고체 나노포어의 내부 표면 수정에 기반한 과산화수소 감지

결과 및 토론

HRP를 사용한 나노포어 고정

직경이 ~50nm인 선택된 나노포어를 80°C에서 30분 동안 피라냐 용액에 담그었습니다. 피라냐 용액으로 처리한 후, 나노포어의 내부 표면은 실리콘 수산기를 가질 수 있었다. 이어서, 전체 박막을 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(3-APTES)으로 활성화시켰다. 3-APTES로 처리한 결과 아미노(-NH₂ ) 기가 필름 표면에 생성되었습니다.

(3-아미노프로필)트리에톡시실란(3-APTES)으로 활성화한 후, 나노포어 칩을 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드(EDC)(10mM) 및 N-히드록시숙신이미드(10mM)의 0.1M PBS 용액에 넣었습니다. NHS)(20mM). 그 후, 나노포어 칩을 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)(10ng/ml)에 도입하였다. 우리 그룹[3]의 이전 연구 결과에 따르면 0.1~2M KCl, pH 7.0의 다양한 염 농도에서 HRP는 응집되지 않았습니다. pI 때문에 양고추냉이 과산화효소의 값이 4.3 ± 0.2인 경우, 우리는 또한 HRP가 0.1M KCl pH 6.0 및 pH 7.0에서 응집되지 않음을 증명했습니다. EDC 시약은 HRP의 카르복실(-COOH) 그룹을 반응성이 높은 o-아실리소우레아 중간체로 활성화했습니다. 게다가, 중간체는 NHS의 존재하에서 보다 안정한 succinimidyl amine-reactive ester로 더 전환되었다[58]. 결과적으로 (-NH₂와 중간체의 공유 결합 ) 나노 기공의 내부 표면에 생성되어 안정적인 아미드 결합을 형성합니다(그림 1).

단일 고체 상태 나노포어 채널에서 수정 과정을 수행합니다. 아 카르보디이미드 커플링 화학을 통한 단일 나노포어 채널에 대한 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)의 공유 부착의 도식적 표현. HRP의 카르복실(-COOH) 그룹은 EDC 용액에 의해 활성화되어 HRP가 (-NH₂ ) 나노포어 칩의 표면에 생성된다. ㄴ 고정된 HRP 과산화수소 센서의 구조, 센서의 내부 표면은 HRP로 수정되었습니다. H₂일 때 O₂ ABTS 발생, ABTS ^•+ 생산. HRP의 결정 구조는 저자의 허가를 받아 사용되었습니다 [3]

이러한 과정을 통해 단일 나노포어의 내부 표면에 HRP를 고정화할 수 있습니다. 전류-전압(I-V ) 변형 전후의 단일 나노포어(그림 2).

일반적인 전류-전압(I-V ) 0.1M PBS로 pH 7.0에서 완충된 0.1M KCl에서 비변형(원래) 및 변형된 나노포어의 곡선. 검은색 선 I-V입니다. 수정되지 않은 나노포어의 곡선 및 빨간색 선 I-V입니다. HRP로 변형된 나노포어의 곡선. 삽입 단일 나노포어(~50 nm 시스의 직경) 및 나노포어 센서의 주사 전자 현미경(SEM)입니다. 100 nm는 스케일입니다.

수정된 고체 상태 나노포어 HRP의 특성화

여기에서 단일 Si₃의 모양 N₄ 나노포어 채널은 원통형입니다. 그림 2는 일반적인 전류-전압(I-V ) 0.1M PBS로 pH 7.0에서 완충된 0.1M KCl에서 비변형(원래) 및 변형된 나노포어의 곡선. 나노포어의 내부표면을 HRP효소로 변형시킨 후, 기공의 크기가 작아졌다.

Wanunu et al에 따르면 나노포어 외부의 전도도를 고려하여 고체 나노포어의 직경은 다음 식으로 계산할 수 있습니다.

어디에, d 그리고 나 기공의 직경과 길이, G 나노포어의 열린 기공 전도도, σ 이온 용액의 전도도입니다.

