생강과 마늘로 그린 합성한 산화 니켈 나노입자의 강력한 항균 및 촉매 성능

초록

화학적 독성이 감소한 식물 합성 나노입자(NPs)는 전 세계적으로 주목받으며 최근 나노기술의 필수 요소가 되었습니다. 우리는 생강과 마늘로 식물화학적으로 환원된 NiO-NPs를 제조해 섬유 산업의 합성 살균제와 촉매제를 대체하고자 했습니다. NPs는 자외선-가시광 분광법(UV-Vis), X선 회절(XRD), X선 광전자 분광법(XPS), 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR), 에너지 분산형 X선 분광법(EDS), 주사전자현미경(SEM), 투과전자현미경(TEM)으로 특성 분석했습니다. NP 합성은 XRD와 UV-Vis로 확인되었으며, 350 nm에서 강한 흡수를 보였고 크기는 생강 16–52 nm, 마늘 11–59 nm 범위였습니다. 주사 및 투과전자현미경으로 입방체형과 구형에 가까운 다형성 NPs가 확인되었습니다. 또한 NiO-NP 합성에 사용된 마늘과 생강 추출물의 정확한 양(1:3.6 mL)이 FTIR로 성공적으로 확인되었습니다. 마늘로 식물화학적으로 환원된 NPs는 다제내성 Staphylococcus aureus에 대해 농도 의존적으로(0.5, 1.0 mg/50 μL) 향상된 살균 활성을 보였으며, 메틸렌 블루(MB) 염료도 효율적으로 분해했습니다. 결론적으로 그린 합성 NiO-NPs는 약물 내성 해결과 환경 친화적 촉매제로서 산업적 규모 적용이 유망합니다.

서론

나노기술은 최소 한 차원 크기 1–100 nm인 물질을 다루며, 크기 제어로 물질을 엔지니어링할 수 있는 능력을 제공합니다[17]. NPs는 의학을 포함한 다양한 분야에서 독특한 화학적, 물리적, 생물학적 특성으로 큰 주목을 받았습니다[47]. 그 특성은 나노미터 스케일에서 크기 변경으로 쉽게 조절할 수 있습니다.

니켈(Ni)과 산화 니켈(NiO) NPs는 특정 자기적, 촉매적, 전자적 특성으로 에너지 기술, 자성, 생물의학, 전자공학 등에서 중요합니다[9, 26, 35]. 3.6~4.0 eV의 넓은 밴드갭과 입방 격자 구조를 가진 NiO는 p형 반도체로서 잠재력을 가집니다. 이 NPs는 높은 화학적 안정성, 초전기용량 특성, 전자 전달 능력, 전기촉매 활성으로 생물의학, 광촉매, 항염증, 항균 활성에 사용됩니다[8, 10, 11, 45]. 감염성 질환, 특히 항생제 내성(MDR) 균주의 출현은 전 세계 공중보건을 위협합니다. 일반적으로 병원성 그람양성(G+), 그람음성(G−) 세균 균주가 주요 공중보건 위협입니다.

낙농업에서 소 유방염은 우유의 화학적, 미생물적, 물리적 변화와 유선 선조직 병리 변화를 특징으로 하는 주요 경제적 영향을 미치는 질병입니다[6, 19]. 유방염 원인균에는 세균, 바이러스, 곰팡이 등 감염원이 있으며, 가장 중요한 것은 세균으로 주요 병원체(Streptococci, Staphylococcus aureus, Corynebacterium pyogenes, Coliform)와 부차적 병원체(Corynebacterium bovis, coagulase-negative Staphylococci)로 나뉩니다[25]. 다제내성 그람양성 및 그람음성 세균 균주 출현은 공중보건에 심각한 위협이 됩니다[23, 32].

