병원성 비브리오 콜레라 결정을 위한 초고감도 전기화학적 바이오센서 (V . 콜레라 ) DNA는 폴리스티렌-코-아크릴산(PSA) 라텍스 나노구체-금 나노입자 복합체(PSA-AuNPs) DNA 운반체 매트릭스를 기반으로 개발되었습니다. 전기활성 안트라퀴논 올리고뉴클레오티드 표지를 사용한 차동 펄스 전압전류법(DPV)은 바이오센서 반응을 측정하기 위해 사용되었습니다. DNA-라텍스 입자 전극에 금 나노입자(AuNP)를 로딩하면 DNA 혼성화의 패러데이 전류가 크게 증폭되었습니다. 보고된 프로브의 사용과 함께 바이오센서는 높은 감도를 입증했습니다. DNA 바이오센서는 1.0 × 10 −21 의 표적 DNA에 대해 재현 가능하고 넓은 선형 응답 범위를 제공했습니다. ~ 1.0 × 10 −8 M(상대 표준 편차, RSD =4.5%, n =5) 검출 한계(LOD)가 1.0 × 10 −21 인 경우 남 (R 2 =0.99). 바이오센서는 91~109%(n =3) V 감지용 . 콜레라 스파이크 샘플의 DNA 및 5%의 반복성 RSD 값(n =5). 전기화학적 바이오센서 반응은 최대 58일의 보관 기간 동안 원래 반응의 95%로 안정적이고 유지 가능했습니다.
<섹션 데이터-제목="배경">비브리오 콜레라 , 식품 매개 병원체는 급성 수양성 설사의 상태를 통해 인간에게 콜레라의 유행을 일으킬 수 있습니다. 콜레라 발병은 여전히 세계의 일부 지역에서 심각한 문제입니다. 아시아와 아프리카, 낮은 사회경제적 지위로 이어진다[1,2,3,4]. 이 장내 병원균은 특히 개발도상국에서 이환율과 사망률의 주요 원인입니다[5]. 여러 지역에서 콜레라의 유행과 대유행은 주로 V에 의해 발생합니다. 콜레라 혈청군 O1 및 O139 [1, 2, 6]. V. 콜레라 혈청군 O1은 콜레라 전염병 사이에서 교대로 나타날 수 있는 두 가지 주요 혈청형, 즉 Inaba와 Ogawa를 가지고 있습니다. 세 번째 혈청형인 히코지마(Hikojima)도 존재하지만 드물고 불안정합니다. O1 항원 생합성을 담당하는 유전자는 rfb로 지정되었습니다. Inaba 및 Ogawa 혈청형을 정의하는 돌연변이는 rfbT 유전자의 단일 결실 돌연변이입니다[7]. 그러나 심한 설사가 있는 사람에서 가끔 식인성 발병도 non-O1/non-O139 V에 의해 발생하는 것으로 보고되었습니다. 콜레라 덜 익힌 해산물 섭취[8] 또는 오염된 수중 환경[9]에 대한 노출을 통해. V의 첫 번째 전염병. 콜레라 O139는 1992년 방글라데시와 인도에서 발생하여 동남아의 다른 나라로 급속히 퍼졌다[10]. 2005년 전 세계적으로 세계보건기구(WHO)에 보고된 콜레라 발병 건수는 총 131,943건, 사망자는 2272건입니다[11].