기하학적 효과를 고려하면 고체 상태의 나노포어를 HRP 효소로 변형한 후 유효 크기를 계산할 수 있습니다. 단일 나노포어의 직경은 식 (1)에 기초하여 계산할 수 있다. 여기서, 전도도 값(G _{수정되지 않음} ) ~15 nS는 I-V에서 얻을 수 있습니다. 수정되지 않은 고체 상태 나노포어의 곡선. 전도도(σ ) 이온 용액 0.1M KCl(25°C), 0.1M PBS로 pH 7.0에서 완충은 ~1.28 S/m입니다. 따라서 수정되지 않은 나노포어의 직경은 ~51 nm이며 측정된 직경과 유사합니다. 동일한 방법을 사용하여 얻은 전도도 값(G _수정됨 )은 ~7.5 nS이고 수정된 나노포어의 직경(~34 nm)을 계산할 수 있습니다. 직경 감소는 다음 두 가지 이유 때문에 가능합니다. 첫째, 나노포어의 내부 표면을 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(3-APTES)으로 처리하여 나노포어의 표면이 (-NH₂ ) 아미노기. 두 번째 이유는 유체역학적 직경(D _어 )의 HRP 효소가 ~8 nm[3]인 경우 고정된 HRP는 기공의 직경을 감소시킬 수 있습니다. 여기에서 직경이 ~34 nm인 HRP 수정 고체 상태 나노포어가 과산화수소 검출 채널로 사용됩니다.

산화환원 반응의 원리

산화환원 반응은 하나의 변형된 나노포어 내부에서 진행되었으며 다음과 같은 반응 과정은 제안된 산화환원 반응과 잘 일치한다[58]. H₂가 있는 경우 O₂ (0.5mM), 나노포어 내부 표면에 고정된 HRP 효소는 즉시 화합물 1로 전환되었다. 그런 다음, 화합물 1은 환원 기질 분자 ABTS(1.5mM)로부터 하나의 전자를 받아 화합물 2를 생성했습니다. 이어서, 화합물 2는 다른 기질 분자 ABTS로부터 하나의 전자 전달을 통해 휴지기 효소로 환원되었습니다.

양이온 제품(ABTS ^•+ )의 산화 환원 반응이 단일 나노 기공에 축적되었습니다. 나노포어 채널에서 축적된 분자의 전위는 전도도(G ), 따라서 전류의 변화(ΔI _b )를 찾을 수 있습니다.

이동 이벤트 감지

실험은 0.1M PBS로 pH 7.0에서 완충된 0.1M KCl에서 변형된 기공 직경(~34nm)을 갖는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 변형된 나노기공을 사용하여 수행되었습니다. 2,2'-아지노비스-(3-에틸벤즈티아졸린-6-설포네이트(ABTS)(1.5mM) 및 과산화수소(H₂) O₂ )(0.5mM)을 나노포어의 트랜스 구획에 첨가하였다. ABTS와 H₂ 추가 후 O₂ , -100 ~ -800 mV의 바이어스 전압을 사용한 실험이 수행되었으며 100kHz에서 샘플링되었습니다. 전압이 -400mV로 증가할 때까지 전위 이벤트는 없었습니다. 그림 3은 0.1M KCl, 0.1M PBS, pH 7.0에서 -400~-800mV의 다양한 전압에서 전위 이벤트의 대표적인 이온 전류 추적을 보여줍니다. 다른 전압의 장기간 전위 이벤트의 실험 데이터가 보충 자료에 추가되었습니다(추가 파일 1:그림 S3 참조).

아 –이 -400 ~ -800 mV의 다양한 전압에서 전위 이벤트의 개략도. 인가 전압이 -400mV에서 -800mV로 증가하면 전위 이벤트의 빈도가 증가했습니다. 에 전류 진폭은 전압에 따라 선형적으로 증가합니다. 아 기하급수적으로 감소하는 함수(t _d ~ e ^−v/v0 ) 인가 전압에 따른 드웰 시간을 맞추기 위해 사용되었습니다.

0.1M KCl, 0.1M PBS, pH 7.0에서 수행된 밀리초 전류 차단 이벤트가 관찰되었습니다. 시약 H₂를 추가하여 O₂ 및 ABTS를 transcompartment에 넣고, 단일 나노포어 채널의 내부 표면에 고정화된 HRP 효소 및 산화환원 반응이 일어났다. 풍부한 ABTS ^•+ 분자가 생성되었으며 더 작은 단일 분자 ABTS ^•+ 시스템의 분해능으로 인해 고체 상태 나노포어를 사용하여 감지되지 않을 수 있습니다[3]. 그러나 이러한 분자는 생산 후에 응집됩니다. 따라서 ABTS ^•+ 를 감지할 수 있습니다. 분자. 여기에서 음의 전압을 유지하고 ABTS ^•+ 를 집계했습니다. 나노포어를 통과한 분자. 음의 전압이 인가되었을 때 전기영동 및 전기삼투 흐름이 있었습니다. HRP는 0.1M KCl, 0.1M PBS, pH 7.0 [3]에서 음전하를 띠며, 결과적으로 이중 전기층이 생성되고 전기삼투는 음극 방향을 향하게 됩니다. 이 때문에 전기영동과 전기삼투압은 같은 방향을 향하고 있었다. 집계된 ABTS ^•+ 단일 나노포어 채널에서 고체 상태 나노포어를 통해 이동하고 음극 방향으로 흐릅니다.

