현재 연구는 arowana 물고기의 성별을 식별하는 간단한 방법을 설명합니다(Scleropages formosus ). DNA 바이오센서는 atto M 체제까지 매우 낮은 수준에서 특정 DNA 서열을 검출할 수 있었습니다. 아크릴 마이크로스피어-금 나노입자(AcMP-AuNP) 하이브리드 복합물을 기반으로 하는 전기화학적 DNA 바이오센서가 제작되었다. 소수성 폴리(n-부틸아크릴레이트-N-아크릴옥시숙신이미드) 미소구체는 쉽고 잘 확립된 1단계 광중합 절차로 합성되었으며 탄소 스크린 인쇄 전극(SPE) 표면의 AuNP에 물리적으로 흡착되었습니다. DNA 바이오센서는 강력한 공유 부착을 통해 숙신이미드 기능화된 AcMP에 아민화된 DNA 프로브를 이식함으로써 간단하게 구성되었습니다. DNA 혼성화 반응은 전기활성 올리고뉴클레오티드 표지로 안트라퀴논 모노술폰산 산화환원 프로브를 사용하는 차동 펄스 전압전류법(DPV) 기술에 의해 결정되었습니다(표 1). 1.0 × 10 −18 의 낮은 감지 한계 1.0 × 10 −18 의 넓은 선형 교정 범위의 M ~ 1.0 × 10 −8 남 (R 2 =0.99)는 최적의 조건에서 제안된 DNA 바이오센서에 의해 달성될 수 있습니다. arowana DNA의 전기화학적 검출은 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 개발된 DNA 바이오센서는 그 작은 크기와 가벼운 무게로 인해 어류 양식용 기능성 키트의 개발 가능성이 높다.
<섹션 데이터-제목="배경">아시아 아로와나(경화증 )은 민물고기[1]로 말레이시아, 싱가포르, 태국, 인도네시아, 캄보디아, 베트남, 라오스, 미얀마, 필리핀 등 동남아시아 지역의 시골에 널리 분포한다. 또한 호주와 뉴기니에서도 아로와나 물고기가 발견됩니다[1,2,3,4]. 드래곤피쉬, 아시아 본텅, 켈리사, 바주란타이로 널리 알려져 있다[5, 6]. 쥐라기 시대의 원시 어종으로 여전히 생존하고 있다[7, 8]. 중국과 아시아 사람들은 다른 많은 문화와 함께 행운과 행복의 상징으로 그것을 생각했습니다[6]. 일반적으로 아로와나는 성숙한 나이에 무게가 약 7kg이고 길이가 1m입니다[9]. 이 관상용 물고기는 매력적인 색상과 형태를 가지고 있으며 몸집이 비교적 길고 가슴지느러미가 크며 등지느러미와 뒷지느러미가 몸에서 훨씬 뒤쪽에 있는 것과 같은 독특한 물리적 특징으로 식별할 수 있습니다. 아시아 로와나 종 내에서 밀접하게 관련된 민물고기의 황금색, 빨간색 및 녹색의 세 가지 주요 색상 품종이 있습니다. 또한 동남아시아의 여러 지역에서 유래한 몇 가지 다른 종들이 있으며 많은 하천 시스템에 지역적으로 분포합니다[8].
관상용으로 높은 인기와 큰 수요로 인해 아시아 아로와나는 이윤을 위해 치열하게 사냥되어 왔으며[6], 그 결과 인구가 급격히 감소했습니다. 아시아 아로와나는 관상용 산업에 대한 높은 수요, 자연 개체군의 남획, 생활 환경의 변화로 인한 자연 서식지의 희소성을 고려할 때 1980년 국제 무역 협약에 의해 멸종 위기에 처한 멸종 위기에 처한 종으로 분류되었습니다. 멸종 위기에 처한 야생 동식물 종(CITES)에 포함되었으며 최근에 2006 IUCN 적색 목록[1, 3, 8, 10, 11]에 의해 멸종 위기에 처한 것으로 등재되었습니다. 그러나 이 멸종 위기에 처한 종의 상업적 거래는 인도네시아, 싱가포르 및 말레이시아와 같은 특정 국가를 제외하고 CITES에 따라 금지됩니다. [2, 3, 12]. 아시아에는 많은 CITES 등록 양식업자가 로와나 물고기의 양식 및 거래를 활발하게 수행하고 있습니다[2, 12]. 이 아시아 민물 고기는 지리적으로 고립 된 계통으로 구성되어 있으며 동남아시아 강 전체의 다른 지리적 분포를 기반으로 한 다양한 색상 품종을 가진 종의 유일한 구성원입니다. 종 분포는 이제 아프리카의 나일 강, 남미의 아마존 강, 호주 및 뉴기니까지 확장되는 훨씬 더 광범위합니다[1, 4, 8].