독성 V의 모니터링 또는 진단을 위한 효과적인 방법에 대한 탐구. 콜레라 박테리아는 콜레라 전염병을 통제하는 데 필수적입니다. V의 전통적인 식별. 콜레라 이는 종종 박테리아의 분리 및 스크리닝을 통해 달성되며, 여기서 알칼리성 펩톤수(APW)의 사전 농축 후 V의 분리가 수반됩니다. 콜레라 thiosulfate citrate bile salt sucrose agar (TCBS) 배양 배지에서 특정 항혈청을 이용한 슬라이드 응집 시험에 의한 동정 [12]. 그러나 이 기술은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 며칠 후 결과가 나왔다면 임상 진단과 환자 치료가 지연되었을 것입니다. V의 검출을 위한 PCR 증폭을 포함하는 분자 방법. 콜레라 [13] 진단 시간이 단축되었지만[14], PCR 방법은 숙련된 전문 기술과 자원이 부족한 국가에서 수행하기 어려운 고가의 인프라가 필요합니다. 면역크로마토그래피 원리에 기초한 신속한 진단 테스트는 V의 개별 또는 동시 검출에 대해 보고되었습니다. 콜레라 혈청군 O1 및 O139. V의 검출에 사용되는 일부 다른 면역분석 기반 기술. 콜레라 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 응집, 면역형광 및 수정 미세저울(QCM)이 있습니다. 그러나 이러한 기술의 대부분은 정교한 기기, 긴 분석 시간, 상세한 기술 지식을 갖춘 고도로 자격을 갖춘 인력이 필요합니다[15,16,17,18,19,20].
전기화학적 방법은 높은 감도, 특이성, 단순성 및 경제적 프로토콜뿐만 아니라 신속한 검출 및 미세 가공 기술과의 호환성으로 인해 핵산 검출에서 상당한 주목을 받았습니다[21, 22]. 또한, 미세유체 칩 기반 DNA 바이오센서 장치와 같이 소형화 기술과 결합된 전기화학적 방법을 현장 분산 분석에 사용할 수 있어 실제 설정에 매우 유용합니다[23]. 유리질 탄소 전극(GCE), 탄소 페이스트 전극(CPE), 금 전극 및 백금 전극과 같은 전기화학 측정에 사용되는 전극의 범위는 광범위합니다. 최근에 스크린 인쇄 전극(SPE)은 낮은 배경 전류 및 넓은 전위 창을 제공하고 탄소 잉크가 저렴하고 대량 생산이 가능하여 비용 효율적이라는 고유한 특성으로 인해 사용에 대한 연구가 집중되고 있습니다. .
V의 검출에 대해 보고된 몇 가지 전기화학적 방법이 있습니다. 콜레라 일련의 복잡한 단계로 구성됩니다. 전기화학 V. 콜레라 Liew et al.에 의해 보고된 genosensor. [24]는 탄소 SPE에 DNA 프로브를 고정하기 위해 전기화학적 흡착 방법을 사용했습니다. 고분자 전해질을 포함하는 동결건조된 AuNPs-변형된 다층 PSA 입자는 샌드위치 DNA 혼성화 분석에서 리포터 라벨로 기능하기 위해 아비딘과 생체접합체를 형성했습니다. 그러나, DNA 바이오센서의 작동 기간을 최대 30일까지 연장하기 위해 PSA-AuNPs-아비딘 생체접합체를 보존하기 위해 소르비톨 안정제의 추가가 필요했습니다. 효소 전기화학 V. 콜레라 DNA 바이오센서는 최근 Yu et al.에 의해 고안되었습니다. [25], 이로써 thiolated anti-fluorescein-conjugated calcium phosphatase (anti-FCAP)-labeled DNA probe는 gold-thiol chemistry를 통해 gold SPE에 결합되었습니다. 표적 DNA는 α-나프틸 포스페이트의 전기활성 α-나프톨로의 효소적 전환을 통해 달성된 DNA 혼성화 인식을 허용하기 위해 범용 플루오레세인으로 태그되었다. 그럼에도 불구하고, 이 검출 방식은 DNA 혼성화에 대해 약 95분의 긴 분석 시간을 필요로 했으며, DNA 혼성체를 기능성 효소로 표지한 후 전류 측정을 수행하기 전에 전기 불활성 α-나프틸 포스페이트 기질에서 전극을 인큐베이션했습니다. 비오틴화된 DNA 프로브와 접합된 아비딘 코팅 탄소 SPE를 기반으로 하는 또 다른 효소 전기화학적 DNA 바이오센서는 Low와 팀원들에 의해 개발되었습니다[26]. 디곡시제닌(DIG)으로 표지된 리포터 프로브도 cDNA 서열에 인접한 이 이중 혼성화 전략에 사용되었습니다. 양고추냉이 퍼옥시다제-연결된 항-DIG(항-DIG-HRP)가 전기화학적 표지로 사용되었으며, 이는 H의 환원과 함께 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)의 산화를 동시에 촉매할 수 있습니다. 2 O2 DNA 혼성화 이벤트의 전기화학적 형질도입을 위해 전극 표면에 전자 전달을 생성합니다. thiolated DNA 프로브 고정 금 코팅 유리 전극을 기반으로 하는 손쉬운 DNA 바이오센서 설계는 Patel et al. [22] V의 신속한 감지를 위해. 콜레라 , 메틸렌 블루를 DNA 혼성화 지표로 사용했습니다. 그러나 시스템의 선형 검출 범위는 μM 수준으로 제한되어 임상 샘플에서의 적용이 제한됩니다.
