국부적 표면 플라스몬 공명을 기반으로 하는 금 나노바이오센서는 인간 브루셀라증을 진단할 수 있어 신속하고 저렴한 방법을 소개합니다
초록
브루셀라증은 세계에서 가장 흔한 세균성 인수공통전염병으로 간주됩니다. 비록 실험실 소견이 오늘날 가장 신뢰할 수 있는 진단이지만, 현재의 실험실 방법은 많은 한계가 있습니다. 이 연구는 기존의 단점을 제거하거나 줄이기 위해 LSPR(Localized Surface Plasmon Resonance)을 기반으로 하는 새로운 기술의 성능을 설계하고 평가하는 것을 목표로 했습니다. 이를 위해 Brucella melitensis에서 매끄러운 지질다당류를 추출했습니다. 및 Brucella abortus 공유 상호 작용을 통해 금 나노 입자의 표면에 고정됩니다. 일부 최적화 프로세스 후에 동적 광산란을 사용하여 프로브를 특성화했습니다. 포획된 항-Brucella 항체의 검출은 LSPR 피크에 대한 적색편이를 측정한 후 차단 값을 결정함으로써 수행되었으며, 이는 대조군과 진양성 환자 사이에 상당한 차이를 나타냈습니다(P 값 <0.01). 또한, 진음성 샘플 및 양성 환자의 40개 혈청을 사용하여 이 방법의 결과를 황금 표준(배양), 표준 튜브 응집 테스트, 항 브루셀라증 IgM 및 IgG 수준(ELISA)과 비교하여 이 방법의 성능을 평가했습니다. 민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도는 LSPR 기반 방법의 적절한 성능을 보였다(각각 85%, 100%, 100%, 86%). 현재 연구 결과는 인간 혈청에서 항 브루셀라 항체를 검출하는 유망한 빠르고 편리하며 저렴한 방법을 제공하며, 이는 브루셀라증을 신속하고 효과적으로 진단하기 위해 의료 실험실에서 널리 사용될 수 있습니다.
소개
Brucellae는 Brucellaceae과에 속하는 천천히 성장하는 그람 음성 구균입니다[1]. 브루셀라에는 다양한 가축 및 야생 동물을 감염시키는 통성 세포내 박테리아가 포함됩니다[2]. 최근 몇 년 동안 새로운 유형의 브루셀라가 발견되면서 속이 크게 확장되었습니다. 속은 현재 12종이 있으며 그 중 4종이 Brucella를 포함합니다. 멜리텐시스 , 나. 낙태 , 나. 수이 , 및 B. 큰개 인간의 질병의 주요 원인입니다[3]. 나. 멜리텐시스 인간에게 가장 치명적인 종으로 여겨진다[3]. 브루셀라병이 사람을 사망에 이르게 하지 않고 사람 간 전파의 예외적인 경우일 뿐이지만, 전 세계적으로 사람 브루셀라병의 끊임없는 전염병은 동물 생산성의 손실을 통해 심각한 공중 보건 문제와 경제적 피해를 초래합니다. 중요한 것은 인간에서 브루셀라증의 약화 가능성과 질병의 복잡한 치료 프로토콜로 인해 이 박테리아가 생물전의 후보 물질이 되었습니다[4, 5].
인간의 브루셀라증은 임상 양상이 비특이적이고 광범위한 다른 질병과 겹치기 때문에 '실수의 질병'[6]으로 분류됩니다. 따라서 진단의 실험실 확증은 환자의 올바른 치료에 필수적입니다[7, 8]. 배양, 혈청학적 검사, 핵산 증폭 검사를 통해 브루셀라증을 진단할 수 있지만 이러한 방법에는 많은 한계가 있습니다. 배양에서 금본위제로서 환자의 적절한 진단과 치료를 지연시키는 주된 한계는 긴 잠복기이다. Bactec 및 BacTAlert 시스템과 같은 첨단 자동화 혈액 배양 시스템은 브루셀라증의 급성 사례를 감지할 수 있지만 배양 기간이 5~7일이며 장기간 샘플에 대한 블라인드 계대배양의 배양 및 성능도 확장되어야 합니다[9]. 특히 Brucella 유기체에 반복적으로 노출된 개인에서 특이성의 결여 및 위양성 결과는 혈청학적 검사의 주요 한계입니다[9, 10]. 핵산증폭법에 의한 민감도, 특이도, 안전성이 우수하고 질병의 신속한 진단이 가능하지만, 장기간 환자의 생체분자 검사 결과가 양성으로 유지되기 때문에 임상적 중요성과 제한된 치료적 의미가 명확하지 않습니다. 완전히 회복된 것[9, 11]. 따라서 위에서 언급한 테스트의 모든 한계를 극복함과 동시에 장점을 높일 수 있는 방법을 설계해야 합니다.
