microRNA-342-5p의 하향 조절 또는 Wnt3a의 상향 조절은 동맥경화증 마우스에서 혈관신생을 억제하고 동맥경화 플라크 안정성을 유지합니다

자료 및 방법

윤리 성명서

동물은 국립 보건원(National Institutes of Health)의 실험 동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 권장 사항에 따라 승인된 절차를 사용하여 인도적으로 처리되었습니다. 프로토콜은 Qinghai Provincial People's Hospital의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다(윤리 번호:201870726).

실험 동물

남성 ApoE ^−/− 8주령의 마우스 및 C57BL/6J 마우스(특정 병원체 무함유 등급)는 Beijing Vital Laboratory Animal Technology(Beijing, China)에서 구할 수 있었습니다. 마우스(새장에 5~6마리의 마우스)는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간/12시간 주야간 주기로 수용되었습니다.

AS의 마우스 모델 설정

아포E ^−/− AS 취약 플라크 모델을 확립하기 위해 마우스에 16w 동안 고지방 사료를 먹였습니다. C57BL/6 J 마우스는 자연 음료 및 음식과 함께 정상 그룹으로 사용되었습니다. 아포E ^−/− 생쥐는 12주 후에 광택이 나는 가벼운 머리카락과 뒤쪽의 머리카락이 빠졌습니다. 3마리 모델 마우스의 대동맥궁과 상완두동맥을 절개하여 헤마톡실린-에오신(HE) 염색을 수행하였고, 내막에 유의한 플라크 침착은 없었다. 또 다른 3마리의 모델링된 마우스는 4w 후에 다시 확인되었으며 HE 염색은 대동맥궁의 내막에 명백한 플라크 침착이 있음을 보여 모델 확립의 성공을 나타냅니다.

쥐 그룹화 및 치료

아포E ^−/− AS 취약 플라크가 있는 마우스를 각 그룹에 12마리의 마우스가 있는 6개의 그룹으로 나누었습니다:AS 그룹, 음성 대조군(NC) 그룹(ApoE에서 생리 식염수 주입 ^-/- 마우스), miR-342-5p agomir 그룹(ApoE에서 miR-342-5p 발현을 과발현하기 위해 miR-342-5p agomir를 주입 ^−/− 마우스), miR-342-5p antagomir 그룹(ApoE에서 miR-342-5p 발현을 감소시키기 위해 miR-342-5p antagomir를 주입 ^−/− 마우스), 과발현(oe)-Wnt3a 그룹(ApoE에서 Wnt3a 발현을 상향 조절하기 위해 oe-Wnt3a 벡터로 주입 ^−/− 마우스) 및 miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a 그룹(miR-342-5p agomir 및 oe-Wnt3a 벡터를 주입하여 ApoE에서 miR-342-5p 및 Wnt3a의 발현을 상향 조절함 ^−/− 쥐). 정상 그룹인 C57BL/6 J 마우스에는 정상 식이를 먹였습니다. 고지방 사료에는 20%의 지방과 0.25%의 콜레스테롤이 포함되어 있습니다. miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir 및 oe-Wnt3a 벡터는 Sangon(중국 상하이)에서 구입했습니다. oe-Wnt3a 벡터, miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir는 모두 0.2mL의 생리 식염수에 용해하고 2주마다 꼬리 정맥을 통해 40mg/kg의 용량으로 마우스에 주사했습니다. 8주 후 안구에서 혈액 샘플을 채취한 다음 마우스를 안락사시켜 동맥 조직을 수집했습니다[19].

예비 실험에서 ApoE ^−/− AS가 있는 마우스에 10mg/kg, 20mg/kg, 40mg/kg miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir 또는 oe-Wnt3a 벡터를 주사했습니다(2주에 한 번, 총 4회). 그런 다음 역전사 정량적 중합효소연쇄반응(RT-qPCR)을 통해 β-카테닌의 발현 정도를 확인하였다.

샘플 수집 및 처리

샘플링 전에 마우스를 12시간 동안 금식하고 에테르 흡입으로 마취하고 안구에서 혈액 샘플을 수집했습니다. 마우스의 가슴을 열고 흉부 대동맥을 복부 대동맥 끝까지 분리하고 전체 혈관을 제거했습니다. RNA가 없는 인산완충식염수(PBS)로 세척한 후 HE 염색, oil red O, Sirius red 염색 및 면역조직화학 염색을 위해 조직을 포매했습니다. 일부 혈관 조직은 RT-qPCR 및 Western blot을 위해 - 80°C에서 보존되었습니다.