이동 사건의 통계적 분석

편향된 전압이 집계된 ABTS의 전위에 중요한 역할을 하기 때문에 ^•+ , 집계된 ABTS의 현재 봉쇄의 영향 ^•+ HRP를 통해 수정된 나노포어를 통과하는 것과 인가된 전압을 비교하는 것이 논의되었습니다. 전위 이벤트의 발생 빈도는 전압이 증가함에 따라 크게 향상되었습니다(그림 3f). 전압이 증가하면 전류의 진폭도 증가합니다. 그러나 편향된 전압이 -300mV 미만으로 유지되면 전위 이벤트가 점차 사라졌으며, 이는 집계된 ABTS ^•+ HRP에 걸쳐 수정된 나노포어에는 -300mV 임계 전압이 필요했습니다. 그림 4는 집계된 ABTS ^•+ 에 대해 측정된 전위 이벤트의 평균 전류 진폭의 히스토그램을 보여줍니다. 다른 전압에서. 피팅 곡선을 기반으로 현재 막힘의 피크 값(ΔI _b ) 308.4 ± 27.795 펜실베니아 419.1 ± 20.354 펜실베니아 478.8 ± 32.857 펜실베니아 528.1 ± 36.98 (PA) -400에서 606.9 ± 40.916 (PA) -500, -600, -700, 그리고 -800 mV의 각각, 그 가능성이있다 전류 감소는 집계된 ABTS에 의해 유도됩니다. ^•+ 다른 전압에서 나노포어를 통과하는 분자. 전류 진폭의 값은 -0.706의 기울기와 49.262의 절편을 생성하는 1차 다항식 함수에 맞춰졌습니다. 그러나 피팅 곡선을 기준으로 하면 체류 시간 값은 54.5 ± 21.374ms, 42.8 ± 20.181ms, 10.3 ± 3.05ms에서 ,0,0 3.05ms, 6.0 ± 1.740 4ms, 700 및 -800mV. 그림 3h는 기하급수적으로 감소하는 함수를 보여줍니다(t _d ~ e ^−v/v0 )은 적용된 전압에 따라 달라지는 체류 시간을 맞추기 위해 사용되었습니다. 전위 이벤트의 체류 시간 히스토그램이 보충 자료에 추가되었습니다(추가 파일 1:그림 S4 참조).

집계된 ABTS에 대해 측정된 전위 이벤트의 평균 전류 진폭의 히스토그램 ^•+ 0.1M KCl, 0.1M PBS, pH 7.0에서 서로 다른 전압(-400, -500, -600, -700, -800mV)에서. 모든 히스토그램은 가우스 분포에 맞게 조정되었습니다.

집계된 각 ABTS의 현재 봉쇄 대 이벤트 체류 시간 ^•+ 서로 다른 전압에서 2차원 산점도에 맞춰졌습니다(그림 5). 집계된 모든 ABTS ^•+ −400 ~ −800mV의 이벤트 클러스터 표시, 주요 이벤트 클러스터는 집계된 ABTS로 인한 것입니다. ^•+ HRP를 통해 수정된 고체 상태 나노포어를 통과합니다.

집계된 각 ABTS에 대한 현재 차단 대 이벤트 체류 시간의 2차원 산점도 ^•+ 다른 전압에서. 해당 히스토그램은 오른쪽과 위쪽에 표시됩니다. 모든 히스토그램은 가우스 분포에 맞게 조정되었습니다.

또한, 모든 전압에서 단일 전위 이벤트를 분석하였고, 전류 차단은 동일한 크기 및 하전 물질에 의해 유도되었다. 따라서 모든 전위 이벤트는 단일 집계 ABTS ^•+ 에 의해 유발된 것으로 간주됩니다. . 집계된 ABTS의 전위 시간을 분석하려면 ^•+ 우리의 실험에서. 현재 봉쇄 기간 t _d 단일 집계 ABTS의 체류 시간으로 간주됩니다. ^•+ 그것이 생성된 위치에서 나노포어의 출구까지. 여기에서 또 다른 조건이 고려되었는데, 나노포어의 입구에 고정된 일부 HRP 효소가 있을 수 있고 산화환원 반응을 촉매할 수 있습니다. 따라서 단일 나노포어의 입구가 아닌 내부 표면에서 산화환원 반응이 일어나는 것을 확인하기 위해 다른 실험을 진행하였다. 검증을 위해 수정되지 않은 HRP를 적용하여 분석하였다. 이 나노 기공은 3-APTES로 활성화되었습니다. 동일한 농도의 HRP(10ng/ml), ABTS(1.5mM) 및 H₂ O₂ (0.5mM)을 나노포어의 트랜스 구획에 첨가하고, 0.1M KCl, 0.1M PBS, pH 7.0에 음의 바이어스 전압을 인가하여 전기영동력으로 인해 HRP가 나노포어를 통과할 수 없었다. 산화환원 반응으로 인해 집계된 ABTS ^•+ 생성되었지만 전위 이벤트가 발견되지 않았습니다. 집계된 ABTS ^•+ HRP로 정전기 효과를 일으키고 ABTS의 집계를 방지합니다. ^•+ 나노포어를 통과합니다.