낮은 검출 한계를 가진 바이오센싱 장치의 개선은 바이오마커 검출 연구의 중요한 구성요소가 되었습니다. 왜냐하면 지난 10년 동안 바이오센싱에서 다양한 검출 플랫폼의 감도를 개선하기 위한 적절한 절차를 찾기 위해 많은 연구가 전념했기 때문입니다[12, 13]. . 바이오 센서는 생물학적 구성 요소를 포함하는 상호 작용에서 신호를 생성하여 분석 물질을 감지하고 정량화하는 데 사용됩니다. 최근 생체분자 상호작용의 비할 데 없는 특이성과 결합된 광학 변환기의 감도 증가로 인해 다양한 광학 바이오센서가 개발되었습니다[14]. 생물학적 상호작용에 대한 흡수 대역의 적색편이로 입증되는 적용 용이성, 저온에 대한 감도 및 안정적인 신호 생성으로 인해 나노 입자의 고유한 광학 특성에 기반한 테스트는 생물학적 마커를 감지하는 데 비용 효율적입니다. 15,16,17]. 이러한 검출 방법은 분자량, 전하 및 굴절률과 같은 분자의 생물물리학적 특성을 사용하여 특정 분자의 활성을 모니터링합니다. 표면 플라즈몬 공명은 입사광에 노출된 후 표면 전자의 집합적 진동으로 인해 발생하는 현상으로 표면에 결합된 생체 분자를 빠르고 쉽게 검출하는 데 사용되어 왔습니다[18, 19]. SPR은 두 가지 주요 방법, 즉 지역화(LSPR) 또는 전파(PSPR)로 구성됩니다[20, 21]. 그 중 국부적 표면 플라즈몬을 기반으로 한 광학 바이오센서는 그 응용 가능성이 매우 크기 때문에 눈부신 발전을 이루었다[12, 22]. 이 기술은 입사광 파장보다 짧은 전도성 나노입자의 표면 전자와 전도대에서 입사광이 표면 전자와 상호작용할 때 발생하는 광파 간의 상호작용에 기인한다[23, 24]. 다른 유사한 플랫폼과 비교하여 국부적 표면 플라즈몬 공명 기반 바이오센서는 전자기장 감쇠 길이가 더 짧고 온도 변화 또는 주변 매질, 그리고 자유롭게 전파되는 빛에 의해 여기되는 능력[12]. 따라서 나노바이오센서 기술에서 LSPR 기반 나노바이오센서는 생체 분자를 검출하는 가장 강력한 도구 중 하나로 간주됩니다.
요컨대, 한편으로는 실험실 기반 전략이 여전히 브루셀라증 진단의 주요 기초입니다. 한편, 현재의 임상적 방법은 많은 한계에 직면해 있다. 따라서 기존 기술의 단점을 극복할 수 있는 새로운 대체 방법을 제안하는 것은 치료 프로토콜의 주요 구성 요소 중 하나로 간주됩니다. 따라서 본 연구에서는 브루셀라증 진단을 위해 생물학적 시료에서 항 브루셀라 항체를 검출하기 위해 빠르고, 편리하고, 저렴하고, 안전하고, 민감한 LSPR 기반 나노바이오센서를 도입하는 것을 목표로 하였다. 이를 위해 B. melitensis와 B. abortus의 지질다당류(LPS)를 금 나노입자(GNPs)에 코팅하여 기법의 특이성, 민감도, 양성예측도(PPV), 음성예측도(NPV)를 평가하였다. 혈청 배양 분석과 비교하여 얻은 결과를 비교합니다. 또한, 현재 연구에서는 항 브루셀라 항체(IgM 및 IgG 모두)를 측정하기 위해 효소 결합 면역흡착 분석을 수행하고 기존 방법과 반대로 현재 설계된 기술로 브루셀라증을 검출하는 능력을 평가하기 위해 표준 튜브 응집 테스트를 수행했습니다.