혈액 지질 수준 감지

자동 생화학 분석기(Roche, Basel, Switzerland)는 혈청 내 총 콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 및 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C)을 검출하기 위해 채택되었습니다. 검출은 키트의 사양에 따라 구현되었습니다(NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China).

효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)

혈청 사이토카인 함량 측정:상용 인터루킨(IL)-5, IL-12p70, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및 인터페론(IFN)-γ ELISA 키트를 사용했습니다. 마지막으로 각 웰의 광학 밀도(OD) 값은 450nm에서 마이크로플레이트 판독기로 테스트되었습니다.

산화 스트레스 손상 측정:MDA 키트(OD 값은 532 nm에서 분광광도계로 테스트) 및 SOD 키트(OD 값은 450 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 측정)로 혈청 내 말론디알데이드(MDA) 함량 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 활성을 테스트했습니다. nm). IL-5, IL-12p70, TNF-α, IFN-γ, MDA 및 SOD ELISA 키트는 MultiSciences(Lianke) Biotechnology Corporate Limited(Hangzhou, Zhejiang, China)에서 구입했습니다.

HE 염색, 오일 레드 O 염색 및 시리우스 레드 염색

고정 및 임베딩 후 시편을 4-μm 두께의 연속 섹션으로 슬라이스했습니다. 조각을 탈랍 및 수화하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 분화, 탈수, 크실렌으로 제거하고 건조하고 중성 검으로 밀봉했습니다. 핵은 파란색이었고 세포질 및 결합 조직과 같은 다른 조직은 다른 색조로 빨간색이었습니다. 플라크 형성은 형광 현미경으로 관찰하였다. HE 염색된 절편의 동맥벽을 현미경으로 선택하고 실험 결과를 디지털 카메라로 수집하였다. Image Pro Plus6.0(IPP6.0) 이미지 분석 소프트웨어 모듈을 활용하여 각 슬라이스 단면의 플라크 면적과 벽 면적 및 비율을 계산했습니다.

오일 레드 O 염색을 위해 4~5μm의 슬라이스가 선택되었습니다. 슬라이스를 과열로 20분 동안 건조하고 100% 이소프로판올과 함께 5분 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 슬라이스를 60°C 오븐에서 8분 동안 0.5% 오일 레드 O 염색 용액과 함께 인큐베이션하고, 85% 이소프로판올로 3분 동안 세척하고, 1분 동안 헤마톡실린으로 염색하고, 세척하고 밀봉했습니다. oil red O 염색 결과 지질은 적색 또는 주황색을 띠고 핵은 옅은 청색을 띠는 것으로 나타났다. IPP6.0 소프트웨어를 사용하여 조직 조각의 플라크에서 지방 영역과 플라크 영역을 계산했습니다. 지질 함량 =오일 레드 O 양성 염색 면적/플라크 면적 × 100%.

Sirius red 염색:조각을 탈랍 및 수화하고 celestine blue 염색 용액으로 10분 동안 염색하고 Sirius red 염색 용액으로 20분 동안 염색하고 hematoxylin으로 10분 동안 대조 염색했습니다. 마지막으로 슬라이스를 구배 에탄올로 탈수하고 크실렌으로 제거하고 중성 검으로 밀봉했습니다. 조직 슬라이스 플라크의 콜라겐 면적은 IPP6.0 소프트웨어로 계산되었습니다. 콜라겐 면적 =시리우스 레드 양성 염색 면적/플라크 면적 × 100%. 플라크 영역의 지질 및 콜라겐 비율을 계산했습니다.

Hematoxylin, eosin 및 Sirius 염료는 China Pharmaceutical Group Shanghai Chemical Reagent Co. Ltd.(Shanghai, China)에서 입수할 수 있었습니다. 오일 레드 O 분말은 Sigma-Aldrich Chemical Company(St Louis, MO, USA)에서 구입했습니다.

역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)

대동맥 조직을 total RNA 추출 시약 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)에 첨가한 후 균질화하여 total RNA를 추출하고 상보적인 DNA를 구성하였다. 프라이머는 모두 Genbank에서 제공한 서열을 참조하고, Primer 5.0에서 설계하고 Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. MiR-342-5p:정방향:5'-CGGAGGGGTGCTATCTGTGATTGAG-3', 역방향 프라이머는 키트 범용 프라이머(Qiagen 회사, Hilden, Germany); Wnt3a:정방향:5'-AGGTAAGCTACTCCCTCAACTA-3', 역방향:5'-CTGAAGCACCCTCTCATGTATC-3'; β-액틴:정방향:5'-GCACCACACCTTTCTACAATGAGC -3', 역방향:5'-TCGTTGCCAATAGTGATGACC-3'; β-카테닌:정방향:5'-TCAAGAGAGCAAGCTCATCATTCT-3', 역방향:5'-CACCTTCAGCACTCTGCTTTGG-3'. 반응 후, 임계 사이클(Ct)을 컴퓨터로 분석하였다. miR-342-5p와 U6의 상대적인 비율을 표현으로, Wnt3a와 β-actin의 상대적인 비율을 표현으로 2 ^-ΔΔCt 로 상대적인 비율을 계산하였다. 방법.