라텍스-금 나노입자는 이전에 V의 검출에서 DNA 프로브에 결합하는 아비딘/비오틴을 통해 DNA 혼성화 표지로 사용되었습니다. 콜레라 [24], 물고기 병원체 Aphanomyces invadans [27], E. 대장균 [28] 및 비특이적 DNA 혼성화 [29]에 의해 라텍스 구체에 금 나노입자의 음으로 하전된 콜로이드가 정전기적으로 부착되기 전에 고분자 전해질의 다층으로 코팅되었습니다. Kawde와 Wang[29]은 스트렙타비딘 코팅된 라텍스 입자와 비오틴 코팅된 AuNP의 로딩을 통해 DNA 혼성화 표지로 사용하기 위해 DNA 리포터 프로브에 PSA 라텍스 입자를 부착했습니다. Kuan et al. [24, 27] 및 Liew et al. [24, 27] 또한 gold-PSA-DNA 프로브 접합체를 사용하여 동일한 avidin-biotin 결합 방법을 보고했습니다. Pinijsuwanet al. [28]은 DNA 리포터 프로브에 부착된 PSA 입자의 로딩을 위해 정전기적 방법의 사용을 보고했으며 고분자 전해질 금으로 코팅된 PSA 입자는 DPV 전류 응답을 증폭시키는 혼성화를 위한 라벨로 사용되었습니다.
이 연구에서 우리는 V에 대한 고감도 검출 시스템을 개발하기 위해 DNA 프로브 고정 기질로 라텍스-금 나노입자를 사용하는 다른 DNA 고정 접근 방식을 보고하고 있습니다. 콜레라 DNA. 카르복실화 라텍스의 고정 효율을 개선하기 위한 커플링 시약으로 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염/N-히드록시숙신이미드(EDC/NHS) 화학을 사용하여 매우 간단하고 빠른 절차로 DNA 고정을 수행했습니다. 입자 표면. DNA 혼성화 검출은 고정된 DNA 프로브와 표적 서열 사이의 혼성화 반응과 신호/리포터 프로브 사이의 혼성화 반응을 수반하는 샌드위치 유형 분석을 기반으로 했습니다. Anthraquinone-2-sulfonic acid mono-hydrate sodium salt(AQMS)를 전기화학 라벨로 사용하여 하이브리드화 이벤트를 모니터링했습니다. 제안된 서브마이크론 크기의 라텍스 입자는 DNA 프로브 결합 능력을 향상시켰고, 전도성이 높은 금 나노입자(AuNP)를 포함하여 DNA 바이오센서의 감도를 향상시켰다. DNA 바이오센서는 V의 검출에 탁월한 감도를 보여주었습니다. 콜레라 cDNA 및 zeptomolar 수준에서 지금까지 보고된 avidin-biotin 기술에 비해 매우 낮은 검출 한계[24, 26].