방법
세균 배양 및 LPS 추출
B의 부드러운 균주. 멜리텐시스 및 B. 낙태Luria–Bertani에서 배양되었습니다. [3] 한천. 다음 단계에서는 변형된 고온 페놀수 방법을 사용하여 박테리아를 수확하고 LPS를 추출했습니다[25]. 추출된 LPS의 품질을 확인하기 위해 질산은으로 염색한 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)를 적용하였다. LPS 정량은 Salmonella typhimurium을 사용하여 1,9-디메틸 메틸렌 블루(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 표준으로. 단백질 및 핵산 오염을 평가하기 위해 Bradford 방법과 260nm에서의 흡광도를 사용했습니다.
구형 금 나노입자의 합성
금염의 화학적 환원(HAuCl4 )은 상온에서 Au 나노 입자를 위한 빠르고 저렴하며 친환경적인 합성 절차인 금 나노 입자를 합성하는 데 사용되었습니다[26]. 설명된 방법에 따라 구연산나트륨(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 15mg을 증류수 50ml에 녹인 후 얼음욕조에 보관하고 자석교반기(150RPM)에서 혼합하였다. . 동시에 600μl의 금염 용액(17.3mM)을 첨가했습니다. 이어서, 수소화붕소나트륨 용액(20mM) 1.2ml를 첨가했습니다. 용액을 유사한 조건에서 2시간 동안 혼합한 다음 나중에 적용하기 위해 4°C에서 보관했습니다. 이전 연구에 따르면 이러한 유형의 합성에서 시트르산나트륨은 환원제(AuIII의 AuO로 환원 촉진), 캡핑제(금 나노입자 콜로이드 용액을 정전기적으로 안정화) 및 pH 매개체(Au의 반응성 수정)로 동시에 작용합니다. 반응에 관여하는 종). 이 분석에서 HAuCl4의 노란색 용액에서 빨간색 용액의 생성은 산화가 없는 상태에서 금이 형성됨을 보여줍니다.
주사전자현미경(SEM)을 사용하여 금 나노입자의 형태를 연구하고 Zetasizer NanoZS90(Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, UK)을 사용하여 크기 분포를 평가했습니다. 산란 각도 90º에서 동적 광산란(DLS)은 입자 크기 측정의 기본 원리로 사용되었습니다. Zetasizer Nano는 633nm 파장의 레이저를 사용했습니다. 이 기술을 사용하면 브라운 운동으로 인한 입자의 확산이 측정되고 Stokes-Einstein 관계에 의해 크기 분포로 변환됩니다[27]. 나노 입자의 전기적 표면 전하를 결정하기 위해 제타 전위도 적용되었습니다. 나노입자의 흡수 스펙트럼은 Cary 500 UVeviseNIR(ultra-violete-visible near 적외선) 분광광도계(Varian, Australia)로 기록되었습니다.
나노프로브(바이오센서) 구축
금 나노입자의 카르복실화
LPS를 로딩하기 위한 GNP의 표면을 준비하기 위해 금 나노입자를 티오글리콜산 링커로 코팅하였다. 즉, 1ml의 TGA 용액(1mM)과 1ml의 금 나노입자 용액을 혼합하고 실온에서 24시간 동안 유지했습니다. 코팅된 금 나노입자를 분리하기 위해 용액을 12,000g에서 15분 동안 원심분리했습니다. 그 후, 과량의 TGA를 제거하기 위해 이중 증류된 탈이온수에 의한 2번의 세척 단계를 사용하였다. 마지막으로 분광광도법을 사용하여 GNP 표면의 티오글리콜산 코팅을 평가했습니다.
금 나노입자에 대한 티오글리콜산 코팅 최적화
TGA 코팅은 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 및 48시간을 포함하여 서로 다른 시간에 수행되어 금 나노입자에 대한 TGA의 코팅 비율을 최적화했습니다. 그 후 최적의 배양 시간을 얻기 위해 광학 밀도를 측정하고 그래프로 표시했습니다.