서부 얼룩 분석

전체 단백질은 대동맥 조직에서 추출되었습니다. 단백질 농도는 비신코닌산법으로 측정하였다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하였다. 그런 다음 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮기고 표적 밴드를 얻었다. 막을 5% 탈지유에서 1시간 동안 밀봉하고 1차 항체 Wnt3a(1:500), β-카테닌(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), CD34(1 :2500, Abcam, MA, USA) 및 β-액틴(1:2000, Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, China)에서 4°C에서 밤새. 멤브레인을 Tween 20(pH =7.5, 10mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L NaCl 및 0.2% Tween-20)이 포함된 Tris 완충 식염수로 10분 x 3회 세척한 다음 이차 항체를 추가했습니다. (1:1000, ZSGB-Bio, Beijing, China) 2시간 동안 ImageJ 소프트웨어는 밴드의 회색 값을 평가하고 단백질 발현을 정량화하기 위해 채택되었습니다.

면역조직화학 염색

4~5μm의 조각을 100mg/L 폴리리신으로 코팅한 슬라이드에 놓고 아세톤으로 고정했습니다. 내인성 과산화효소는 소 혈청 알부민에 의해 차단되었습니다. 조직에 MOMA-2 항체(1:200), α-SMA(1:200) 및 CD34(1:200, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)뿐만 아니라 이차 항체 작업 용액( 1:1000). 조직은 디아미노벤지딘에 의해 발달되고, 헤마톡실린으로 대조염색(1분)되고, 탈수되고, 투명해지고, 밀봉되고 현미경으로 관찰되었습니다. 각 면역조직화학 섹션에 대해 3개의 서로 다른 시야가 선택되었습니다. 정량 분석을 위해 IPP6.0 소프트웨어를 수행했습니다. MOMA-2 및 α-SMA 각각의 양성 면역조직화학 염색은 대식세포와 평활근 세포가 주로 세포질에 위치하며 황색 내지 갈색임을 나타냅니다. 대식세포와 평활근 세포의 비율을 별도로 계산하고, 이를 플라크의 지질 및 콜라겐 비율과 결합하여 플라크 취약성 지수를 계산했습니다. 플라크의 취약성 지수 =(대식세포의 양성 비율 + 지질의 양성 비율)/(긍정적인 콜라겐 비율 + 평활근 세포의 비율) [20]. 미세혈관 밀도(MVD)는 CD34 발현을 측정하여 평가하고 미세혈관 수/mm ² 로 정량화했습니다. .

이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석

miR-342-5p의 표적 유전자는 생물학적 예측 웹사이트(http://www.microRNA.org)에서 분석하였다. 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석을 사용하여 Wnt3a가 miR-342-5p의 표적 유전자인지 여부를 확인했습니다. Wnt3a 3'-비번역 영역(3'-UTR)의 야생형 또는 돌연변이 서열을 GP-miRGLO 벡터(GenePharma, Shanghai, China)에 클로닝하였다. 리포터(0.5μg) 및 1, 10 또는 100pM miR-342-5p 아고미르를 마우스 대동맥 내피 세포(No. 506, MingzhouBio, Ningbo, China)에 48시간 동안 형질감염시켜 이중 루시퍼라제 분석 시스템을 사용하여 루시퍼라제 활성을 테스트했습니다. (미국 위스콘신주 프로메가).

통계 분석

모든 데이터는 SPSS 21.0 소프트웨어(IBM Corp. Armonk, NY, USA)로 해석되었습니다. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 두 그룹 간의 격차는 t에 의해 공식화되었습니다. -검정, 일원 분산 분석(ANOVA)에 의한 다중 그룹 간의 것은 Tukey의 다중 비교 검정이 뒤따릅니다. 통계적 의미는 P에 의해 설정되었습니다. 값 <0.05.