아시아산 아로와나의 다양한 색상 중 빨간색과 황금색 아로와나는 검정, 녹색, 은색 및 기타 색상 품종에 비해 부화장에서 가장 비싸고 인기있는 관상용 애완 동물입니다 [1, 5, 10, 13]. 아시아 아로와나의 알도둑 현상은 다른 어종에 비해 비정형적이다. 일반적으로 아로와나 물고기는 3~4세에 성숙하며 초대형(직경 약 1cm)의 알을 몇 개(30~100개)[14, 15] 낳습니다[16]. 흥미롭게도 수정란과 유충은 수컷 아로와나 물고기의 입에서 보호되고 자라며 부모의 높은 보살핌을 보여줍니다. 아기 arowana를 육안으로 관찰하여 성별을 식별하는 것은 성적 이형성의 독특한 표현형 기관이 없기 때문에 어렵습니다[14, 15]. 그의 입에서 자손을 채취할 때 부모 중 한 명(수컷으로 추정)만이 식별될 수 있습니다. 다른 부모는 많은 잠재적 부모 중에서 식별할 수 없습니다[16].
일반적으로 애호가들은 수족관에서 관상용으로 새끼 아로와나 물고기를 기르고 양식장에서 기르기도 합니다. 그러나 성별 및 색상 다양성 구별을 위한 보조 기술이 부족하기 때문에 모든 유형의 어린 아로와나 물고기는 동일한 가격으로 판매됩니다. 현재까지, 어린 단계에서 아로와나 물고기의 성별과 색깔을 식별하는 확립된 방법이 발표되지 않았습니다. 대신 어린 나이에 성별과 색을 식별하기 위해 아로와나 물고기의 유전 구조와 전기에 기반한 DNA 분석을 사용하여 수백 가지 연구가 수행되었습니다. 신체 크기와 구강 추정에 기반한 전통적인 방법은 성별 및 색상 식별을 위해 아기 arowana의 약 3개월령에서만 만들 수 있습니다[17]. 그러나 이러한 기존의 육안 검사 방법은 시간이 많이 걸리고 종종 부정확한 결과를 제공합니다. 한편, DNA 염기서열분석에 기초한 널리 사용되는 표준 방법, 즉 중합효소연쇄반응(PCR) 및 겔 전기영동은 노동력, 시간 및 자원을 요구한다. 독창적인 문제 해결(ARIZ) 방법의 대체 알고리즘은 이전에 로와나 젠더 감지의 감지에 사용되었습니다[18]. ARIZ는 9개의 다른 부분과 총 40개의 복잡한 단계를 포함하는 젠더 감지를 위한 대체 도구입니다. 그것은 배우고 연습하는 데 매우 오랜 시간이 필요하며 작동하려면 고도로 숙련된 인력이 필요합니다. 예를 들어 다양한 엔지니어링 시스템에 ARIZ를 적용했지만 대부분의 경우 ARIZ의 모든 요구 사항과 프로세스를 다루지는 않았습니다.
이 연구에서 N-acryloxysuccinimide(NAS) 부분을 통해 succinimide 작용기로 변형된 아크릴 폴리머 미소구체를 DNA 프로브 고정을 위한 매트릭스로 사용했습니다. 이전에 Chen and Chiu 2000 및 Chaix et al. 2003 [19, 20], 숙신이미드 작용기는 아민 작용기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다. DNA 마이크로바이오센서 적용을 위해 아크릴 마이크로스피어에 NAS 기능을 통합하면 짧은 기간(몇 분)에 광중합을 사용하는 1단계 절차를 통해 구체를 합성하고 기능화할 수 있는 간단한 준비 방법의 이점을 제공합니다. 또한, 미소구체는 크기가 작고 DNA 프로브 고정을 위한 넓은 표면적을 제공하여 반응물 및 생성물의 확산 장벽을 줄이는 장점이 있습니다. 이것은 더 짧은 응답 시간과 더 넓은 선형 응답 범위 측면에서 바이오센서 성능의 개선을 가능하게 하며, 이는 여기에 보고된 작업에서 입증될 것입니다.
본 연구에서는 어린 아로와나 어류의 성별을 고정밀도로 판별하기 위해 고감도, 단순, 제작 용이성, 저비용 전기화학적 DNA 바이오센서 방법을 제안한다. DNA 바이오센서는 콜로이드 금 나노입자(AuNPs)와 NAS 작용기로 기능화된 폴리아크릴레이트 미소구체로 변형된 탄소 스크린 인쇄 전극(SPE)으로 제작되었습니다. AuNPs는 정전기적 상호작용을 통해 탄소 SPE 표면에 고정되고 전극 전도도를 향상시키고 전자 전달을 촉진하는 데 중요한 역할을 하는 반면, 아크릴 미소구체(AcMPs)는 물리적 흡착을 통해 AuNP 변형 SPE에 직접 증착되었습니다. Arowana의 아미노화 된 DNA 프로브는 AcMP의 노출 된 succinimide 그룹에서 고정 된 AcMP-AuNP 복합체에 공유 결합되었습니다. 프로브-표적 혼성화는 차동 펄스 전압전류법(DPV)을 통해 안트라퀴논 산화환원 표지로 검출되었습니다. 작고 균일한 크기의 AcMP를 통합하여 큰 DNA 로딩 용량을 유지할 수 있었고 전기화학적 arowana DNA 바이오센서의 감도 및 검출 한계를 향상시킬 수 있었습니다.
모든 전기화학적 측정은 -1.0V ~ -0.1V의 전위 창 내에서 0.02V 단계 전위에서 Autolab PGSTAT 12 potentiostat/galvanostat(Metrohm)을 사용하여 DPV로 수행되었습니다. AcMP 및 AuNP로 수정된 Scrint Technology Co Malaysia의 SPE는 다음과 같이 사용되었습니다. 작동 전극. 막대 모양의 백금(Pt) 전극과 3.0 M의 KCl 내부 용액이 채워진 Ag/AgCl 전극을 보조 전극과 기준 전극으로 각각 사용하였다. Elma S30H sonicator bath는 균질한 용액을 준비하는 데 사용되었습니다.
2-2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPP)은 Fluka에서 구입했습니다. 1,6-헥산디올 디아크릴레이트(HDDA), n-부틸 아크릴레이트(nBA) 및 Au(III) 염화물 삼수화물은 Sigma-Aldrich에서 공급했습니다. 콜로이드 AuNPs는 Grabar et al.에 의해 보고된 방법에 따라 합성되었습니다. (1995). Sodium dodecyl sulphate(SDS)와 NaCl은 Systerm에서 구입했습니다. NAS 및 anthraquinone-2-sulfonic acid monohydrate sodium salt(AQMS)는 Acros에서 조달했습니다. Milli-Q 물(18mΩ)은 모든 화학적 및 생물학적 용액을 준비하는 데 사용되었습니다. DNA 프로브의 스톡 용액은 0.05M의 K-인산 완충액(pH 7.0)으로 희석하고 상보성 DNA(cDNA) 및 비-상보성(ncDNA) 용액은 0.05M의 Na-인산 완충액으로 pH 7.0에서 1.0mM의 인산염 완충액을 포함하여 준비했습니다. AQMS. K-인산염 완충액은 숙신이미드 기능화된 아크릴 물질에 최대 DNA 프로브 고정을 용이하게 하는 반면, Na-인산염 완충액은 DNA 혼성화 반응을 위한 최적 조건을 제공합니다[21, 22].
AcMP는 약간 수정하여 이전에 설명한 방법에 따라 제조되었습니다[22]. 간단히 말해서, 450μL의 HDDA, 0.01g의 SDS, 0.1g의 DMPP, 7mL의 nBA 단량체 및 6mg의 NAS의 혼합물을 15mL의 Milli-Q 물에 용해시키고 실온(25°C ) 10분 동안 그 후, 에멀젼 용액을 N2의 연속적인 흐름 하에서 600초 동안 UV 광으로 광경화시켰다. 가스. 생성된 폴리(nBA-NAS) 마이크로스피어를 4000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 수집한 다음 K-인산염 완충액(0.05M, pH 7.0)에서 3회 세척하고 주위 온도에서 건조되도록 둡니다.
표면 개질 전에 탄소 SPE를 탈이온수로 완전히 헹구고 3 mg/mL의 아크릴 폴리머 미소구체로 적가 코팅하고 주변 조건에서 공기 건조시킨 다음 5 mg/mL의 콜로이드 AuNPs. AcMPs와 AuNPs로 변형 전과 후의 탄소 SPE의 전기화학적 특성을 CV 방법으로 조사하였다. 그림 1은 전기화학적 DNA 바이오센서의 3단계 제작과 1단계 arowana cDNA 검출로 구성된 방법을 보여줍니다. 약 10μL의 콜로이드성 AuNP(1mg/300μL)를 먼저 탄소 SPE에 증착하고 25°C에서 공기 건조했습니다. AcMP(1 mg)를 에탄올(100 μL)에 쉽게 현탁하여 안정적인 분산을 형성함에 따라 AcMP 현탁액 10 μL을 AuNP-변형된 SPE에 드롭 코팅했습니다. AcMP-AuNP-modified carbon SPE는 DNA 고정 과정이 일어나도록 6시간 동안 300μL의 5μM arowana DNA 프로브 용액에 담그고 K-인산염 완충액(0.05M, pH 7.0)으로 3회 조심스럽게 세척했습니다. 언바운드 캡처 프로브를 제거합니다. 고정된 DNA 프로브는 나중에 2M의 NaCl과 1mM의 AQMS를 포함하는 300μL의 표적 DNA 용액에 침지되어 DNA 혼성화 및 삽입 반응이 1시간 이내에 일어나도록 한 다음 Milli-Q 물과 Na-인산염으로 순차적으로 헹굽니다. 혼성화되지 않은 DNA 단편의 제거 및 AQMS 전기화학적 표지의 특이적 결합을 위한 완충액(0.05 M, pH 7.0). 모든 DPV 측정은 pH 7.0 및 실온에서 4.5mL의 0.05M K-인산염 완충액에서 수행되었습니다.
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AcMP-AuNP-modified 전극을 기반으로 한 전기화학적 arowana DNA 바이오센서의 제작과정
각각의 AcMP, AuNP 및 AcMP-AuNP 합성물로 변형된 DNA 전극은 1mM의 AQMS와 2M의 NaCl이 있는 상태에서 DPV 전기 분석 방법으로 cDNA(5μM) 및 ncDNA(5μM) 테스트에 사용되었습니다. 0.5 V/s 대 Ag/AgCl 기준 전극의 스캔 속도. DNA 프로브 고정 기간은 AcMP-AuNP로 변형된 SPE 9개 단위를 300μL의 5μM arowana DNA 프로브 용액에 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12 및 18시간 동안 따로 담가 결정했습니다. 1mM의 안트라퀴논 산화환원 인터칼레이터와 2M의 NaCl을 함유하는 DNA 혼성화 완충제(pH 7.0에서 0.05M의 Na-포스페이트 완충제)에서 5μM의 cDNA와의 반응. DNA 혼성화 시간은 2M의 NaCl과 1mM의 AQMS가 있는 300μL의 5μM cDNA 용액에 DNA 전극을 10-100분 동안 담가서 조사했습니다. DNA 혼성화 기간에 대한 온도의 영향은 DPV 기술을 사용하여 측정 완충액에서 5-90분의 실험 기간 동안 4, 25, 40 및 50°C에서 arowana DNA 바이오센서 반응을 측정하여 수행되었습니다. pH 효과 연구를 위해 arowana DNA 바이오센서를 pH 5.5와 pH 8.0 사이에서 2M의 NaCl 및 1mM의 AQMS로 조건화된 0.05M의 Na-인산염 완충액으로 제조된 5μM의 cDNA 용액에 담근 후 DPV를 측정했습니다. 다양한 양전하 이온의 효과(즉, Ca 2+ , 나 + , K + 및 Fe 3+ ions) 전기화학적 arowana DNA 바이오센서 반응은 CaCl2를 첨가하여 수행되었습니다. , NaCl, KCl 및 FeCl3 DNA 혼성화 반응 및 DPV 측정 전에 0.05M의 Na-포스페이트 완충액(pH 7.0)에 넣습니다. 혼성화 완충액의 이온 강도는 Na-인산염 완충액과 NaCl 농도를 각각 0.002–0.1000 M에서 1.52–5.50 M으로 변화시켜 최적화되었습니다. 그런 다음 1.0 × 10 −18 에서 일련의 cDNA 농도를 정량적으로 측정하여 arowana DNA 바이오센서의 선형 보정 곡선을 설정했습니다. ~ 2.0 × 10 −2 DPV 방법을 통한 μM. 모든 실험은 삼중으로 수행되었습니다.