그림 6은 컨덕턴스 변화의 2차원 산점도를 보여줍니다(ΔG ) 및 집계된 각 ABTS의 이벤트 체류 시간 ^•+ 다른 전압에서. 컨덕턴스의 변화(ΔG ) 주로 0.8 nS에 집중되어 있습니다. 전위 이벤트의 형태는 거의 동일합니다. ΔG의 평균값 다른 전압에서 ~0.8nS입니다. 집계된 모든 ABTS ^•+ 의 볼륨 제외를 추측할 수 있습니다. 분자는 거의 동일합니다. 집계된 ABTS의 정전기 및 입체 효과 ^•+ 분자는 이온 전류를 변경할 수 있습니다. 분석 후 양전하를 띤 집계된 ABTS ^•+ 가 있는 전류 트레이스의 두 가지 일반적인 모양 전위가 관찰되었다(그림 7). 대표적으로 -700 mV에서의 전위 이벤트. 두 가지 유형 사건의 비율을 분석한 결과, 유형 1 사건의 비율은 전압이 증가함에 따라 증가하는 반면, 유형 2 사건의 비율은 감소하는 것을 관찰할 수 있다. 전압이 높을수록 낮은 전압보다 전위가 빨라지는 것으로 간주되었습니다.

ΔG의 2차원 산점도의 개략도 집계된 각 ABTS의 이벤트 체류 시간 대 ^•+ 다른 전압에서. 해당하는 적합 곡선이 위에 배치되었습니다. 삽입 서로 다른 전압(-400 ~ -800 mV)의 전위 이벤트입니다.

아 −700mV 전압에서 두 가지 유형의 전위 이벤트 도식. ㄴ 서로 다른 전압(−400, −500, −600, −700, −800 mV)에서 두 가지 유형 이벤트의 백분율

현재 봉쇄 신호는 집계된 ABTS ^•+ 의 크기, 형태 및 상호 작용을 나타냅니다. 단일 나노포어 채널을 통과합니다. 현재 형태의 변화에 ​​대해서는 변화의 과정을 추측했다. 이벤트 1의 경우 전류 신호는 강도가 깊고 체류 시간이 짧은 전형적인 변동 부분을 가지고 있습니다. 집계된 ABTS ^•+ 생성된 곳에서 나노포어를 통과합니다. 집계된 ABTS ^•+ 일 때 나노포어를 통과하여 나노포어의 이온전류가 원래 수준(Baseline)으로 복원됨(I ₀ ). 이벤트 2의 경우 전류 신호는 진폭이 깊은 변동 부분을 가지고 수평 단계를 갖습니다. 이러한 신호 형태는 집계된 ABTS의 정전기적 상호 작용에 기인할 수 있습니다. ^•+ 나노 기공의 출구에서 HRP로 전류가 천천히 기준선으로 회복되었습니다. 전류 변화를 더 잘 이해하려면 개방 기공 전도도 변화(G _모공 ) 염 농도(0.1 M KCl)에서. 이전 연구에서 논의된 바와 같이, 직경이 d인 음으로 대전된 나노포어의 열린 기공 전도도 방정식 길이 l 낮은 염 농도에서