결과

miR-342-5p ApoE 대동맥 조직의 증가 및 Wnt3a 감소 ^−/− 마우스 및 miR-342-5p가 Wnt3a를 직접 표적화

MicroRNA(miRNA) 표적 유전자는 죽상동맥경화증 관련 기능과 관련이 있습니다. miR-342-5p, Wnt3a 및 β-catenin은 RT-qPCR 및 Western blot assay로 AS 모델 마우스의 대동맥 조직에서 테스트되었습니다. 정상군과 관련하여 miR-342-5p는 상승한 반면 AS군에서는 Wnt3a와 β-catenin이 감소하는 것으로 나타났습니다(둘 다 P <0.05). NC 그룹과 비교하여 miR-342-5p는 향상되었으며 miR-342-5p agomir 그룹에서는 Wnt3a와 β-catenin이 감소했습니다(둘 다 P <0.05), miR-342-5p는 감소한 반면, Wnt3a와 β-catenin은 miR-342-5p antagomir 그룹에서 증가했습니다(둘 모두 P <0.05). Wnt3a 및 β-카테닌 발현은 NC 그룹에 비해 oe-Wnt3a 그룹에서 증가했습니다(둘 다 P <0.05). miR-342-5p agomir 그룹과 비교하여 Wnt3a 및 β-catenin 발현은 miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a 그룹에서 증가했습니다(P <0.05) (그림 1A-D). 또한, 예비 실험에서는 miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir 및 oe-Wnt3a의 농도를 다르게 처리한 β-catenin의 발현을 실험한 결과를 나타내었다(Additional file 1:Fig. S1 ) miR-342-5p 아고미르 농도가 높을수록 β-카테닌 발현이 낮습니다. miR-342-5p antagomir 농도가 높을수록 β-catenin 발현이 높아집니다. oe-Wnt3a 농도가 높을수록 β-catenin 발현이 높아집니다.

ApoE의 대동맥 조직에서 miR-342-5p가 증가하고 Wnt3a가 감소합니다. ^−/− 마우스 및 miR-342-5p는 Wnt3a를 직접 표적으로 합니다. A RT-qPCR에 의해 검출된 마우스의 대동맥 조직에서 miR-342-5p의 발현. 나 RT-qPCR에 의해 검출된 마우스의 대동맥 조직에서 Wnt3a mRNA의 발현(n =12). ㄷ , D Western blot analysis (n =12). 이 Wnt3a 3'-UTR 내 miR-342-5p의 결합 부위. F miR-342-5p agomir는 Wnt3a 3'-UTR로 형질감염된 세포에서 상대적 활성을 용량 의존적으로 감소시켰습니다(N =3). 지 miR-342-5p 아고미르 또는 스크램블(N =3). *피 <0.05 vs. 일반 그룹, ^# 피 <0.05 대 NC 그룹. &피 <0.05 vs. miR-342-5p agomir 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 두 그룹 간의 비교는 t에 의해 공식화되었습니다. -테스트, 여러 그룹 간의 비교는 일원 ANOVA에 이어 Tukey의 다중 비교 테스트로 평가되었습니다. AS, 동맥경화증; NC, 음성 대조군

miRNA는 메신저 RNA 3'UTR에 결합하여 특정 유전자의 번역을 억제할 수 있습니다. 생물정보학 웹사이트에서는 miR-342-5p와 Wnt3a 사이에 표적 관계가 있다고 예측했습니다(그림 1E). 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석은 Wnt3a 3'UTR 벡터가 형질감염된 마우스 대동맥 내피 세포에서 miR-342-5p 아고미르로의 형질감염에 의해 루시페라제의 renilla/반딧불이 값이 용량 의존적으로 감소했으며, 10에서 100으로 유의하게 감소했다고 보고했습니다. pM miR-342-5p agomir와 64% 감소는 NC 그룹과 비교할 때 100pM miR-342-5p agomir 그룹에서 발생했습니다. 이것은 Wnt3a 3'UTR에 miR-342-5p 표적 부위가 있음을 나타냅니다. 그러나 luciferase 활성의 renilla/firefly 값은 Wnt3a 돌연변이 그룹에서 영향을 받지 않았습니다(그림 1F, G). 따라서 Wnt3a는 miR-342-5p의 직접적인 표적 유전자이며 miR-342-5p/Wnt3a는 AS 진행을 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.

ApoE의 지질 수준에 대한 상향 조절된 Wnt3a 또는 하향 조절된 miR-342-5p의 효과 ^−/− 마우스

또한 miR-342-5p 표적화 및 Wnt3a 신호 전달 경로 조절이 AS 마우스의 지질 수준에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 자동 생화학 분석기를 사용하여 지질 수준의 변화를 관찰했습니다. 그 결과(그림 2A-D) 정상 그룹과 달리 AS 그룹에서 TC, TG 및 LDL-C 함량이 증가하고 HDL-C 함량이 감소한 것으로 나타났습니다(모든 P <0.05). miR-342-5p agomir 그룹에서 NC 그룹에 비해 TC, TG 및 LDL-C 함량이 증가하고 HDL-C 함량이 감소했습니다(모든 P <0.05), miR-342-5p antagomir 그룹과 oe-Wnt3a 그룹에서 TC, TG 및 LDL-C 함량이 감소하고 HDL-C 함량이 증가했습니다(모두 P <0.05). miR-342-5p agomir 그룹과 관련하여 miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a 그룹에서 TC, TG 및 LDL-C 함량이 감소하고 HDL-C 함량이 증가했습니다(모두 P <0.05). 이러한 결과는 miR-342-5p 및 Wnt3a가 AS 마우스의 혈중 지질 수준을 조절함을 시사하고 miR-342-5p와 Wnt3a 간의 표적 조절 관계를 추가로 설명합니다. Wnt3a의 과발현은 AS 마우스에 대한 과발현된 miR-342-5p 유도 효과를 역전시킬 것입니다.

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ApoE의 지질 수준에 대한 상향 조절된 Wnt3a 또는 하향 조절된 miR-342-5p의 효과 ^−/− 쥐. A 마우스 그룹의 혈청 내 HDL-C 함량 비교. 나 마우스 그룹의 혈청 내 LDL-C 함량 비교. ㄷ 마우스 그룹의 혈청 내 TG 함량 비교. 디 마우스 그룹의 혈청 내 TC 함량 비교. n =12. *피 <0.05 vs. 일반 그룹, ^# 피 <0.05 대 NC 그룹. &피 <0.05 vs. miR-342-5p agomir 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 여러 그룹 간의 비교는 일원 ANOVA에 이어 Tukey의 다중 비교 테스트로 평가되었습니다. AS, 동맥경화증; NC, 음성 대조군

ApoE 혈청의 염증 및 산화 스트레스 관련 사이토카인에 대한 Wnt3a의 과발현 또는 miR-342-5p의 낮은 발현의 영향 ^−/− 마우스

그런 다음 AS 마우스의 혈청 내 사이토카인 함량을 ELISA로 시험한 결과(Fig. 3A-D) 정상군에 비해 IL-5, IL-12p70, IFN-γ 및 TNF-α가 증가된 것으로 보고되었습니다. AS 그룹(모든 P <0.05). NC 그룹에 비해 IL-5, IL-12p70, IFN-γ 및 TNF-α 함량은 miR-342-5p agomir 그룹에서 증가했습니다(모두 P <0.05) 반면, IL-5, IL-12p70, IFN-γ 및 TNF-α 함량은 miR-342-5p antagomir 그룹과 oe-Wnt3a 그룹에서 분해되었습니다(모두 P <0.05). miR-342-5p agomir 그룹과 대조적으로 IL-5, IL-12p70, IFN-γ 및 TNF-α 함량은 miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a 그룹에서 감소했습니다(모두 P <0.05). miR-342-5p는 Wnt3a 신호 전달 경로의 조절을 표적으로 삼아 AS 마우스의 혈청에서 관련 사이토카인의 수준을 추가로 조절하는 것으로 암시되었습니다.

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Wnt3a의 과발현 또는 miR-342-5p의 낮은 발현이 ApoE의 혈청에서 염증 및 산화 스트레스 관련 사이토카인에 미치는 영향 ^−/− 쥐. A 마우스 그룹의 혈청 내 IL-5 함량 비교. 나 마우스 그룹의 혈청 내 IL-12p70 함량 비교. ㄷ 마우스 그룹의 혈청 내 IFN-γ 함량 비교. 디 마우스 그룹의 혈청 내 TNF-α 함량 비교. E, 마우스 그룹의 혈청 내 MDA 함량 비교. F 마우스 그룹의 혈청에서 SOD 활성 비교. n =12. *피 <0.05 vs. 일반 그룹, ^# 피 <0.05 대 NC 그룹. &피 <0.05 vs. miR-342-5p agomir 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 여러 그룹 간의 비교는 일원 ANOVA에 이어 Tukey의 다중 비교 테스트로 평가되었습니다. AS, 동맥경화증; NC, 음성 대조군

또한, 마우스의 혈청 내 MDA 함량 및 SOD 활성을 시험한 결과(도 3E, F) 정상군에 비해 AS군에서 MDA 함량이 증가하고 SOD 활성이 저하됨(둘 모두 피 <0.05). NC 그룹에 비해 miR-342-5p agomir 그룹에서 MDA 함량이 향상되고 SOD 활성이 감소했습니다(둘 모두 P <0.05), MDA 함량은 감소하고 SOD 활성은 miR-342-5p antagomir 그룹과 oe-Wnt3a 그룹에서 증가했습니다(모두 P <0.05). miR-342-5p agomir 그룹과 비교하여 miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a 그룹에서 MDA 함량이 감소하고 SOD 활성이 향상되었습니다(둘 모두 P <0.05). 따라서 miR-342-5p를 고갈시키고 Wnt3a를 복원하면 AS 마우스에서 산화 스트레스가 억제된다는 요약이 얻어졌습니다.

miR-342-5p의 고갈 또는 Wnt3a의 복원이 ApoE 대동맥판의 지질 및 콜라겐 함량에 미치는 영향 ^−/− 마우스

miR-342-5p가 Wnt3a를 표적으로 하는 마우스의 대동맥 조직의 플라크 부위에 미치는 영향을 알아보기 위해 HE 염색을 실시한 결과(Fig. 4A, B) 정상군을 제외한 모든 부위에서 AS 플라크가 형성되는 것으로 나타났다(Fig. 4A, B). 다른 그룹의 섹션. AS군에서는 플라크 면적이 크고 섬유질 캡이 얇아지고 지질핵이 확대되었으며 플라크에 거품세포와 콜레스테롤 결정 침전이 더 많이 나타났으며 동맥과 근육층의 내벽이 두꺼워졌으며 플라크는 불안정한. NC 그룹의 상황은 AS 그룹의 상황과 유사했습니다. miR-342-5p antagomir군과 oe-Wnt3a군에서는 플라크 면적이 작고 동맥 내막이 매끄럽고 섬유모가 적고 얇아졌다. 파열은 없었지만 플라크에는 다양한 크기의 거품 세포가 있었습니다. 콜레스테롤 결정은 비대칭적으로 분포되어 부분적으로 석회화되었으며, 평활근 세포와 콜라겐 섬유의 수가 증가하였고 플라크는 안정적인 경향을 보였다. miR-342-5p agomir군은 NC군에 비해 플라크 면적이 증가하고 AS 병변이 악화되었다(P <0.05) 반면, 플라크 면적은 miR-342-5p antagomir 그룹과 oe-Wnt3a 그룹에서 AS 병변이 감소한 그룹에서 감소했습니다(둘 모두 P <0.05). miR-342-5p agomir 그룹에 비해 플라크 면적은 miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a 그룹에서 감소했습니다(P <0.05).

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ApoE 대동맥판의 지질 및 콜라겐 함량에 대한 miR-342-5p의 고갈 또는 Wnt3a의 회복 효과 ^−/− 쥐. A 마우스의 대동맥 HE 염색 결과(축척 막대:50μm). 나 마우스의 각 그룹에서 대동맥 플라크 면적의 비교. ㄷ 모든 마우스 그룹에서 대동맥 오일 레드 O 염색 결과(스케일 막대:100μm). 디 쥐의 대동맥 조직에서 지질 함량 비교. 이 각 그룹의 마우스에서 대동맥 시리우스 적색 염색 결과(축척 막대:50μm). F 쥐의 대동맥 조직에서 콜라겐 함량 비교. n =12. ^# 피 <0.05 대 NC 그룹. &피 <0.05 vs. miR-342-5p agomir 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 여러 그룹 간의 비교는 일원 ANOVA에 이어 Tukey의 다중 비교 테스트로 평가되었습니다. AS, 동맥경화증; NC, 음성 대조군

오일 레드 O 염색 및 시리우스 레드 염색은 miR-342-5p 표적 Wnt3a가 마우스의 대동맥 조직 플라크의 지질 함량 및 콜라겐 함량에 미치는 영향을 감지하기 위해 채택되었으며 결과는 (그림 4C-F) 오일 레드 O 염색은 붉은 지방과 푸른 핵을 보였고 시리우스 붉은 염색은 붉은 콜라겐 섬유와 푸른 핵을 보였다. NC군에 비해 miR-342-5p antagomir군과 oe-Wnt3a군에서 지질 함량이 감소하고 콜라겐 함량이 축적된 것처럼 지질 함량이 증가하고 콜라겐 함량이 감소하였다. 그룹(모든 P <0.05). miR-342-5p agomir 그룹은 miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a 그룹에서 지질 함량이 감소하고 콜라겐 함량이 증가했습니다(둘 모두 P <0.05). 실험 결과는 miR-342-5p가 Wnt3a 신호 전달 경로를 표적으로 하는 조절이 AS 마우스의 대동맥판에서 지질 및 콜라겐 함량에 조절 효과가 있음을 충분히 설명했습니다.