TGA로 수정된 금 나노입자에 LPS의 공유 결합
TGA의 카르복실기와 LPS의 아민기 사이의 공유 결합을 자극하기 위해 카르복실기는 EDC(생화학적 접합을 위한 가장 널리 사용되는 길이가 0인 가교제)와 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 분자에 의해 활성화되었습니다[28]. 침강된 금 나노입자를 0.1mM EDC/NHS 용액에 현탁하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 다음 단계에서 0.05% Tween-20(PBST)(pH 7.4)을 포함하는 2ml의 인산완충식염수(PBS)를 첨가했습니다. 격렬한 소용돌이 후 나노입자를 15분 동안 12,000RPM에서 원심분리했습니다. 원심분리 후 상등액을 제거한 후 LPS 용액을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 초음파 수조에서 10분 동안 배양한 다음 실온에서 3시간 동안 배양했습니다. 그 후 PBST 2ml를 첨가하고 격렬하게 vortex한 후 12,000RPM으로 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 마지막으로 나노프로브를 PBS 500μl에 재현탁하고 분광광도계로 LSPR 스펙트럼을 측정했습니다. 금 나노 입자에 LPS 부착이 확인된 후 추가 연구를 위해 용액을 4°C로 유지했습니다. 그림 1은 TGA로 변형된 금 나노입자 합성과 LPS 부착의 화학적 상호작용 방정식을 보여줍니다.
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금 나노입자에 대한 LPS 부착의 화학적 상호작용. A TGA 분자, B EDC + NHS 상호작용 및 C TGA로 수정된 금 나노 입자에 LPS의 공유 부착. 1번:나노입자; 2번:LPS
LPS 농도 최적화
활성화된 TGA 카르복실기에 대한 LPS의 결합을 최대화하기 위해 LPS 농도(100, 150, 200, 300, 560 µg)의 함수로 LSPR 스펙트럼의 피크 이동을 평가하여 LPS 대 Au 나노입자 비율의 최적화를 수행했습니다. /ml) 일정량의 Au 나노입자.
Nanoprobe에 의한 항LPS 항체 검출
100µl의 희석된 샘플(PBS에서 1:50)을 200µl의 바이오센서와 혼합하고 피펫팅으로 혼합했습니다. 다음 단계에서 바이오센서는 실온에서 30분 배양 후 15분 동안 12,000g에서 원심분리되었습니다. 마지막으로 바이오센서를 PBS 200μl에 현탁하고 앞에서 설명한 대로 흡광도를 측정했습니다. 나노바이오센서 기능을 검증하기 위해 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트(Pishtazteb Zaman, Iran)에서 양성 및 음성 대조군도 제공되었습니다.
윤리 성명서
인간 혈청의 사용은 이란 Fasa 의과대학 Fasa 윤리위원회(IR.FUMS.1396.324)의 승인을 받았습니다. 혈청 기증자의 신원은 암호화되었으며 이 연구에 관련된 누구에게도 공개되지 않았습니다. 또한 모든 절차는 국가 규정에 따른 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 또한, 모든 샘플은 서면 동의서에 서명한 피험자로부터 수집되었습니다.
설계된 방법의 기능 평가
설계된 방법의 기능을 평가하기 위해 20개의 사례(참 양성)와 20개의 대조군(참 음성)을 포함하는 40개의 샘플이 제공되었습니다. 이러한 이유로 본 연구에서 설계된 방법의 성능을 배양 결과와 비교하였다. 또한 IgM 및 IgG 항체의 혈청 수준을 평가하기 위해 사용 가능한 상용 키트(Pishtaz Teb, Tehran, Iran)를 사용했습니다. 샘플 준비 및 항체 평가는 제조사의 프로토콜(특이성:99.85%, 민감도:99.4%)에 따라 수행되었습니다. 또한 LSPR 기반 방법의 성능을 비교 및 검증하기 위해 모든 혈청 샘플에 대해 표준 튜브 응집 테스트를 수행했습니다. 설계된 방법의 성능을 평가하기 위해 LSPR 기반 방법에서 얻은 결과를 다음과 같은 공통 공식을 기반으로 민감도, 특이도, 양성 예측값 및 음성 예측값을 계산하여 언급한 기존 테스트와 비교했습니다.
본 연구는 제안된 검사인 LSPR-나노센서와 참조표준 검사인 배양, ELISA, SAT를 포함한 일부 기존 검사의 일치도를 평가하여 표적 상태를 식별하는 능력을 판정함으로써 고전적 진단 성능 실험으로 분석하였다. . 컷오프 값은 대조군(진음성) 혈청의 평균에 2회 표준 편차 값(2SD)을 더하여 계산했습니다. 정규성을 결정하고 데이터 분포를 평가하기 위해 Kolmogorov–Smirnov 테스트를 수행했습니다. 모수 분포를 나타내는 정규성 결과를 기반으로 ANOVA 테스트를 사용하여 그룹을 비교했습니다. 모든 통계 분석은 Windows 버전 8의 경우 GraphPad Prism과 Windows 버전 9의 경우 SPSS를 사용하여 수행되었습니다.