총 15개의 아로와나 물고기 조직 샘플은 말레이시아 수산부 FRI(Fisheries Research Institute)에서 친절하게 제공되었습니다. 모든 어류 조직 샘플은 4°C의 냉각기에서 70% 에탄올에 저장되었고 실험실로 파견되었습니다. 물고기 조직 샘플을 Milli-Q 물로 세척하고 작은 조각으로 자르고 주변 조건에서 건조시킨 후 -20°C의 냉동고에 보관했습니다. 그런 다음 각 조직 샘플의 Arowana DNA(각각 35-40mg)를 제조업체의 프로토콜에 따라 QIAquick PCR Purification kit(Manchester, UK)를 사용하여 별도로 추출하고 사용하지 않을 때 -20°C에서 보관했습니다. 그런 다음 Bio-Rad PCR 열 순환기(PTC-100, Hercules, USA)를 사용하여 게놈 DNA 단편의 PCR 증폭을 수행했습니다. 그런 다음 PCR 산물의 DNA 단편을 1.5% 아가로스 겔 전기영동으로 분리했습니다. 아로와나 DNA 추출물은 또한 성별을 결정하기 위해 전기화학적 DNA 바이오센서로 분석되었습니다. 얻은 DPV 응답을 로와나 DNA가 없는 상태에서 얻은 기준 전류와 비교했습니다. 그 4 자유도 및 95% 신뢰 수준에서 DNA 바이오센서 응답과 기준선 전류 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해 테스트가 적용되었습니다. 기준선 전류보다 훨씬 더 높은 수준에서 얻은 DNA 바이오센서 응답은 수컷 아로와나 물고기가 감지되었음을 나타내며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
합성된 AcMPs는 주사전자현미경(SEM, LEO 1450VP)으로 관찰되었다(Fig. 2). 광중합으로 제조된 아크릴 미세입자의 크기 분포는 그림 3에 나와 있습니다.
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아크릴 폴리머 미소구체의 SEM 이미지
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광중합으로 제조된 아크릴 미세입자의 크기 분포
K3 존재하에서 AcMPs-AuNPs를 포함하는 탄소 SPE의 다른 스캔 속도의 효과 Fe(CN)6 산화 및 환원 피크 전류는 스캔 속도가 0.05V/s에서 0.30V/s로 증가함에 따라 증가함을 보여주었습니다(그림 4). 따라서 전극 표면에서의 전자 전달 과정은 가역적일 것으로 예상된다[22,23,24,25].
<그림>
1.0mM K3의 순환 전압전류도 Fe(CN)6 전극 표면에 AcMP-AuNP 물질을 포함하는 변형 탄소 SPE에 대해 다양한 스캔 속도(0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 및 0.30 V/s)로 pH 7.0의 0.05 M Na-인산염 완충액에서
Randles-Sevcik 방정식에 기초하여,
$$ \mathrm{ip}=0.4463\ \mathrm{nFAC}\ {\left(\mathrm{nFvD}/\mathrm{RT}\right)}^{1/2} $$ (1)산화환원 피크 전류와 상관 계수(R 2 ) 0.996의 50–300 mV/s 범위 내에서 Eq. 2 및 그림 5a.
$$ \mathrm{ip}=1.463{\mathrm{v}}^{1/2\hbox{--} }2.451 $$ (2) <사진><소스 유형="이미지/웹p" srcset="/ /media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-017-2254-y/MediaObjects/11671_2017_2254_Fig5_HTML.gif?as=webp">
산화 피크 전류(ip/μA) 대 스캔 속도의 제곱근 플롯((mV/s) 1/2 ) (a ) 및 산화 피크 전류의 로그(ip/μA) 대 스캔 속도의 로그(log(mV/s))(b )
이것은 개질된 전극 표면에서의 반응이 확산 조절 반응임을 나타낸다[22,23,24,25].
또한, Fig. 5b에 근거하여, 산화전류의 log 값을 스캔속도의 log 값에 대해 플롯팅했을 때, 기울기가 0.65인 선형선을 얻었고, 이는 확산제어공정의 이론값 0.50에 가까웠다. . 따라서 연구는 변형된 SPE 표면에서의 반응이 대부분 확산 제어됨을 보여주었습니다.
빠르고 가역적이며 단일 전자 전달 프로세스의 이상적인 경우 ΔEp =0.059V at 298K. 그러나 스캔 속도와 함께 증가하는 피크 전위 이동은 0.059V 이상의 더 큰 피크 전위 분리를 보여주었습니다 ). 이것은 전극 표면에서 전자 전달 과정이 느리다는 것을 의미합니다[22, 25, 26]. 아마도 전극 표면을 덮고 있는 AcMP 물질의 존재에 의해 생성된 저항 때문일 것입니다.
그림 6은 AcMP, AuNP 및 AcMP-AuNP 변형 탄소 SPE를 기반으로 하는 Arowana DNA 바이오센서의 DPV 반응을 보여줍니다. 실험 (a)와 (c) 사이에서 관찰된 상당한 DPV 전류 차이는 arowana DNA 프로브가 AcMP의 숙신이미드 작용기와 아민화된 DNA 프로브의 아민 작용기 사이의 강한 공유 결합을 통해 AcMP에 성공적으로 이식되었음을 보여줍니다. arowana DNA 프로브는 cDNA에만 선택적이었습니다[19, 20]. AuNPs는 삽입된 AQMS에서 제작된 전극 표면으로의 전자 전도도를 돕는 역할을 했습니다. 복합 재료(f), 금 나노 입자(e), 금 나노 입자 및 AcMP 복합 재료(d)에 AuNP를 포함하지 않으면 매우 작은 전류 응답만 관찰될 수 있습니다. 실험(b)에서 얻은 낮은 DPV 전류는 ncDNA와 DNA 혼성화 반응이 일어나지 않았기 때문이며, 이는 또한 전극 표면에서 AQMS 산화환원 지시약의 특이적 흡수가 없음을 나타냅니다[27, 28].
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cDNA와의 혼성화 시 AcMP-AuNP 기반 DNA 전극의 DPV 신호(a ) 및 비보완성 DNA(b ), AcMP의 DPV 응답(f ) 및 AuNP 수정 SPE(e ) 및 AcMP-AuNP 복합 변형 SPE 및 AcMP-AuNP 복합 변형 프로브 DNA SPE 기반 DNA 바이오센서의 반응(c ) Ag/AgCl 기준 전극 대비 0.5V/s의 스캔 속도에서 1mM AQMS의 존재 하에 cDNA와 반응하기 전
DNA 프로브 고정 시간의 경우, 그림 7a는 DNA 프로브 고정 시간의 처음 1-3시간 동안 천천히 증가하는 DNA 바이오센서 반응을 나타내고 DNA 바이오센서 반응의 급격한 증가는 DNA 프로브 고정 기간의 3시간에서 6시간 사이에 볼 수 있습니다. . 이는 AcMP-AuNP로 변형된 전극에 더 많은 양의 DNA 프로브가 부착되도록 촉진하기 위해 더 긴 고정 시간이 필요했기 때문입니다. DNA 프로브 고정화 시간의 추가 연장에서 고정된 AcMP의 결합 부위가 DNA 프로브와 완전히 결합됨에 따라 DNA 바이오센서 반응의 눈에 띄는 변화는 감지되지 않았습니다. Arowana DNA 바이오센서 반응은 또한 DNA 혼성화 시간에 의존합니다. 도 7b에 예시된 바이오센서 응답 프로파일은 10분에서 60분까지의 DNA 혼성화 지속 시간으로 증가하는 DPV 전류 응답 경향을 나타내며, 그 후 전류 응답은 거의 안정 상태가 된다. 이 단계에서 전극에 고정된 DNA 프로브는 cDNA와 완전히 혼성화됩니다[29].
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DNA 프로브 고정 시간의 영향(a ) 및 DNA 혼성화 시간(b ) 2M 이온 강도에서 1mM AQMS가 있는 상태에서 5μM DNA 프로브와 cDNA를 사용한 arowana DNA 바이오센서 반응
또한 제작된 arowana DNA 바이오센서의 DNA 혼성화 시간은 온도에 따라 달라지며, 큰 장점으로 실온에서 30분 이내에 최대 전류 응답을 얻을 수 있음을 알 수 있습니다(그림 8). 낮은 온도, 즉 4 °C에서는 저온이 DNA 혼성화 반응 속도를 늦추기 때문에 완전한 DNA 혼성화 반응에 오랜 시간이 필요했습니다. 더 빠른 DNA 혼성화 시간은 25°C 이상의 온도에서 달성될 수 있는데, 이는 고정된 DNA 프로브와 cDNA 사이에 발생하는 더 높은 DNA 혼성화 반응 속도에 기인하여 고온에서 이중체 DNA를 형성하기 때문입니다. 그러나 고온은 DNA의 이중나선 구조를 영구적으로 변형시킬 수 있으며 온도를 최적의 값으로 재조정한 후에도 DNA 분자의 재생은 불가능하다[28, 30].