ApoE 대동맥판의 대식세포 및 평활근 세포에 대한 하향 조절된 miR-342-5p 또는 상향 조절된 Wnt3a의 효과 ^−/− 마우스

AS의 정도는 단핵 대식세포의 함량에 정비례합니다[21]. VSMC는 동맥 중간층의 주요 세포이며 동맥벽의 무결성을 유지하는 데 필수적입니다. VSMC는 동맥벽 재건에 관여하고 다양한 단계에서 AS에서 중요하게 작용합니다[22]. α-SMA는 평활근 세포의 특정 마커입니다[23]. 이 연구에서는 대식세포 표지 항체(MOMA-2)를 사용하여 대식세포를 표지하고 면역조직화학을 적용하여 MOMA-2 및 α-SMA 발현을 각각 검출했습니다.

Under the microscope, positive immunohistochemical staining of MOMA-2 and α-SMA, respectively, indicates that macrophages and smooth muscle cells are mainly located in the cytoplasm, which is yellow to brown. MOMA-2 immune positive indicated that macrophages was mainly located in the cytoplasm with yellow to brown. Determined by immunohistochemistry, it was manifested that versus the NC group, percentage of plaque macrophages (MAMO-2) positive staining was raised and percentage of positive smooth muscle cells was decreased in the miR-342-5p agomir (both P  < 0.05). Percentage of plaque macrophages (MAMO-2) positive staining was reduced and percentage of positive smooth muscle cells was increased in the miR-342-5p antagomir group and the oe-Wnt3a group (all P  < 0.05). In comparison with the miR-342-5p agomir group, percentage of plaque macrophages (MAMO-2) positive staining was depressed and percentage of positive smooth muscle cells was raised in the miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a group (both P  < 0.05) (Fig. 5A–D). It was implied that miR-342-5p targeted regulation of Wnt3a signaling pathway could regulate aggregation of macrophages and smooth muscle cells in arterial tissue plaques of AS mice.

Effects of high expression of Wnt3a or poor expression of miR-342-5p on aortic plaque vulnerability of ApoE ^−/− mice. A Immunohistochemical staining of MOMA-2 in each group of mice (scale bar:50 μm). B Quantitative analysis of figure A. C Immunohistochemical staining of α-SMA in each group of mice (scale bar:50 μm). D Quantitative analysis of figure C . E Comparison of plaque vulnerability index in aortic tissues of AS mice. n  = 12. ^# P  < 0.05 vs. the NC group. &P  < 0.05 vs. the miR-342-5p agomir group. Measurement data were indicated as mean ± standard deviation. Comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test. AS, atherosclerosis; NC, negative control

Effects of High Expression of Wnt3a or Poor Expression of miR-342-5p on Aortic Plaque Vulnerability of ApoE ^−/− Mice

Plaque vulnerability index was calculated:(positive percentage of macrophages + positive percentage of lipids)/(positive percentage of smooth muscle cells + positive percentage of collagen). In relation to the NC group, the plaque vulnerability index was raised in the miR-342-5p agomir group (P  < 0.05) and decreased in the miR-342-5p antagomir group and the oe-Wnt3a group (both P  < 0.05). Versus the miR-342-5p agomir group, the plaque vulnerability index was decreased in the miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a group (P  < 0.05) (Fig. 5E). Briefly, miR-342-5p targeted regulation of Wnt3a signaling pathway-mediated vulnerability of plaques in arterial tissues of AS mice.

Effects of Low Expression of miR-342-5p or Overexpression of Wnt3a on Angiogenesis in Aortic Plaque of ApoE ^−/− Mice

Antibodies against endothelial cell marker CD34 can detect blood vessel density [24]. By immunohistochemistry and Western blot. Versus the NC group, MVD was heightened in the miR-342-5p agomir group and attenuated in the miR-342-5p antagomir group and the oe-Wnt3a group (all P  < 0.05). In comparison with the miR-342-5p agomir group, MVD was decreased in the miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a group (P  < 0.05) (Fig. 6A–C). Collectively, miR-342-5p targeting and regulating Wnt3a signaling pathway directly participated in regulating the density of neovascularization in plaques of AS mice.

Effects of low expression of miR-342-5p or overexpression of Wnt3a on MVD in aortic plaque of ApoE ^−/− mice. A Immunohistochemical staining of CD34 in each group of ApoE ^−/− mice (scale bar:50 μm). B Comparison of MVD in aortic plaque in ApoE ^−/− mice. C Comparison of CD34 protein expression in ApoE ^−/− mice. n  = 12. ^# P  < 0.05 vs. the NC group. &P  < 0.05 vs. the miR-342-5p agomir group. Measurement data were indicated as mean ± standard deviation. Comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test. AS, atherosclerosis; NC, negative control

Discussion

AS is an unpredictable disease involving forms of chronic inflammation and vascular remodeling, and is the major cause of mortality and morbidity globally [25]. A previous study has discussed that miR-342-5p is implicated in regulating the progression of AS [26]. Also, it was mirrored that Wnt pathway is involved in facilitating the occurrence and development of diabetic AS [27]. As the related mechanisms of miR-342-5p and Wnt3a in AS remain to be excavated, our study was to inquire the effect of miR-342-5p targeted Wnt3a on formation of vulnerable plaque and angiogenesis of AS.