Zingiber officinale(생강)은 아유르베다와 우나니, 중국 한약에서 중요한 성분으로, 진저볼, 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 세스퀴테르펜 탄화수소 등 다양한 휘발유 성분으로 항구토, 소화 촉진, 류마티즘, 출혈 장애 등 다양한 질환 치료에 쓰입니다[12, 13, 43]. Allium sativum(마늘)은 알릴 설파이드 그룹, 알리인, 아조엔, 알릴 시스테인, 알리신 등 유기황 성분과 비타민, 인지질, 플라보노이드, 아미노산, 지방산 등을 함유해 약리적 특성을 가집니다[14, 24]. 우리는 소 유방염 분리주인 MDR S. aureus에 대한 식물화학적으로 환원된 Ni 금속 산화물 NPs의 살균 작용을 평가하고자 했으며, 이는 수의학 연구 분야에서 파키스탄 최초의 보고가 될 것입니다.

재료 및 방법

본 연구는 식물화학적으로 환원된 NiO-NPs의 MDR S. aureus에 대한 살균 작용을 조사하는 것을 목적으로 했습니다.

재료

질산 니켈[Ni(NO₃)₂], 수산화나트륨(NaOH), 메틸렌 블루(MB), 붕소수소화나트륨(NaBH₄) 분석용 시약은 Sigma-Aldrich®에서 구매했으며, 신선한 생강과 마늘 뿌리는 지역 시장에서 구매했습니다. 뿌리는 그늘에서 건조해 일정 무게가 될 때까지 말린 후 추가 가공했습니다. 항생제 디스크는 Bioanalyse®(터키)에서 구매했습니다. 세균 배양 배지는 TM Media(타이탄 바이오텍, 인도)에서 분석용으로 구매했습니다.

수용액 추출물 제조

생강과 마늘 뿌리를 전기 분쇄기로 미세 분말로 갈아 플라스틱 용기에 보관했습니다. 분말 뿌리를 증류수-DIW(1:10)와 70°C에서 30분간 격렬 교반하며 혼합했습니다. 추출물을 냉각 후 Whatman No.1 여과지로 여과하고 4°C에 보관했습니다(그림 1).

Synthesis scheme of extraction of ginger and garlic and phytochemically reduced NiO-NPs

NiO-NPs 그린 합성

생강과 마늘 수용액 추출물을 다양한 비율(1.2, 1.8, 2.4, 3.0, 3.6, 4.2 mL)로 질산 니켈(0.1 M)에 첨가하며 지속 교반했습니다. 교반 용액 pH 12를 NaOH(2 M)로 유지하며 90°C에서 2시간 반응시켰습니다. 생성된 침전물을 10,000 rpm으로 10분 원심분리하고 DIW로 세척한 후 90°C 열풍 건조기에서 하룻밤 건조했습니다(그림 1 참조).

특성 분석

합성된 NPs의 흡수 극대(λ_max)를 UV-가시광 분광광도계(Genesys 10 S)로 200–800 nm 파장에서 측정했습니다. 상 조성과 구조 정보는 X선 회절(XRD) BUNKER D2 phaser로 2θ 범위(10–80°), Cu Kα1 방사선(λ = 1.540 Å) 조건에서 분석했습니다. 그린 합성 NiO-NP의 작용기는 푸리에 변환 적외선 분광법(ATR-FTIR)으로 기록했습니다. NPs 크기, 형태, 원소 분석은 전계 방출 전자현미경(FESEM)과 투과전자현미경 Hitachi H7100FA(TEM)으로 분석했습니다. 시료 조성과 해당 밴드갭은 X선 광전자 분광법(XPS)으로 조사했습니다.

MDR S. aureus 분리 및 동정

S. aureus 분리

파키스탄 펀자브주 민간 및 공공 수의학 병원과 농장에서 채취한 임상 양성 소 우유 시료를 5% 양혈 한천에 배양하고 37°C에서 24–48시간 배양했습니다. 얻어진 특징적 집락을 만나톨 소금 한천(MSA) TM Media(타이탄 바이오텍, 인도)에 3중으로 스트리킹해 정제된 S. aureus를 분리했습니다.

