, 7, 61,62,63]. 풍부한 증거가 MWCNTs가 식물에 독성 있음을 보여줌: 산화적 손상 유도, 종자 발아 억제, 뿌리 생장 발달 억제[11, 63, 64]. 그러나 SIMR 표현형으로서 뿌리 분지(측근 형성)는 근계가 다양한 환경 신호에 적응하는 중요 구성 요소[17]. 본 연구에서 생물학적, 약리학적, 생화학적 분석 통합해 MWCNTs 유도 측근 형성에서 NR 매개 NO 생성 관여 입증, 적어도 우리 실험 조건에서 부분적으로. 또한 MWCNTs 자극 뿌리 기관 발생에서 NO 기능이 식물 발달 과정과 스트레스 적응에 관여하는 이차 전달물질 중심 역할 강조[29,30,31,32,33, 37, 38].

첫째, 5 mg/mL MWCNTs(외경 6–12 nm)가 뿌리 조직 진입 확인(그림 3). 이후 토마토 측근 형성 유도 관찰(그림 1), NAA와 SNP(그림 4) 유도 역할 모방, 잘 알려진 NO 공급 화합물[30, 31]. 수지성 수목[41], 상추[42], 애기장대[43]에서 MWCNTs(외경 6–13 nm, 약 9.5 nm, 30–40 nm) 도전 시 유사한 유도 반응 발견. 예를 들어 원시 MWCNT(p-MWCCT) 또는 카복실기 기능화 MWCNT(c-MWCNT)(평균 직경 9.5 nm) 적용이 상추 묘목 측근 발달 촉진[42]. 반면 콩 식물에서 MWCNTs(외경 20–70 nm[40]) 처리 시 주근 억제와 측근 형성 억제 동시 발견. MWCNTs 외경 데이터 비교(표 1)로 MWCNTs 측근 형성 효과가 직경에 따라 다름 추론: 낮은 직경에서 촉진, 높은 직경에서 억제. 관련 메커니즘은 신중한 조사 필요. 유사 현상 식물 염분 내성에서 확인[50]. 위 결과 종합 시 나노소재 기능이 종에 따라 다를 수 있고, 역으로 다른 나노소재가 다양한 생물학적 효과 유발 가능. 그러나 MWCNTs 다른 용량[48], 식물 생장 조건 등 기타 영향 인자 배제 어려움.

동일 농도 SWCNT, 그래핀, AC 등 다른 나노소재와 비교 시 MWCNTs에서 최대 측근 형성 유도, 생장 독성 효과도 관찰(그림 2). 이는 MWCNTs 특수 물리적 특성, 즉 높은 전기 전도도, 큰 비표면적, 높은 종횡비, 뛰어난 열 안정성[65] 관련일 수 있음. 나노소재 독성 효과 오이, 배추, 당근, 양파 등에서 널리 보고[66, 67].

충분한 증거가 NO가 신호 분자로 작용해 환경 적응부터 발달, 후자는 종자 발아와 뿌리 기관 형성까지 광범위한 식물 과정 조절함 보여줌[29, 68,69,70,71,72,73]. 후속 실험에서 NO가 MWCNTs 유도 측근 형성 관여 가능성 밝혀짐. 식물 세포 NO 생성 영상 여러 방법 적용됐으나, 감도 부족, NO 비의존적 분자 간섭 등 단점 각 방법 존재 가능[74]. 따라서 그리이스 시약법, LSCM, EPR 세 NO 영상 및 측정 방법과 cPTIO(NO 청소제) 적용을 우리 실험 조건에서 함께 적용. 세 방법으로 MWCNTs 처리 토마토 묘목 내인성 NO 생성 증가가 cPTIO로 폐지됨 관찰(그림 5), NO 청소제[30,31,32]. 중요하게 이 과정이 MWCNTs 유도 측근 발달 생물학적 반응과 연관됨, cPTIO 동시 적용 시 심각하게 차단됨(그림 4).

이 반응들 추가 평가와 외인성 적용 MWCNTs 유도 NO 잠재적 공급원 평가로 NO 생성과 그에 이은 측근 형성이 NR 활성 기인할 수 있음 밝혀짐. 식물에서 NO 생성 주로 NR과 포유류 NOS 유사 단백질서 생성[28]. 그러나 식물 NOS 유전자 여전히 미확인[35, 75, 76], 포유류 NOS 효소 억제제 사용 실험 일부 L-아르기닌 의존 경로 NO 생성 증거 제공[36, 76]. NR은 식물 NO 가장 중요한 공급원 확인[28]. 선행 연구 NR 의존적 NO 생성이 질산염 관련 신호로 뿌리 구조 조절 관여[32, 33]. 또한 NR 의존적 NO 생성 냉순응[38], 염분 내성[50], 압신 유도 기공 폐쇄[77]와 밀접 연관. 우리 결과 추가로 텅스테이트(NR 억제제)가 MWCNTs 유도 측근 형성 명백히 손상, 특히 측근 길이(그림 6). 반면 l-NAME(포유류 NOS 억제제) 사용 시 측근 길이 약간 감소만 관찰, 측근 개수 유의미 차이 없음. 일관되게 생화학 분석서 NR 활성 MWCNTs로 명백히 증가(그림 7a), NO 생성 변화(그림 5a)와 평행. 위 반응 텅스테이트로 완전히 차단 가능(그림 7a, 추가 파일 1: Figure S1). 따라서 MWCNTs 유도 내인성 NO 생성 증가가 주로 NR 경로 기인함 추론. 확실한 유전적 증거 추가 조사 필요.

결론

요약하면, MWCNTs 유도 NO 생성이 NR 경유로 토마토 측근 형성에 필요할 수 있음을 입증하는 증거 제공, 이는 그림 8에 요약. 중요하게 위 발견은 식물에서 MWCNTs 기능 복잡한 분자 메커니즘 통찰 제공.

Schematic representation of the proposed MWCNT-induced tomato lateral root formation mainly via NR-dependent NO production. The role of mammalian NOS-like enzyme was preliminarily ruled out