Our study revealed that highly expressed miR-342-5p and lowly expressed Wnt3a were found in aortic tissues of AS mice. A study has presented that macrophage-derived miR-342-5p is dramatically raised in early atherosclerotic lesions in ApoE ^−/− mice [13]. Another study has presented that miR-342-5p is markedly elevated in atrial fibrillation patients [28]. It has been reported that Wnt3a deficiency irreversibly injures hematopoietic stem cell self-renewal and results in defects in progenitor cell differentiation [29]. A study has shown that depletion of Wnt3a leads to defective cardiac function [30]. It has been revealed that Wnt3a expression in hippocampus of Alzheimer’s disease mice is remarkably decreased [31]. Another result from our study is that Wnt3a was directly targeted by miR-342-5p in AS mice. It has been reported that miR-342-5p can target the 3'-UTR of Wnt3a and negatively regulate its expression [14].

In addition, our study has suggested that TC, TG, LDL-C, IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α and MDA contents were increased in serum, and HDL-C content and SOD activity were decreased. In addition, plaque area, lipid content, collagen content and MVD were enhanced as well as MOMA-2 expression was raised and α-SMA expression was decreased in AS mice. IFN-γ is a soluble cytokine with many functions, including anti-fibrosis, anti-proliferation, immunomodulation, apoptosis and anti-viral activities [32]. It has been revealed that glutamine treatment markedly raises SOD activity and reduces MDA content as well as increases Wnt3a protein levels in Alzheimer’s disease [31]. A study has revealed that the plasma levels of TC, TG and LDL-C are notably elevated and HDL-C is markedly reduced in AS [33]. A study has reported that TEMPOL supplementation, which has a value in suppressing metabolic disorders and raising atherosclerotic plaque stability, enhances plaque collagen content and reduces lipid content [34]. Zhou et al. noted that OPCRR treatments dramatically reduces the serum lipid profiles including TC, TG and LDL-C as well as and raises the HDL-C, also decreases MDA content as a product of lipid peroxidation and, moreover, declines serum levels of TNF-α in AS [35]. It has been presented that atherosclerotic samples have obviously reduced expression of α-SMA [36]. A study has presented that raised MVD is found in diseased aortas and especially in ruptured atherosclerotic plaque [37]. Furthermore, our study revealed that poor expression of miR-342-5p and overexpression of Wnt3a decreased he lipid levels, cytokine contents, oxidative stress response, plaque area and lipid content as well as increased collagen content, depleted MOMA-2 expression and restored α-SMA expression in aortic tissues in AS mice. It has been suggested previously that miR-342-5p is found to be positively linked to LDL-C and TNF-α serum levels and has an inverse correlation with HDL-C in coronary artery disease (CAD) patients [12]. Another study has verified that depletion of miR-342-5p inhibits AS [13]. Additionally, an experiment has presented that low serum level of Wnt1 is related to raised TG and LDL-C in premature CAD patient [38]. In addition, a study has showed that up-regulated Wnt3a, enhanced SOD content and decreased MDA content are found in the curcumin groups in Parkinson's disease rats [39].

Conclusion

In brief, our study for the first time discovered the mechanism of miR-342-5p/Wnt3 axis in AS and revealed that depleting miR-342-5p could reduce formation of vulnerable plaque and angiogenesis in AS mice via restoring Wnt3a, which may be a potential candidate for treatment of AS (Additional file 2:Fig. S2). miR-342-5p may have a synergistic effect with other miRNAs in atherosclerotic vascular disease, but due to time and funding constraints, we did not conduct further relevant discussions, which is also a limitation of this study.

Availability of data and materials

The original contributions presented in the study are included in the article/Supplementary Material, and further inquiries can be directed to the corresponding author.

Abbreviations

miR-342-5p:

MicroRNA-342-5p

A:

Atherosclerosis

α-SMA:

α-Smooth muscle actin

MVD:

Microvessel density

miRNA:

MicroRNA

oe:

Overexpression

NC:

Negative control

PBS:

Phosphate-buffered saline

TC:

Total cholesterol

TG:

Triglyceride

LDL-C:

Low-density lipoprotein cholesterol

HDL-C:

High-density lipoprotein cholesterol

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

IL:

Interleukin

TNF-α:

Tumor necrosis factor alpha

IFN:

Interferon

MDA:

Malondialdeyde

SOD:

Superoxide dismutase

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

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