MDR S. aureus 동정

세균 집락 동정은 형태적 특성, 그람 염색, 생화학적 절차(응고효소 및 카탈라아제 시험)를 버지의 확정 세균학 매뉴얼에 따라 수행했습니다.

특징적 집락의 항생제 감수성은 국립임상실험실표준위원회(NCCLS) 지침에 따른 디스크 확산법으로 평가해 MDR S. aureus를 분리했습니다. 옥시테트라사이클린(30 μg), 틸로신(30 μg), 겐타마이신(10 μg), 시프로플록사신(5 μg), 트리메토프림+설파메톡사졸(1.25 μg+23.75 μg) 항생제 디스크를 멸균적으로 뮬러-힌턴 한천(MHA) TM Media(타이탄 바이오텍, 인도) 1 × 10⁸ CFU/mL에 도포하고 37°C에서 24시간 배양했습니다[7]. 최소 3개 항생제에 내성인 균주를 MDR로 판정했습니다[28].

항균 활성

유방염 우유에서 분리한 MDR S. aureus 대표 10주에 대해 한천 웰 확산법으로 식물화학적으로 환원된 NiO-NPs의 체외 항균 작용 잠재력을 평가했습니다. 페트리 접시를 1.5 × 10⁸ CFU/mL(0.5 맥팔랜드 표준) MDR S. aureus로 MSA에 도말했습니다. 멸균 코르크 보러로 6 mm 직경 웰을 형성했습니다. 생강, 마늘 개별 수용액 추출물과 그린 합성(식물화학적으로 환원) NiO-NPs 다양한 농도를 적용했습니다. 수용액 추출물은 (10 mg/100 μL), (50 mg/100 μL), NiO는 (0.5 mg/50 μL), (1.0 mg/50 μL) 농도로 사용했습니다. 시프로플록사신(0.005 mg/50 μL)을 양성 대조군, DIW를 음성 대조군(50 μL)으로 사용했습니다.

통계 분석

항균 효능은 저해존 크기(mm)로 계산했으며, 저해존 직경은 SPSS 20으로 일원분산분석(ANOVA) 통계 분석했습니다.

촉매 활성

신선 제조한 수용성 붕소수소화나트륨(300 μL)을 메틸렌 블루(0.03 × 10⁻³ M) 용액 3 mL와 혼합했습니다. 이후 원하는 농도의 콜로이드 시료 300 μL를 첨가했습니다. 메틸렌 블루 염료(MB)의 연한 파란색 색상이 사라지며 류코메틸렌 블루로 환원됨을 그림 2에 보였습니다. 흡광도를 UV-Vis 분광광도계로 200–800 nm에서 측정했습니다.

Schematic diagram for catalytic reduction of MB to LMB by green synthesized NPs

결과 및 고찰

생강과 마늘 수용액 추출물로 식물화학적으로 환원된 NiO의 200–600 nm 광학적 특성을 그림 3a, b에 나타냈습니다. NiO-NPs에서 최대 흡수(λ_max)는 350 nm 부근(1:3.6 mL)에서 관찰되었으며, 추출물 농도 증가에 따라 청색 이동을 동반하며 증가했습니다. 생강과 마늘 추출물 흡수 피크는 각각 275, 280 nm 부근에 나타났습니다. 뿌리 추출물 첨가 후 반응 혼합물 색상이 적포도주색에서 연한 녹색으로 급격히 변했습니다. 피크 확대는 추출물 농도에 따른 입자 응집과 NiO에서 원자가띠에서 전도띠로의 전자 전이를 강한 흡수 밴드로 나타냅니다[20]. 따라서 그림 3a, b에서 최적값(1:3.6 mL) 이상 또는 이하로 추출물 부피가 변하면 합성 NPs 흡수가 감소함을 보입니다. 밴드갭은 타우크 플롯(식 1)으로 계산했습니다.