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결과
지질다당류 추출 분석
SDS-PAGE는 LPS 추출 수율이 사용된 박테리아 습윤 중량의 약 1%임을 보여주었습니다. 더욱이, 핵산의 농도는 LPS 농도의 ≤ 0.2%였다. 중요한 것은 Bradford 방법이 단백질 오염이 없음을 입증했다는 것입니다.
금 나노입자의 특성
나노 입자의 크기 분포는 바이오 센서의 품질을 결정합니다. 이전 연구에 따르면 나노 입자는 특정 크기를 가져야 합니다. 이와 관련하여, 나노 입자의 적절하게 작은 크기는 적절한 콜로이드 안정성, 높은 표면 대 부피 비율을 가져오고 높은 결합 속도를 위한 빠른 이동은 생물학적 표적과의 상호 작용에서 높은 친화도, 높은 감도 및 높은 선택성을 초래합니다. 또한, 나노 입자는 입자 표면에 다양한 리간드의 존재를 허용하고 다가 상호 작용도 얻을 수 있도록 가능한 한 커야 합니다[29,30,31]. Gu et al. 보고된 바에 따르면, 나노입자 크기와 생물학적 표적 크기의 비교 가능성은 단백질 상호작용에서 특히 중요합니다[32]. 2-5 nm인 항-Brucella 항체의 크기에 따라[33], 본 연구에서는 평균 크기가 10 nm인 금 나노입자를 준비하고 나노입자 크기 분포를 측정하기 위해 Zetasizer NanoZS90 기기를 사용했습니다. 633nm 파장의 레이저. 이 기술은 브라운 운동으로 인한 입자 확산을 크기 분포로 변환할 수 있는 스톡-아인슈타인 방정식의 이점을 제공합니다. 그림 2에 따르면 GNP는 10nm 규모로 균일하게 분포되어 있습니다. 제타 전위 값은 GNP의 표면 전하 및 안정성에 대한 세부 정보를 보여주었습니다. 입자는 음전하를 띠고 제타 전위는 약 - 28mV였습니다. 또한 표 1은 GNP의 최대 흡광도 파장을 보여줍니다. 분광광도계로 가시광선 및 자외선파장을 측정하였으며, 최대 흡광도는 530nm였습니다. 우리는 Turkevich 방법을 사용하여 금 나노 입자를 생산했습니다. 이 방법의 장점은 금 나노입자를 생산하는 공정이 쉽고 저렴하며 나노입자의 크기를 조절할 수 있고 적절한 콜로이드 안정성을 갖는다는 점이다[34].
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SEM에서 금 나노 입자의 구조. 금 나노 입자의 균등한 분포가 그림에 잘 반영되어 있습니다.
나노 바이오 프로브의 특성
위에서 언급했듯이 이 연구에서는 TGA 분자를 사용하여 금 나노 입자를 LPS와 연결하여 530nm에서 LSPR 피크가 약간 4.55% 감소했습니다. 게다가, 본 연구는 금 나노입자에 대한 최대 TGA 부착을 결정하기 위해 여러 번 배양을 수행했습니다. 그림 3에 나타난 결과에 따르면 GNP와 TGA를 24시간 배양하면 금 나노입자 표면에 최대 TGA 코팅이 나타납니다.
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금 나노입자에 티오글리콜산 코팅 최적화 그림에서 알 수 있듯이 인접 시간의 연장에도 불구하고 24시간 배양 후에도 흡광도에는 큰 변화가 없습니다. 따라서 GNP에 티오글리콜산을 코팅하기 위한 최적의 시간으로 24시간을 선택했습니다. 와 -축은 530nm에서 흡광도 강도를 나타냅니다(나노 입자의 최대 흡광도). 실험은 세 번 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. a.u.:흡광도 단위
LPS의 최적 농도 결정과 관련하여 본 연구에서는 100, 150, 200, 300, 560ug/ml 농도를 조사하였다. 그림 4와 같이 농도가 증가할수록 흡광도는 감소한다. 결과에 따르면, 본 연구에서는 LPS 농도를 증가시켜도 흡수 피크 강도의 현저한 감소가 없었기 때문에 TGA로 변형된 GNP의 표면을 코팅하기 위해 300ug/ml 농도의 LPS를 선택했습니다.