스티렌(St) 및 아크릴산(AA)은 Fluka에서 구입했습니다. HAuCl4 ·3H2 O, trisodium citrate dehydrate, sodium dodecyl sulphate (SDS), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS)는 Sigma-Aldrich로부터 입수하였다. 과황산암모늄(APS), 브롬화수소산 및 브롬은 각각 Riedel-De Haen, Ajax Finechem 및 Panreac에서 공급했습니다. 모든 화학 용액은 탈이온수로 준비되었습니다. 30개 염기 표적 및 미스매치 합성 올리고뉴클레오티드는 모두 Bio Service Unit(NSTDA)에서 조달했습니다. 비-상보적 DNA(ncDNA) 및 신호 프로브는 Sigma에서 가져왔고 5'-아미노-변형된 캡처 프로브는 Bioneer에서 가져왔습니다. 포획 프로브는 0.05M 인산칼륨 완충액(pH 7)에서 준비하고, 표적 DNA, 미스매치 표적, 리포터 프로브 및 비-상보적 DNA 용액은 인산나트륨 완충액(0.05M, pH 7)에서 준비했습니다. 본 연구에 사용된 oligonucleotide sequence는 Table 1과 같다.
전기 분석 측정은 GPES(4.0.007) 소프트웨어가 장착된 potentiostat/galvanostat(Autolab PGSTAT12, Metrohm)으로 수행되었습니다. 전압전류법 실험은 탄소 페이스트 스크린 인쇄 작업 전극(SPE)(Quasense, 태국 방콕), Ag/AgCl 기준 전극(KCl 3 M) 및 백금 막대( 2mm 직경) 상대 전극. 차동 펄스 전압전류법(DPV) 기술은 pH 7의 4.5mL 측정 완충액(인산칼륨 완충액 0.05M)에서 0.02V 단계 전위 및 0.5V/s 스캔 속도에서 모든 전기화학적 조사에 사용되었습니다. 주변 온도. 본 연구에서 측정된 모든 전위는 Ag/AgCl 전극을 기준으로 하였으며, sonicator bath(Elma S30H)를 이용하여 균일한 용액을 제조하였다. 주사전자현미경(SEM, LEO 1450VP)을 사용하여 라텍스 구체의 크기와 분포를 확인했습니다.
Turkevich 방법에 따라 구연산 나트륨 환원에 의해 콜로이드 AuNP를 제조했습니다[31]. 간단히 말해서, 약 10mL의 5mM의 HAuCl4 ·3H2 O를 180mL의 탈이온수에 용해하고 결합된 핫 플레이트-자기 교반 장치에서 연속 교반 조건 하에 끓였습니다. 0.5%의 10밀리리터(w /v 끓는 용액에 구연산삼나트륨(trisodium citrate)을 가한 후 용액의 색이 점차 옅은 붉은색에서 루비색으로 변하는 것을 관찰하였다.
라텍스 입자는 Polpanich et al. [23] 약간의 수정이 있습니다. 간단히 말해서, 약 190g의 탈이온수를 350rpm으로 교반하면서 수조에 ~1시간 동안 잠긴 3구 플라스크에서 질소 가스로 퍼지했습니다. 이어서, 20g의 St 및 0.5g의 AA를 첨가하고, 온도를 70℃로 유지하였다. 그 후 탈이온수 10mL에 APS 약 0.2g을 넣고 3구 플라스크의 제형에 부어 라디칼 중합 반응을 개시하고 8시간 동안 중합 과정을 진행하였다. 합성된 카복실 라텍스 구체는 20분 동안 13,000rpm에서 2회 탈이온수로 원심분리하여 수확하고[23, 27, 28] 사용할 때까지 실온(25°C)에서 탈이온수에 재현탁했습니다. PSA 라텍스 입자의 형태와 평균 크기는 주사전자현미경(SEM)으로 측정했습니다.
