전이성 유방암 치료를 위한 면역 관문 억제와 결합된 광열 요법을 위한 표적 단일벽 탄소 나노튜브

자료 및 방법

자료

ANXA5를 인코딩하는 플라스미드인 pET-30 Ek/LIC/ANX는 이 실험실에서 이전에 구성되었습니다[11]. 소 혈청 알부민(BSA), Triton X-100, EDTA, β-mercaptoethanol, phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF) 및 Tris-acetate-EDTA 완충액은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO)에서 구입했습니다. 인산 나트륨 및 황산 도데실 나트륨(SDS)은 Mallinckrodt Chemicals(Phillipsburg, NJ)에서 구입했습니다. HPLC 등급 에탄올은 Acros Organics(매사추세츠주 월섬)에서 구입했습니다. His-trap 컬럼은 GE Healthcare(일리노이주 시카고)의 제품이었습니다. 유세포 분석 염색 완충액, 고정/침투 완충액, 투과 완충액, 발색성 내독소 정량 키트 및 Slide-A-Lyzer 투석 카세트(3.5kDa)는 Thermo Fisher Scientific(매사추세츠주 월담)에서 구입했습니다. 2 및 100kDa 투석막은 Spectrum Laboratories(Rancho Dominguez, CA)에서 구입했습니다. Roswell Park Memorial Institute 세포 배지(RPMI-1640) 및 Hank의 균형 염 용액은 ATCC(Manassas, VA)에서 가져왔습니다. 소태아 혈청(FBS)은 Atlanta Biologicals(Lawrenceville, GA)에서 구입했습니다. 트립톤, 효모 추출물 및 카나마이신 모노설페이트는 Alfa Aesar(Ward Hill, MA)에서 입수했습니다. 수산화나트륨, 염화칼륨 및 염화나트륨은 VWR Inc(Radnor, PA)에서 구입했습니다. HRV-C3 프로테아제는 Sino Biologics(Portland, OR)에서 구입했습니다. 항-CTLA-4 마우스 모노클로날 항체(클론:9H10) 및 마우스 사이토카인 ELISA 키트(TNF-α, IFN-γ, IL-6)는 BioLegend(San Diego, CA)에서 구입했습니다. CoMoCAT SWCNT(평균 직경 0.8 ± nm, 평균 길이 1.5 ± 0.5μm)는 CHASM(Boston, MA)에서 입수했습니다. CoMoCAT 방법은 소수(n ,나 ) 높은 선택성을 가진 키랄성 [19]. 이 연구에 사용된 샘플은 980nm의 파장에서 강한 NIR 광 흡수를 나타내는 [5, 6] SWCNT가 매우 풍부합니다. 이 흡수는 S₁₁에 해당합니다. 점유된 반 호브 특이점에서 해당 비점유 특이점으로의 이러한 유형의 나노튜브 전환. 따라서 종양에 침착된 SWCNT에 의한 방사선 흡수를 최대화하기 위해 본 연구에 사용된 레이저의 파장은 S₁₁의 파장과 정확히 일치하도록 980nm였습니다. 광학 전이 [20]. 추가 파일 1의 그림 S1은 S₁₁을 명확하게 보여주는 형광 스펙트럼을 보여줍니다. 가시광선으로 S22 전이를 자극한 후 NIR 방출.

세포 배양

ATCC(Manassas, VA)의 EMT6 유방암 세포는 15% FBS가 보충된 2mM L-글루타민이 포함된 Waymouth의 MB 752/1 배지에서 배양되었습니다. 모든 세포는 37°C 및 100% 습도에서 5% CO₂에서 성장했습니다. . 모든 세포는 0.53mM EDTA에서 0.25%(w/v) 트립신을 사용하여 계대되었습니다. 세포 계통과 마이코플라스마가 없는 상태는 STR 테스트(Charles River)를 통해 확인되었으며 리물루스 분석을 통해 내독소가 없는 것으로 분석되었습니다.

ANXA5 및 SWCNT-ANXA5 제작

SWCNT-ANXA5 접합체는 2.5mg ANXA5/mg SWCNT를 제공하는 이전에 개발한 절차를 사용하여 준비되었습니다[11]. 간단히 말해서, E. 대장균 ANXA5를 암호화하는 플라스미드, pET-30 Ek/LIC/ANX로 형질감염된 것을 고정화 Ni ²⁺ 가 있는 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 성장시키고 정제했습니다. (His)₆를 제거하기 위해 효소 절단을 포함하는 ANXA5를 분리합니다. 꼬리표. 동결 건조된 CoMoCAT SWCNT는 각각 30분 동안 20W에서 프로브 초음파 처리 및 29,600g에서 원심분리의 두 사이클을 사용하여 1% 도데실 황산나트륨(SDS)에 분산되었습니다. 정지된 SWCNT는 NIR 형광(추가 파일 1:그림 S1)으로 특성화한 다음 30분 동안 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜-말레이미드(DSPE-PEG-말레이미드) 링커에 접합되었습니다. 실온에서 SWCNT와 DSPE 작용기 사이의 소수성 상호작용을 허용합니다. 그런 다음 증류수에서 8시간 투석하여 과도한 링커와 SDS를 제거했습니다. 그런 다음 투석된 접합체를 1개의 시스테인 그룹을 포함하는 ANXA5와 2시간 동안 반응시키고 1.5mg ml ⁻¹ 로 차단했습니다. L-시스테인. 최종 제품인 SWCNT-ANXA5를 20mM 인산나트륨 완충액에 대해 8시간 동안 투석하여 과량의 ANXA5 및 L-시스테인을 제거했습니다. 단백질 중량 및 순도는 SDS-PAGE를 통해 특성화되었습니다. 생체 접합체의 SWCNT 및 ANXA5 함량은 UV-Vis-NIR 형광 분광법, 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR) 라만 분석 및 Bradford 분석으로 특성화되었습니다(추가 파일 1:그림 S2).

체내 연구

모든 절차는 University of Oklahoma의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜을 준수했습니다. 6주령의 암컷 BALB/cJ 암컷 마우스를 사용했습니다(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). 마우스에게 표준 식단을 먹였습니다. NIR 레이저 광으로 종양에 광열 조사를 하는 동안 마우스는 코 콘을 사용하여 2% 이소플루란과 98% 산소로 마취되었습니다.

종양은 10 ⁶ 의 정위 주사에 의해 유도되었습니다. IV 유방 지방 패드에 PBS 100µL의 EMT6 마우스 유방암 세포. 종양이 12일 동안 자라도록 두었다가 60mm ³ 의 부피에 도달했을 때 (~ 5mm 직경), 마우스는 전신 i.v. 측면 꼬리 정맥을 통해 SWCNT-ANXA5(체중 kg당 SWCNT mg) 생체접합체 1.2mg/kg 주입. 3시간 후, 종양 경계를 초과하는 5mm 영역에 175J/cm ² 의 에너지 및 전력 수준에서 NIR 광(980nm)을 조사했습니다. 및 1W/cm ² , 각각(175초의 시간, Diodevet-50 NIR 레이저, B&W Tek Inc., Newark, DE). 체크포인트 억제는 직렬 i.p. 종양 접종 후 8일, 11일 및 16일에 PBS 100μl에 항-CTLA-4 항체 200μg 투여. 종양 부피는 수정된 타원체 공식 \(V =\frac{1}{2} \times {\text{length}} \times {\text{width}}^{2}\)으로 계산되었으며, 가장 긴 치수 및 수직 너비. 종양 온도는 최대 감지 온도를 자동 스캔하도록 설정된 휴대용 FLIR TG165 Spot 열화상 카메라(Raymarine ITC, Fareham, UK)로 모니터링했습니다. 독성 평가를 위해 표적 장기를 적출하여 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고 염색된 FFPE(formalin-fixed-paraffin-embedded) 슬라이드를 제작하여 독성 분석을 위해 hematoxylin과 eosin으로 염색하였다.

Ex Vivo SWCNT 감지

마우스는 측면 꼬리 정맥을 통해 1.2mg/kg의 SWCNT-ANXA5(mg SWCNT/kg 체중)를 전신 주사했습니다. 특정 시점에서 마우스(n =3)을 안락사시키고, 부검하고, 분석을 위해 표적 장기를 제거하였다. 조직 샘플은 이전에 설명한 대로 준비되었습니다[21]. 생체 외 조직 샘플에서 SWCNT의 존재는 NS3 NanoSpectralyzer(Applied NanoFluorescence, Houston, TX)를 사용하여 상대 NIR 형광 분광법에 의해 결정되었습니다.

유세포분석

마우스는 치료 후 14일에 안락사되었고, 비장 항종양 면역 효과기 세포는 이전에 설명된 대로 정량화되었습니다[21].

사이토카인 검출

위에서 설명한 대로 처리한 후 마우스(n =4–5) 혈액 수집을 위한 광열 요법 후 7일에 안락사되었습니다. 희석된 혈청 샘플에서 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ) 및 인터루킨 6(IL-6)의 농도는 공급업체의 프로토콜에 따라 ELISA로 정량화되었습니다.

통계 분석

데이터는 Graphpad Prism 소프트웨어로 분석되었습니다. 일원 ANOVA 및 Tukey-Kramer 다중 비교 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 평가했습니다. 생존 곡선의 통계적 유의성은 Mantel-Haenszel 로그 순위 검정에 의해 결정되었습니다. 사이토카인 혈청 농도의 통계적 유의성은 일원 ANOVA 및 Dunnett의 다중 비교 검정에 의해 분석되었습니다. 다중 비교는 Bonferroni 임계값에 의해 수정되었습니다. 오차가 표시된 평균점 기호의 크기를 초과하지 않는 한 오차는 평균의 표준 오차로 그래픽으로 표시되며, 이 경우 명확성을 위해 막대가 제외됩니다.

결과

열역학

1.2mg/kg SWCNT-ANXA5의 용량을 사용하여 그림 1에 표시된 대로 NIR 광선으로 치료하는 동안 종양의 최대 온도를 기록했습니다. 생리 식염수를받은 마우스와 비교하여 전체 NIR 광 치료. SWCNT-ANXA5를 투여한 마우스의 종양 평균 온도는 생리 식염수를 투여한 마우스의 종양 온도와 상당히 달랐습니다(54 °C 대 37 °C, p <0.05). 이러한 강화된 광열 요법의 결과로 SWCNT-ANXA5 그룹에서만 가시적인 종양 절제가 발생했습니다. 종양 절제는 빠른 변색, 피부 수축 및 주름의 출현을 특징으로 합니다. 48시간 이내에 광열 제거 부위에 상당한 가피가 형성되었습니다. 완전한 피부 재생에는 몇 주가 걸렸습니다.

980nm에서 NIR 빛으로 종양을 조사하여 발생하는 열 역학입니다. EMT6 종양이 있는 BALB/cJ 마우스에 i.v. 꼬리 정맥에 1.2mg/kg SWCNT-ANXA5 순환에서 SWCNT가 제거될 때까지 3시간을 기다린 후 종양에 NIR 레이저를 175J/cm ² 의 에너지 및 전력 밀도로 조사했습니다. 및 1W/cm ² , 각각 (t =175초). 종양의 최대 온도는 시간의 함수로 기록되었습니다. SWCNT를 투여한 마우스의 종양 온도는 t에서 생리 식염수를 투여한 마우스보다 상당히 높았습니다. =175 초(p <0.05). 데이터는 평균 ± SE(n =3)

광열 요법 및 검문소 억제

항CTLA-4 단일클론항체를 이용한 광열 요법과 체크포인트 억제를 결합한 결과는 그림 2에 나와 있습니다. 광열 요법만으로는 원발성 유방암 신생물을 쉽게 근절하는 반면, 근적외선 레이저 광선이 몇 mm 이상을 투과하지 못하는 것은 한계가 있습니다. 유방암 전이의 치료. 국소 NIR 광열 항종양 치료의 단점을 극복하기 위해 우리는 이 독특한 치료 방식과 전신 체크포인트 억제의 조합을 탐구했습니다(그림 2). 광열 요법은 원발성 EMT6 종양을 파괴하는 데 탁월했지만(그림 2a), 이 치료법은 전이를 근절하지 못했고 EMT6 동위 종양이 있는 마우스의 생존을 약간만 증가시켰습니다(그림 2b). 대조적으로, 항-CTLA-4를 사용한 체크포인트 억제는 전체 생존을 향상시켰지만 일시적인 원발성 종양 성장을 지연시켰습니다. 두 요법 모두 단독으로 전체 생존을 증가시키지는 않았지만 SWCNT-ANXA5 강화 광열 요법과 항-CTLA-4 체크포인트 억제를 모두 병용하면 전체 생존이 향상되어 종양 접종 후 100일에서 55%의 생존을 달성했습니다.

EMT6 종양에서 조합 광열 요법(PTT) 및 체크포인트 억제(항-CTLA-4)의 결과. 잘 발달된 동위 동계 종양이 있는 마우스(d ≥ 5 mm)는 i.v. 1.2mg/kg SWCNT-ANXA5의 전신 용량. 아 그런 다음 1W/cm ² 의 출력 밀도에서 175초 동안 NIR 레이저 광을 조사(화살표)한 후 종양 부피를 모니터링했습니다. 접종 후 12일째. PTT에 추가하여 일부 그룹에는 8, 11, 16일에 항CTLA-4(100μg)를 투여했습니다. 대조군의 마우스에는 정맥내 주사를 맞았습니다. 생리 식염수로. 평균 ± SE로 표시되는 종양 부피(n =7). 대조군과의 유의성은 *(p <0.05). ㄴ 광열 요법과 면역 관문 억제의 조합은 대조군에 비해 생존을 유의하게 증가시켰습니다(p <0.05, n =7). ㄷ , d 마우스가 항CTLA-4 체크포인트 억제와 함께 광열 요법을 받은 경우에만 CD4 ⁺ 의 상대적인 수가 크게 증가했습니다. 및 CD8 ⁺ PTT 후 2주에 관찰된 비장세포. 평균 ± SE로 표시되는 비장세포(n =3). 의미는 ***로 표시됩니다(p <0.005)

치료 후 비장 효과기 세포의 세포계측 분석은 조합 광열 요법 및 체크포인트 억제를 받은 마우스에서 개선된 생존의 추정 메커니즘을 밝혀냈습니다. 마우스에 EMT6을 접종하고 앞서 설명한 대로 처리했습니다. 처리 2주 후, 마우스를 희생시키고 다중 면역 이펙터 유형의 백분율 및 상대 수를 정량화했습니다. 도우미 T 세포, 세포독성 T 세포, 호중구, 골수 유래 억제 세포(MDSC) 단핵구, FoxP3 조절 T 세포 및 대식세포의 개체군을 평가했습니다(추가 파일 1:그림 S3). 이들 집단의 분석은 광열 요법과 항-CTLA-4 체크포인트 억제를 함께 받은 마우스에서만 처리 집단과 대조군 사이에 상당한 차이를 나타냈다. 이 조합을 받은 동물에서 도우미 T 세포(CD4 ⁺ ) 및 세포독성 T 세포(CD8 ⁺ ), (그림 2c, d). CD4 ⁺ 증가 및 CD8 ⁺ 부검 후 관찰된 비장 크기의 총 증가와 상관관계가 있는 세포 수.

비장 효과기 세포의 세포 측정 분석 외에도 항종양 면역의 메커니즘을 설명하는 데 도움이 되도록 PTT 후 7일에 혈청 사이토카인 농도를 측정했습니다. 전염증성 사이토카인 IL-6, IFN-γ 및 TNF-α의 수준이 그림 3에 나와 있습니다. SWCNT나 항-CTLA-4 단독 치료는 처리되지 않은 대조군과 비교하여 사이토카인 수준을 유의하게 증가시키지 않았습니다. 그러나 PTT 치료 단독으로 TNF-α를 유의하게 증가시킬 수 있었습니다. PTT 치료에 항-CTLA-4를 추가로 추가하면 TNF-α, IL-6 및 IFN-γ 수준이 유의하게 증가했습니다.

혈청 사이토카인 농도. PTT 7일 후 마우스 혈청에서 혈청 사이토카인 수준의 정량화는 체크포인트 억제(항-CTLA-4)와 함께 PTT 후 마우스에서 IL-6, IFN-γ 및 TNF-α 수준의 유의한 증가를 보여주었습니다. 결과는 처리되지 않은 대조군, SWCNT 처리만, 항-CTLA-4 처리만, PTT 처리, 및 PTT + 항-CTLA-4 처리에 대해 표시됩니다. 데이터는 평균 ± SE(n =4–5). Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하여 일원 분산 분석에 의해 처리되지 않은 대조군과 비교하여 처리된 그룹에 대한 통계적 유의성을 분석했습니다. 통계적 유의성은 *(p <0.05) 및 ****(p <0.0001)

SWCNT-ANXA5의 생물 분포 및 독성

다양한 기관에서 광열 요법 향상을 위한 투여 후 SWCNT-ANXA5의 생체 분포는 표준과 비교하여 현장 조직 용해물에서 SWCNT의 형광 정량화로 모니터링되었습니다(추가 파일 1:그림 S4). 표적 기관에서의 생체 분포는 i.v. 건강한 마우스에 1.2mg/kg SWCNT-ANXA5 주입(그림 4a, b). 대조적으로, 이전에 설명된 주사 프로토콜에 따라 투여 후 EMT6 종양 보유 마우스에서 SWCNT-ANXA5의 축적은 투여 후 3시간에 결정되었습니다. (치료 연구에서 광열 요법이 수행된 시간.) 장기 적출 전 4개월 동안 마우스의 신체적 부작용 및 비정상적인 행동을 모니터링했습니다. 이 기간 동안 SWCNT-ANXA5를 주사한 모든 마우스에서 부작용이 관찰되지 않았습니다. 연구 종료 시 표적 기관의 헤마톡실린 및 에오신 염색 FFPE 절편을 검사하는 동안 조직병리학적 독성이 관찰되지 않았습니다(추가 파일 1:그림 S5).

주사 용량의 %로 측정된 SWCNT-ANXA5의 생체 분포(a ) 및 조직 농도(g/L)(b) ). SWCNT-ANXA5 접합체는 i.v. Balb/cJ 마우스에 1.2mg/kg의 용량으로 주사했습니다. SWCNT 농도는 1, 2, 3, 4개월 후(왼쪽에서 오른쪽으로) 종양이 없는 마우스의 다양한 기관에서 측정되었습니다. 종양이 있는 마우스의 경우, SWCNT의 농도는 광열 요법 치료 직전과 동일한 시점에서 측정되었습니다. 데이터는 평균 ± SE(n =3)