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LPS 농도 최적화. LPS의 농도가 증가함에 따라 흡광도가 크게 감소했습니다. 그러나 LPS 농도가 300mg/ml 이상 증가해도 LSPR 흡광도에는 유의한 감소가 없었습니다. 따라서, 언급된 농도를 최적화된 농도로 선택하였다. 와 -축은 530nm에서 흡광도 강도를 나타냅니다(나노 입자의 최대 흡광도). 실험은 세 번 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. a.u.:흡광도 단위
나노 바이오 프로브 기능 평가
LSPR 기술은 표면에 민감한 광학적 방법으로 항체와 항체 사이의 정전기적 상호작용으로 인한 LSPR 흡수 피크의 변화 영상을 통해 금 나노입자 표면의 항LPS 항체와 항원 간의 상호작용을 검출할 수 있다. 항원. 바이오센서의 올바른 기능을 확인하기 위해, 본 연구에서는 1:80의 역가를 갖는 항-Brucella LPS 항체로 구성된 양성 대조군 및 음성 대조군을 준비하고, 대조군과 배양 후 바이오센서의 LSPR 스펙트럼을 기록하였다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 음성 대조군과의 배양은 LSPR의 흡광도에 영향을 미치지 않았습니다. 그러나 양성 대조군과의 배양은 이전에 적색 편이로 알려진 LSPR 최대 흡광도의 이동을 일으켰습니다. 따라서 LPS 항원에 대한 항-Brucella 항체의 결합은 나노프로브의 표면에 빛을 치는 빈도를 제한합니다.
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양성 및 음성 대조군이 있는 경우 LSPR 나노프로브의 피크. 대조군은 시판되는 ELISA 키트에서 제공되었습니다.
컷오프 값 결정
이를 위해 본 연구에서는 배양 및 임상 관찰을 기반으로 진양성 및 음성 피험자로부터 40개의 혈청을 얻었다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 진음성 샘플(대조군)의 평균 적색편이는 1.70nm로 진양성 환자(P 값 <0.001). 또한 결과는 4.38nm의 적색 편이를 차단 값으로 사용해야 함을 나타냅니다. 흥미롭게도 대조군의 5%만이 컷오프 값보다 높은 적색 편이를 보였고 모든 환자의 적색 편이는 컷오프 값보다 높았으며 이는 방법의 성능이 허용 가능하고 컷오프 값의 결정이 신뢰할 수 있음을 나타냅니다.
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진정한 환자 및 대조군의 혈청에서 LSPR 피크 적색편이. 감염된 개체의 혈청에 나타난 항체 사이의 상호작용에 따라 대조군과 비교할 때 유의하게 다른 적색편이가 발생했습니다. 또한 그림은 컷오프 포인트 정의에 중요한 SD 및 2SD 값을 보여줍니다. 실험은 각 샘플에 대해 세 번 수행되었습니다. 피 value <0.05는 유의미한 것으로 간주되었습니다.
바이오센서 기능 검증
이전 단계에서 이 연구는 샘플에서 항 브루셀라 항체를 식별하는 빠르고 저렴한 방법을 도입했습니다. 그러나 새로운 방법의 기능을 확인하는 것이 필요합니다. 이를 위해 본 연구에서는 배양 결과를 바탕으로 음성 및 양성 검체의 혈청에서 표준관 응집 검사, 항-IgG 및 항-IgM 수치를 포함하는 일련의 하위 연구를 수행했습니다. Table 2에서 보는 바와 같이 현재의 방법의 민감도는 SAT 단독의 민감도보다 낮았다. 중요한 것은 LSPR 기반 방법의 특이도가 100%로 가장 수용 가능한 결과를 보였다는 것입니다. 특이도와 유사하게 현행법의 양성예측도가 기존의 다른 검사보다 높았다(100%). 궁극적으로 SAT, IgG, IgM 및 LSPR 기반 방법의 NPV는 각각 90%, 90%, 81% 및 86%였습니다.
토론
브루셀라증은 아마도 소, 양, 염소를 가축화한 후 최초의 인간 감염으로 간주될 것입니다[35]. 브루셀라증은 전 세계적으로 매년 500,000명의 새로운 인간 사례가 진단되는 세계에서 가장 만연한 세균성 인수공통전염병입니다[9, 36]. 인간 브루셀라증의 증상은 감염이 신체의 모든 기관에 영향을 미칠 수 있기 때문에 병리학적이지 않습니다[37]. 비록 실험실 발견이 질병 탐지에 있어 여전히 신뢰할 수 있는 요소이지만 배양, 혈청학 및 핵산 증폭 검사를 포함한 현재 전략은 심각한 결함을 보여줍니다[9, 38, 39, 40]. 따라서 본 연구에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 LSPR 기반의 새로운 진단법을 도입하고자 한다.