$$ (\alpha hv)=B(hv-E_g)^{1/2} \tag{1} $$

a–d Absorption spectra of green synthesized NiO-NPs with ginger (a) and garlic extract (b). Band gap of phytochemically reduced NiO by ginger (c) and garlic (d) respectively

여기서 α는 흡수 계수, h는 플랑크 상수, B는 상수, υ는 광자 주파수, E_g는 에너지 밴드갭입니다. (αhυ)^1/2 대 광자 에너지(hυ) 그래프에서 추정된 밴드갭. x축에 대한 접선의 절편을 기록해 시료 밴드갭 에너지를 얻었습니다(그림 3c, d). 생강 도핑으로 NiO 밴드갭 에너지가 4.15에서 3.1 eV로, 마늘로 3.5에서 3.0 eV로 변동됨이 확인되었습니다(그림 3c, d).

NiO-NPs 결정성, 크기, 상 조성은 XRD로 확인했습니다(그림 4a, b). 2θ 값 37.10°, 43.32°, 62.81°, 76.51° 피크는 (111), (200), (220), (311)에 해당합니다(JCPDS 카드 번호: 00-047-1049, 그림 4a, b)[30]. 피크 강도는 생강 환원 NiO-NPs 평균 크기 32.9 nm, 마늘 환원 29.92 nm로 계산된(D = 0.9λ/βcosθ) 육방 및 면심입방(fcc) NiO를 나타냅니다. 넓은 피크는 시료 내 산소 공극과 국소 격자 무질서 존재를 나타냅니다[38]. 생강의 다양한 식물화학물질(플라보노이드, 알칼로이드, 탄닌, 사포닌)과 마늘 수용액 추출물(알리신, 알릴 설파이드, 알리인, 지방산, 글리콜리피드, 페놀, 아미노산, 플라보노이드)은 금속 산화물 NPs 평균 결정립 크기를 결정하는 캡핑제 역할을 합니다[14, 46].

XRD pattern of different concentrations of phytochemically reduced NiO by ginger (a) and garlic (b) and standard NiO (c)

생강과 마늘 뿌리에서 생물합성된 NiO의 FTIR 스펙트럼을 그림 5a, b에 기록했습니다. 3380 cm⁻¹에서 정교한 넓은 흡수는 OH에 해당하며, 피크 확대는 카르보닐기와 (N-H) 아민 신축 진동수를 나타냅니다[50]. 2313 cm⁻¹에서 날카로운 흡수는 공기 중 또는 NP 입자 내 CO₂ 신축 진동을 나타냅니다. 대기 CO₂ 급속 흡수는 물질 표면적이 큼을 나타냅니다[18]. 1629 cm⁻¹에서 넓은 흡수는 C=C 방향족 고리 신축에 해당하며, 1392, 1064 cm⁻¹에서 날카로운 피크는 C-N 지방족 아민 신축 진동에 해당합니다[48]. 978 cm⁻¹에서 강한 피크는 NiO 금속-산소 신축 진동수를 확인합니다[44].

FTIR spectra with ginger extract to NiO (a) and garlic (b)

NiO 생물환원 후 관찰된 피크 이동(2535–2313, 1828–1629, 1585–1392 cm⁻¹)은 케톤, 알코올, 카르복실산, 아민 작용기를 가진 식물화학물질, 테르페노이드, 플라보노이드, 폴리올, 단백질이 생물환원에서 킬레이트화와 캡핑을 담당함을 나타냅니다[42].

식물화학적으로 환원된 NiO-NPs 표면 형태와 크기는 전계 방출 주사 및 투과전자현미경으로 결정했습니다(그림 6a–f). NiO-NPs는 입방체와 구형에 가까운 다형성을 보이며(< 50 nm) 약간의 응집이 있습니다[40]. NPs 응집은 폴리머 부착과 입자 간 자기적 상호작용 때문일 수 있습니다[49].

a–f SEM image of phytochemically reduced NiO by ginger (a) and garlic (b). TEM image of phytochemically reduced NiO with ginger (c) and garlic (d) and size distribution of phytochemically reduced NiO by ginger (e) and garlic (f)

합성 NiO-NPs의 원소 분석과 추가 특성은 에너지 분산형 X선 분광법(EDS)으로 기술되었으며, 순수 NiO 상을 확인했습니다(그림 7a, b). EDS 스펙트럼은 1–10 kV 사이에서 검출된 시료 내 고순도 Ni와 직접 관련된 세 피크를 확인했습니다. 스펙트럼으로 관찰된 원자 중량 백분율은 Ni, O, C, Zn 각각 54.69, 27.81, 18.06, -0.55%입니다.

a, b EDS spectrum of green synthesized NiO-NPs

XPS는 그림 8a–d에 식물화학적으로 환원된 NiO-NPs의 C1s, O1s, Ni2p 스펙트럼을 보여주며 합성 시료 화학적 성질과 결합 상태를 시사합니다. 284.8, 286.2 eV에서 가장 강한 피크는 C1s 스펙트럼(그림 8b)으로 C-C, C-OH/C-O-C에 해당합니다[21]. O1s 피크 530.8 eV(그림 8c)는 산소 원자 수산기, 니켈 공공 인접 산소 원자, 또는 산소 결합 탄소 원자 C=O에 기인할 수 있습니다[1, 15, 37]. 532.2 eV 기여는 흡착 수분자 산소 원자(NiOH)에 기인합니다[31, 41]. Ni2p 스펙트럼은 Ni2p3/2, Ni2p1/2 피크를 포함하며 가우시안-로렌치안 함수로 다섯 성분으로 분리됩니다(그림 8d). 872.72, 855.82 eV에서 가장 강한 피크는 각각 Ni2p1/2, Ni2p3/2에 속하며 대응하는 위성 피크는 879.36, 861.57 eV입니다[16]. Ni(2p1/2)와 Ni(2p3/2), NiO-NP 코어 레벨 간 스핀-궤도 분리는 17.28 eV로 선행 보고와 잘 일치합니다[33, 34].

a–d XPS survey of phytochemically reduced particles (a), C1s orbitals (b), O1s spectra of NiO (c), and Ni2p (d)

생강, 마늘 뿌리 추출물과 그린/식물화학적으로 환원된 NiO-NPs의 항균/살균 작용을 한천 웰 확산법으로 저해존 측정(mm) 평가했습니다(그림 9a–d, 표 1). 결과는 NP 농도와 저해존(mm) 간 강한 관계를 보여줍니다. 시료 1(1.2 mL:1), 2(1.8 mL:1), 3(2.4 mL:1), 4(3 mL:1), 5(3.6 mL:1), 6(4.2 mL:1)에서 유의미한 저해존(P < 0.05)이 기록되었으며, 생강 환원 NiO-NPs 저농도와 고농도에서 각각 (3–4.9 mm), (3.05–5.2 mm) 범위(그림 9c, d), 마늘 환원 NPs는 MDR S. aureus에 대해 (3.15–5.3 mm), (3.75–5.9 mm) 범위(그림 9e, f)를 보였습니다. 생강 뿌리 수용액 추출물은 0 효능(그림 9a), 마늘 뿌리는 저농도 2.65 mm, 고농도 5 mm 저해존을 보였습니다(그림 9b). 모든 결과는 음성 대조군 DIW(0 mm), 양성 대조군 시프로플록사신(12.55 mm)과 비교했습니다. 전반적으로 마늘로 식물화학적으로 환원된 NiO-NPs가 MDR S. aureus에 대해 유의미하게(P < 0.05) 향상된 살균 작용을 보였습니다.

a–f In vitro antimicrobial activity of ginger aqueous extract (a), garlic (b), and NiO-NPs phytochemically synthesized by ginger extract at low and high doses (c, d) and garlic (e, f)

합성 나노소재 표면적, 형태, 입자 크기 등 다양한 요인이 산화 스트레스 내성 차이에 관여하며 항균 작용 잠재력에 추론적 역할을 합니다[29, 36]. 세균 균주와 나노스케일 물질 간 정전기적 상호작용으로 반응성 산소종 생성이 유도돼 세균 세포 사멸을 초래합니다[2,3,4,5, 22]. 나노소재와 세균 균주 반응으로 두 가지 반응이 가능합니다: 양이온 Ni²⁺가 세균 세포 음전하 부분과 강하게 상호작용해 붕괴 유도, 두 번째는 빛 조사 시 NiO 표면에서 원자가띠에서 전도띠로 전자 여기, 이후 O₂와 전자 반응으로 O₂⁻ 라디칼 생성 후 H₂O₂ 생성. h⁺가 물과 반응해 ·OH 생성. 결과적으로 O₂⁻·, ·OH 종이 세균 세포 외표면 지질 또는 단백질 분자 분해에 중요한 역할을 합니다[39].

촉매 활성

그림 10a–e는 뿌리 추출물과 그린/식물화학적으로 환원된 NiO-NPs 존재 하 상온에서 MB 촉매 환원을 보여줍니다. 그림 10a는 통상적 경로 합성 NiO-NPs 촉매 잠재력, (그림 10b, c)는 생강, 마늘 뿌리 수용액 추출물 촉매 잠재력입니다. 식물화학적으로 환원된 NiO-NPs 촉매 능력은 그림 10d, e에 나타냈습니다. NiO와 식물 뿌리 추출물은 효율적 나노촉매가 아니며 메틸렌 블루 환원에 각각 15, 21, 38분 소요되었습니다(그림 10a–c). 생강 매개 NiO-NPs는 빠른 분해(λ_max = 8분)로 MB를 류코메틸렌 블루로 효율적 전환했습니다(그림 10d). 마늘 매개 NiO-NPs는 5분 만에 100% 염료 환원 유사 패턴을 보였습니다(그림 10e).

a–e Catalytic activity of NiO (a), ginger extract (b), garlic extract (c), phytochemically reduced NiO by ginger (d), and garlic reduced NPs (e)

그린/식물화학적으로 환원된 NPs는 전자 공여체(BH₄)에서 수용체(MB)로 전자 전달하고 활성화 에너지 감소로 시스템을 안정화해 유의미한 촉매 염료 분해를 수행합니다[27]. 데이터는 그린 NPs가 통상적 NPs와 개별 추출물보다 효율적 나노촉매임을 보여줍니다.

결론

생강, 마늘 뿌리 추출물을 함유한 NiO-NPs는 우수한 살균제이자 촉매제 역할을 했습니다. 식물화학기 함유 뿌리 추출물 도입으로 성공적 NiO-NP 합성이 FTIR로 확인되었습니다. XRD 피크는 NiO 육방 및 면심입방(fcc) 격자 확인, SEM은 입방체와 구형에 가까운 다형성 NP 형태 확인, 평균 크기 16–52 nm(생강 도핑), 11–59 nm(마늘 도핑). 원소 분석은 EDS와 XPS로 화학적 성질과 결합 상태 분석, 실제 니켈과 산소 비율 제시. UV 분석은 350 nm 범위 흡수 피크 차이 확인, 도펀트 증가 시 청색 이동 도입. 식물화학적으로 마늘 환원 NiO가 고농도에서 생강 환원 NPs보다 MDR S. aureus에 더 강력하며 MB도 효율적 환원. 따라서 마늘 뿌리 추출물 그린/식물화학적으로 환원된 NiO는 항생제 내성 대체제로서 첨단 의학, 환경 유해 없는 촉매제로서 섬유 산업에 채택될 수 있습니다.

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