여기서 μ _케이 그리고 μ _Cl K ⁺ 의 전기영동 운동성 및 Cl ^- , n _KCl K ⁺ 의 수 밀도입니다. 및 Cl ^- , 기본 전하는 e, σ _p 는 나노포어 표면의 표면 전하 밀도입니다. 이 실험에서는 고체 상태의 나노포어를 화학적으로 변형시키고 나노포어의 직경을 변화시켰다. 나노포어 표면의 표면 전하 밀도(σ _p ) 정확하게 구할 수 없습니다. 따라서 열린 기공 전도도(G _모공 )는 식 (1)에 기초하여 계산하였다. 식 (1)로 인해 개방 기공 컨덕턴스(G _모공 )는 ~7.5nS입니다. 컨덕턴스의 변화는 두 가지 이유에 기인할 수 있다고 추측된다[15]. 첫 번째 이유는 나노포어에서 이온의 부피 배제가 응집된 ABTS ^•+ 에 의해 점유되었기 때문입니다. 분자. 그 결과 고상 나노포어의 전도도가 감소하였다(ΔG ^- ). 두 번째 이유는 응집된 ABTS ^•+ 에 의해 나노포어에서 일부 이온이 가져오기 때문입니다. 고체 나노 기공의 전도도를 증가시키는 분자. 이 실험에서 ABTS ^•+ 나노포어 내부에서 생성되어 이온이 유입되지 않았습니다. 따라서 고상 나노포어의 전도도 변화(ΔG )은 부피 배제에 의해서만 유도되었다. 따라서 컨덕턴스의 총 변화는 다음과 같이 설명될 수 있습니다.

고상 나노포어의 전도도 감소는 부피 배제에 의해 유도되며 다음 방정식으로 계산할 수 있습니다.

여기서 γ 는 같은 부피의 구형과 입자의 표면적 비율인 입자 형상 계수입니다. 이 작업에서 집계된 ABTS ^•+ 분자는 전역 객체로 단순화되었으므로 γ의 값 는 1이고 Λ 볼륨 제외입니다. 벌크 용액의 전도도 σ 1.28S/m, 0.1M KCl(25°C)입니다.

볼륨 제외(Λ ), 우리는 일부 다른 분자의 전위 사건에서 추론할 수 있습니다. 컨덕턴스 변화 연결용(ΔG ) 분자의 물리적 성질에 대해 옴의 법칙은 고체 상태의 나노 기공을 기반으로 한 전해액의 부피 변화에 적용될 수 있다[59]. 원통형 고체 나노 기공에서 분자의 전위 현상이 발생하면 전류가 순간적으로 감소합니다. 고체 나노포어의 저항이 전체 회로 저항일 때 전도도 변화(ΔG )는 다음 방정식으로 설명할 수 있습니다.

이 방정식에서 A _p 안 _효과 =V _p 고체 나노포어의 부피, f (d _m /디 _p , lm/h _효과 )은 보정 계수(표면 전하 효과 무시)이며, 실험에서 집계된 ABTS ^•+ 를 단순화했습니다. 분자를 전역 객체로; 따라서 보정 계수는 1입니다. d _m /디 _p 분자 직경과 나노포어 직경의 비율, The lm/H _효과 는 분자 유효 길이와 나노 기공 유효 길이의 비율입니다. 식 (5)는 다음과 같이 단순화될 수 있습니다.

컨덕턴스의 평균 값(G _모공 ) 전좌 이벤트를 분석했습니다. 식 (5)에서 부피 배제의 평균값(Λ ) 다른 전압(-400, -500, -600, -700, -800 mV)에서 얻을 수 있습니다. 한편, 사용된 나노포어의 크기는 알려져 있으며, 나노포어의 부피(V _p )는 ~90746nm ³ 입니다. . 식 (4)로 인해 컨덕턴스 변화 값(ΔG ^- ) ~0.6 nS로 계산할 수 있습니다. 다른 전압(-400, -500, -600, -700, -800 mV)에서 전위 이벤트 실험에서 얻은 컨덕턴스 변화의 평균 값은 ~0.784nS입니다. 계산된 값이 실험값에 가깝다는 것을 알 수 있습니다.

일부 이전 조사에서 과산화수소 분자는 다른 기술로 검출되었습니다. 그러나 나노채널로 과산화수소를 검출하는 경우는 드물다. Tan et al. [3] HRP가 나노포어에 삽입될 때 차별화된 이질적인 이벤트 신호, ABTS 및 H₂ O₂ KCl 용액에서. HRP 전위가 있는 다른 유형의 신호는 ABTS ^•+ 로 간주되었습니다. 나노포어를 통과한다. 효소 촉매 기질 생성물의 전위의 6가지 전형적인 사건을 분석하였다. 그들은 모든 유형의 가능한 과정을 추측했습니다. 그러나 증언할 증거가 충분하지 않다. Mubarak Ali et al. have accomplished to detect the redox reaction products inner single conical nanochannels [58]. They found that the cationic radical ABTS ^•+ reduced the ion current in the HRP-nanochannel in a voltage-dependent fashion, consistent with voltage-dependent concentrations of ions in conical nanochannels. The magnitude of the current blockage was correlated with the H₂ O₂ concentration in the solution.