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온도가 DNA 바이오센서의 DNA 혼성화 시간에 미치는 영향. DPV 반응은 5-90분의 실험 기간 동안 4, 25, 40 및 50°C에서 0.05M K-인산염 완충액(pH 7.0)에서 측정되었습니다.
arowana DNA 바이오센서 반응 최적화의 일환으로 용액 pH가 DNA 혼성화 반응에 미치는 영향을 조사했습니다. DNA 바이오센서는 수성 환경에서 DNA 분자의 용해도를 감소시키는 DNA의 포스포디에스테르 백본의 양성자화로 인해 pH 5.5와 pH 6.5 사이에서 무시할 수 있는 전류 변화를 보여주었다(그림 9). DNA 혼성화 배지의 pH가 추가로 증가하면 아로와나 DNA 바이오센서 반응은 pH 7.0에서 급격히 증가했으며, 그 후 더 높은 pH에서 DNA의 비가역적 변성으로 인해 pH 환경이 염기성 조건으로 변경됨에 따라 DPV 전류의 급격한 감소를 식별할 수 있었습니다. 범위 [23, 24, 31,32,33]. 중성 pH에서 최대 DPV 응답을 얻었으므로 다음 전기 화학적 평가는 0.05M의 Na-phosphate 완충액을 사용하여 pH 7.0에서 arowana DNA 바이오센서 반응을 유지했습니다.
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pH 5.5와 pH 8.0 사이에서 AcMP-AuNP 복합 변형 탄소 SPE를 기반으로 하는 arowana DNA 바이오센서의 DPV 반응. DPV 측정은 0.05M K-인산염 완충액(pH 7.0)에서 25°C 및 Ag/AgCl 기준 전극에 대한 스캔 속도 0.5V/s에서 수행되었습니다.
DNA 혼성화 반응에 대한 양이온의 원자가의 효과는 염의 상이한 양이온을 사용하여 수행되었다. Ca 2+ , 나 + , K + 및 Fe 3+ DNA 혼성화 완충액에 있는 이온. 양전하를 띤 이온은 DNA 분자의 음전하를 띤 포스포디에스테르 사슬과 정전기적으로 상호작용하여 고정된 DNA 프로브와 표적 DNA 사이의 입체 장애와 정전기적 반발을 극복함으로써 DNA 혼성화 과정을 촉진할 수 있습니다[34]. 그림 10은 Na + 순으로 양이온이 존재할 때 DNA 혼성화 반응이 유리함을 보여줍니다.> K + > Fe 3+ > Ca 2+ . Ca 2+ 의 존재 및 Fe 3+ 이온은 Na + 에 비해 arowana DNA 바이오센서 전류 응답에서 현저한 감소를 일으키는 것으로 나타났습니다. 및 K + 이온. 이러한 현상은 DNA 혼성화 완충액[22]에서 난용성 인산칼슘과 인산철(III) 염의 형성에 기인하며, 이는 용액의 이온 함량을 감소시키고 DNA 분자 사이에 높은 정전기적 반발을 유발합니다. 그 결과, DNA 혼성화 속도가 감소하여 바이오센서 성능이 저하되었습니다. Na + 일 때 가장 높은 DNA 바이오센서 반응이 얻어졌습니다. 이온은 DNA phosphodieter 결합에 대한 작은 크기와 강한 친화성 때문에 DNA 혼성화 인산염 완충액에 추가되었습니다.