최근에는 국부적 표면 플라즈몬 공명이 바이오센서 개발의 기초로 활용되고 있다. 금 나노 입자에 대한 현재 연구의 장점과 나노 기술의 발전은 진단 성능을 향상시키는 주요 요인으로 간주되었습니다. 플라즈몬 효과 및 조정 가능한 효과로 인한 GNP의 고유한 색상 및 광학 특성은 다른 입자에 비해 이러한 입자의 두 가지 탁월하고 유익한 특성입니다[12, 41].
이 연구에서 LSPR 피크의 적색편이는 LPS 항원과 항-Brucella 항체 사이의 상호작용의 지표로 사용되었습니다. 즉, 대조군과 비교하여 증례 시료의 혈청 내 항체의 존재는 브루셀라증의 지표로 추정할 수 있는 LSPR 흡수 피크의 현저한 적색편이를 야기하였다. 대조 검체와 증례 검체 사이에 적색편이에 상당한 차이가 있지만, 이 차이는 혈청 내 항체 농도를 정량화할 수 없으며, 이는 이 방법의 심각한 한계 중 하나로 간주될 수 있습니다. 그러나 ELISA 관련 전략과 같은 일부 일반적인 방법은 일반적으로 컷오프 포인트로 간주된다는 점을 기억해야 합니다[42, 43].
중요하게, 이 연구는 다양한 매개변수를 평가하여 얻은 결과를 다른 현재 방법과 비교하여 LSPR 기반 기술의 성능을 검증했습니다. 첫 번째 분석 변수는 환자에서 브루셀라증 검사가 양성일 확률을 결정하는 민감도였다[44]. Yagupsky et al. [9]에서 논의한 바와 같이, 현재의 금본위제로 간주되는 혈액 배양의 민감도는 특히 만성 질환 및 국소 감염에서 감소된다. 또한, 이 방법은 실험실 안전 문제, 박테리아의 느린 성장과 같은 다른 심각한 한계에 직면했으며 긍정적인 결과는 질병의 명백한 증거입니다[45, 46]. 이 LSPR 기반 기술은 배양, SAT 및 ELISA 종속 키트와 같은 감도에서 기존의 방법에 비해 신뢰할 수 있고 경쟁력 있는 결과를 나타냅니다. At the same time, specificity, that is the probability of a negative test if the patient is not infected, was evaluated [45, 47]. As results showed, compared to the other diagnostic strategy, the designed LSPR-based technique had the most significant outcome in terms of specificity. It is an important characteristic of this method because the previous studies had questioned the validity and specificity of serodiagnostic methods of human brucellosis since asymptomatic and self-limiting episodes of this infection occur in zoonosis endemicity areas [48,49,50]. However, like antibody-related methods, the current method resists the possible long-term persistence of anti-Brucella antibodies within the serum, even after complete recovery from brucellosis.
Similar to previous studies, positive predictive value was defined as the ratio of the true positive results to the sum of all positive results [51]. Similarly, the NPV was described as the ratio of the true negative results to the sum of all negative results [51]. Compared to conventional diagnostic strategies, the current designed method represented the most wonderful PPV outcomes, demonstrating its ability to distinguish between infected and non-infected individuals. In addition, the evaluation of the NPV results revealed the promising potential of the LSPR-based method to exclude non-patients from real patients.
Conclusion
This study introduced a rapid, simple, low cost, reliable, and economical method for diagnosing brucellosis. Although there are some minor limitations, including the qualitative outcomes and the possibility of being positive in recovered individuals, the advantages discussed show that it has good capabilities compared to the current laboratory-based diagnostic procedures.
데이터 및 자료의 가용성
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약어
LPS:
Lipopolysaccharides
GNPs:
Gold nanoparticles
DLS:
Dynamic light scattering
LSPR:
Localized surface plasmon resonance
SAT:
Standard tube agglutination test
ELISA:
Enzyme-linked immunosorbent assay
PPV:
Positive predictive value
NPV:
Negative predictive value
PSPR:
Propagating surface plasmon resonance
SDS-PAGE:
Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis