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Ca 2+ 의 효과 , 나 + , K + 및 Fe 3+ Arowana DNA 바이오센서의 DPV 반응에 대한 DNA 혼성화 완충액(pH 7.0에서 0.05M Na-인산염 완충액)의 이온
NaCl 및 Na-인산염 완충액(pH 7.0)의 농도는 또한 혼성화 완충액에 대한 최적의 이온 강도를 제공하도록 최적화되어야 합니다. 그림 11b는 2M 이하의 이온 강도가 DNA 가닥 사이의 높은 정전기적 반발력을 극복할 수 없음을 나타냅니다. 약 0.05M의 Na-인산염 완충액(그림 11a)과 2M의 NaCl이 최대 바이오센서 성능으로 arowana 표적 DNA의 분석을 위한 최적의 이온 강도를 제공하는 것으로 밝혀졌습니다. pH, 완충 용량 및 이온 강도 측면에서 최적의 혼성화 완충 조건은 DNA 혼성화 반응이 가장 최소의 입체 장애에서 발생하도록 허용할 것입니다[30].
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a Na-인산염 완충액 농도 및 b 혼성화 완충액의 이온 강도는 각각 0.002–0.100 M 및 1.52–5.50 M에서 다양했습니다.
그런 다음 최적화된 DNA 바이오센서를 사용하여 1.0 × 10 −12 사이의 일련의 arowana cDNA 농도를 검출했습니다. 및 1.0 × 10 −2 μM. DNA 바이오센서는 1.0 × 10 −18 의 넓은 선형 응답 범위를 보였습니다. ~ 1.0 × 10 −8 남 (R 2 =0.99). 1.0 × 10 −18 에서 얻은 검출 한계(LOD) M은 선형 보정 기울기로 나눈 LOD를 근사하는 응답 곡선에서 바이오센서 응답의 표준 편차의 3배를 기반으로 계산되었습니다. 마이크로미터 범위 내의 균질한 AcMP 입자 크기는 DNA 바이오센서 감도 및 재현성에 상당한 영향을 미쳤습니다(RSD =5.6%). 고정화된 NAS 기능화된 AcMPs의 큰 결합 표면적은 많은 수의 DNA 분자가 전극 표면에 공유적으로 결합하도록 하여, arowana DNA 바이오센서의 동적 선형 범위 및 검출 한계와 관련하여 DNA 바이오센서 분석 성능을 증가시켰습니다(그림 2a). 12).
The arowana DNA biosensor response curve (a ) and linear calibration range (b ) and the DPV voltammogram (c ) obtained using 1.0 × 10 −18 to 1.0 × 10 −2 μM cDNA at pH 7.0
The developed electrochemical DNA biosensor has been validated with the standard PCR-based method to determine the gender of Asian arowana fish. With the results tabulated in Table 2, both methods provided the same result for the gender determination of arowana fish. This indicates that the proposed DNA biosensor can be used for accurate determination of arowana gender in a simple and fast way.
The electrochemical DNA biosensor developed in this study demonstrated good sensitivity, wide linear response ranges, and low detection limit in the determination of arowana target DNA. In addition, the DNA biosensor showed a good response towards arowana cDNA, which implies that the electrochemical DNA biosensor could be used to successfully detect the arowana DNA segments. The developed arowana DNA biosensor can be further redesigned into a point-of-use device prototype that offers a great potential for the application in the fish culture for early identification of arowana gender and colour, which is economically advantageous in fishery and aquaculture sectors.
나노물질
초록 페로브스카이트 산화물은 기능성 물질의 일종으로 그 독특한 물리적, 화학적, 전기적 특성으로 인해 최근 몇 년 동안 널리 연구되고 있다. 여기에서 페로브스카이트형 LaCoO3를 성공적으로 준비했습니다. (LCOs) 나노물질은 개선된 졸-겔 방법을 통한 소성 및 소성 온도 및 시간이 LaCoO3의 형태, 구조 및 전기화학적 특성에 미치는 영향을 조사했습니다. 나노물질. 그런 다음, LCO-700-4 전극 샘플의 최적 전기화학적 성능을 기반으로 합리적 설계를 통해 새로 합성된 Sr-doping(LSCO-0.2) 및 rGO-comp
초록 여기에서 우리는 바이오 폐기물 Kusha grass(Desmostachya bipinnata ), 화학 공정을 사용한 후 KOH를 통한 활성화에 의해. 합성된 다층 활성탄은 X선 분말 회절, 투과전자현미경, 라만 분광기법을 통해 확인되었다. 준비된 샘플의 화학적 환경은 FTIR 및 UV-가시광선 분광기를 통해 액세스되었습니다. 합성된 물질의 표면적과 다공성은 Brunauer-Emmett-Teller 방법을 통해 접근되었습니다. 모든 전기화학적 측정은 순환 전압전류법(Cyclic voltammetry)과 검류계 충방전(GCD)