표면 개질 전에 탄소 SPE를 탈이온수로 완전히 헹군 다음 3 mg/mL의 PSA 현탁액으로 적가 코팅하고 주변 조건에서 공기 건조시킨 다음 5 mg/mL의 콜로이드 AuNP로 적하했습니다. . 라텍스 입자와 AuNP로 개질 전과 후의 탄소 SPE의 전기화학적 특성을 CV 방법으로 조사하였다. 라텍스-AuNPs-변형 탄소 SPE(PSA-AuNPs-SPE)를 탈이온수로 헹구고 카르보디이미드 가교 시약, 즉 0.002M의 EDC와 0.005M의 2시간 동안 NHS [32] 5 μM의 포획 프로브가 포함된 0.05 M의 인산칼륨 완충액(pH 7)에 밤새 담그기 전. 그 후, DNA-변형된 PSA-AuNPs-SPE(DNA-PSA-AuNPs-SPE)를 인산칼륨 완충액(0.05M, pH 7)으로 철저히 세척하여 물리적으로 흡착된 프로브를 제거하였다. DNA 전극을 부분 혼성화를 위해 선형 표적 DNA(1μM) 및 AQMS DNA 혼성화 표지(5mM)를 포함하는 pH 7의 인산나트륨 완충액 0.05M에 담그고 나중에 0.05M 인산나트륨 완충액(pH 7) 완전한 DNA 혼성화 과정을 위해 1μM의 리포터 프로브 및 5mM의 AQMS로 추가 1시간 동안 컨디셔닝. 마지막으로, DNA 전극은 혼성화되지 않은 올리고뉴클레오티드 서열의 제거를 위해 인산칼륨 완충액(0.05M, pH 7)으로 헹구었습니다. SPE에 부착된 각 확장물질의 전기화학적 반응을 DPV 방법으로 조사하였다. 그림 1은 V 개발을 위한 단계별 절차를 나타냅니다. 콜레라 콜로이드성 PSA-AuNPs 고체 지지체에 기반한 DNA 바이오센서.
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DNA 바이오센서 단계별 제작 절차의 도식적 표현
DNA 프로브 및 AQMS 농도, pH, 이온 강도 및 완충 용량과 같은 다양한 매개변수가 신호 프로브 및 표적 DNA가 있는 고정된 DNA 프로브의 혼성화 반응에 미치는 영향이 DNA의 동적 선형 범위를 결정하기 전에 조사되었습니다. 바이오센서. 더욱이, 포획 프로브 고정 및 DNA 혼성화 기간, 바이오센서 수명 및 재생도 개발된 V 전에 평가되었습니다. 콜레라 DNA 바이오센서는 스파이크 및 복구 실험에 적용할 준비가 되었습니다. Capture probe와 AQMS loading은 각각 1에서 6μM과 0.1-5mM에서 농도를 변화시켜 최적화되었으며, target DNA와 report probe의 농도는 0.05M의 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 5μM로 유지되었습니다. pH 효과 및 완충액 농도 연구는 인산나트륨 완충액의 pH와 농도를 각각 pH 5.5에서 8.0으로, 0.001에서 1.000M으로 변경하여 수행되었습니다. 전기화학적 DNA 바이오센서의 DNA 혼성화 반응에서 다른 양이온의 존재는 Na + 를 추가하여 수행되었습니다. , K + , Ca 2+ 및 Fe 3+ 1mM의 AQMS 및 5μM의 cDNA 및 pH 7.0의 검출 프로브를 포함하는 DNA 혼성화 완충액에 1.0M의 이온을 가합니다. 이온 강도 효과는 pH 7.0에서 0.1–3.0 M 범위에 걸쳐 NaCl 농도를 변화시켜 조사했습니다. 그런 다음 DNA 바이오센서의 동적 범위가 1.0 × 10 −21 에서 결정되었습니다. ~ 1.0 × 10 −8 엠 V. 콜레라 5 μM 및 pH 7.0에서 일정한 신호 프로브 농도를 사용하는 cDNA. DNA 프로브 고정 시간은 DNA 전극을 1~13시간 사이에 5μM의 포획 프로브 용액(pH 7.0)에 담가 결정하고 DPV 반응은 1~2시간마다 측정했습니다. 한편, DNA 혼성화 시간은 DNA 혼성화 반응이 15분에서 180분 사이에 일어나도록 하여 결정되었고, DNA 바이오센서 반응은 15분 내지 30분마다 기록되었다. DNA 바이오센서의 저장 수명은 5 μM V의 검출에 대한 DNA 바이오센서 반응을 주기적으로 측정하여 결정되었습니다. 콜레라 120일 동안 cDNA. 분석은 각 샌드위치 혼성화 분석에 대해 새로운 DNA 전극을 사용하여 5회 반복하여 수행되었습니다. DNA 전극의 재생은 4분 동안 0.1M의 NaOH 용액을 사용하여 수행되었고, DNA 바이오센서의 재혼성화(60분)는 2.0M 이온 강도에서 5μM의 cDNA 및 검출 프로브 및 1mM의 AQMS를 포함하는 재혼성화 용액을 사용하여 수행되었습니다. 0.05M 인산칼륨 완충액(pH 7.0). 재생 실험은 6회 반복 수행되었습니다.
다양한 V. 콜레라 박테리아 균주 즉 J2126-I, J2126-II, J3324-I, J3324-II, J3330-I, J3330-II, CDHI 5294-II 및 UVC1324(Citrobacter freundii 포함) (CF-I) 및 Citrobacter freundii (CF-II)는 AIMST University, Kedah의 응용 과학 학부 미생물학 연구실에서 입수했습니다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 QIAGEN Genomic-tip 500/G를 사용하여 이러한 박테리아에 대해 게놈 DNA 추출을 수행했습니다. 그런 다음 추출된 DNA를 인산나트륨 완충액(0.05M, pH 7.0)을 사용하여 100배 희석했습니다. 2.0M의 NaCl 및 1mM의 AQMS를 함유하는 추출된 DNA 약 300mL를 15분 동안 초음파 처리하여 DNA 파손을 해제했습니다. 그런 다음, 고정된 DNA 프로브를 1시간 동안 담가서 DNA 혼성화 과정이 일어나도록 하고 0.05 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 조심스럽게 세척하여 결합되지 않은 DNA를 제거했습니다. DPV 피크 전류를 기반으로 한 DNA 바이오센서 반응의 평가를 측정하고 대조군 신호로 cDNA와 반응하지 않은 DNA 전극에 의해 생성된 전류 반응과 비교하였다. 각각의 실험은 동일한 실험 조건에서 3회 수행되었다. 일반적인 t 테스트는 DNA 바이오센서 반응과 대조군의 반응 사이의 유의한 차이를 결정하는 데 사용되었습니다. V의 회복. 콜레라 J3324 및 V. 콜레라 1.0 × 10 −4 에서 UVC1324 DNA μg μL −1 , 1.0 × 10 −5 μg μL −1 및 1.0 × 10 −6 μg μL −1 그런 다음 제안된 PSA-AuNPs 기반 전기화학적 DNA 바이오센서를 사용하여 하이브리드화 버퍼에 스파이킹을 수행했습니다.
그림 2는 평균 입자 크기가 186.1 ± 4.6 nm인 카르복실화된 라텍스 구체의 SEM 현미경 사진을 보여줍니다. PSA 구체의 균일한 크기 분포는 라텍스 표면에 DNA 분자의 균질한 고정을 허용하여 DNA 바이오센서의 재현성 응답을 향상시킵니다. 주사전자현미경(SEM, LEO 1450VP)을 사용하여 라텍스 구체의 크기와 분포를 확인했습니다.
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10,000배율에서 합성된 PSA 라텍스 구체의 SEM 현미경 사진
수정된 SPE의 전기역학적 결과는 표 2에 정리되어 있습니다. 피크 전위 분리(ΔEp)는 시스템의 전자 전달 동역학을 나타냅니다. PSA-modified SPE(PSA-SPE)는 콜로이드성 공중합체 입자층의 느린 전하 이동 과정으로 인해 가장 높은 ΔEp 값을 보여 시스템이 준 가역적 상태로 이동하게 했습니다. 그러나 AuNPs가 PSA-SPE에 로드되었을 때 ΔEp의 감소는 전극 표면에서 전자 전달 속도의 개선을 의미합니다.
그림 3은 라텍스로 변형된 SPE에 대한 AQMS 산화 반응의 차동 펄스 전압전류 및 V의 순차 혼성화 반응을 보여줍니다. 콜레라 DNA 바이오센서. 라텍스로 변형된 미소구체만 포함하고 고정된 포획 DNA가 없는 전극(실험 (a) 및 (b))과 cDNA 및 보고된 프로브의 존재 하에 고정화된 포획 DNA 프로브로 변형된 전극 사이에서 상당한 DPV 피크 전류 차이가 관찰되었습니다(실험 (g) )). 이것은 아민화된 DNA 포획 프로브가 EDC/NHS 커플링 프로토콜을 통해 코팅된 카르복실화된 PSA 라텍스 구체에 성공적으로 고정되었음을 나타냅니다[33]. 실험(g)은 또한 ncDNA 및 보고된 리포터 프로브(실험(d)), 불일치 DNA 및 보고된 리포터 프로브(실험(e)) 및 보고된 프로브 없음(실험 (f)). 이는 실험(g)에서 입증된 바와 같이 DNA 바이오센서 표면에서 샌드위치 하이브리드화 반응을 통해 포획 및 리포터 프로브와 표적 DNA의 완전한 하이브리드화 때문입니다. 이것은 또한 보고된 프로브의 사용이 DNA 혼성화로부터의 신호를 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. 그럼에도 불구하고 보고된 프로브(실험 (f))를 통합하지 않고 표적 DNA의 존재에서 관찰된 혼성화로 인한 DPV 전류는 혼성화되지 않은 DNA(실험 (c), (d) 및 (e)).
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전극의 AQMS로부터의 차동 펄스 전압전류도 신호(a ) PSA-SPE, (b ) PSA-AuNPs-SPE, (c ) 프로브-PSA-AuNPs-SPE 캡처 및 (d 존재 시) ) ncDNA 및 리포터 프로브, (e ) 불일치 DNA 및 리포터 프로브, (f ) cDNA 단독 및 (g ) cDNA 및 리포터 프로브
DNA 혼성화 반응에 대한 DNA 프로브 농도의 효과는 AQMS 전기화학적 산화 반응을 통해 관찰되었다. 그림 4a는 PSA-AuNPs-SPE에 고정된 DNA 프로브 양이 1μM에서 4μM로 증가함에 따라 DNA 바이오센서 반응이 점진적으로 증가했음을 보여줍니다. 이것은 고정된 DNA 나선을 통해 전자 전달을 제공하기 위해 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 삽입된 전기 활성 AQMS의 양이 증가하기 때문입니다. DNA 바이오센서의 DPV 응답은 4~6μM DNA 프로브 사이에서 거의 안정 상태가 되는 것으로 관찰되었으며, 이는 전극 표면에 최적의 DNA 프로브 로딩이 달성되었음을 나타냅니다[34]. 따라서 후속 실험에서 최적의 DNA 프로브 로딩으로 4μM 캡처 프로브를 선택했습니다. AQMS 라벨의 농도도 0.1 ~ 5.0mM의 측정 전해질에서 최적화되었으며 1mM의 AQMS 농도는 최적의 DNA 삽입 반응에 충분한 것으로 밝혀졌습니다(그림 4b).
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캡처 프로브의 효과(a ) 및 AQMS 농도(b ) 0.05M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 5μM cDNA 및 신호 프로브로 수행된 DNA 바이오센서 반응
DNA 혼성화 반응의 속도는 용액 pH에 크게 의존합니다. 도 5a에서 볼 수 있는 바와 같이, 보다 산성인 환경에서 DNA의 phosphodieter backbone의 protonation은 DNA 분자의 용해도를 감소시켰고, 이는 결국 DNA hybridization 반응 속도를 감소시켰다. 반면 기본 배지에서는 DNA 염기쌍을 함께 유지하는 약한 수소 결합을 끊었습니다. 최적의 DNA 혼성화 반응은 표적 DNA와 혼성화하기 위해 더 많은 포획 프로브를 촉진하고 이후에 DNA 혼성화 인식을 비즈니스로 만들기 위해 AQMS 산화환원 프로브의 삽입을 허용하는 중성 조건에서 더 유리했습니다. 따라서, pH 7.0에서 0.05M 인산나트륨 완충액이 후속 DNA 바이오센서 연구를 위한 DNA 혼성화 매질로 사용되었습니다. Ca 2+ 와 같은 양전하 이온 , 나 + , K + 및 Fe 3+ 이온은 DNA의 음전하를 띤 포스포디에스테르 사슬과 상호작용할 수 있습니다. 이 이온 반응은 DNA 분자의 전하를 중화시켜 DNA 분자 사이의 입체 반발을 줄여 DNA 혼성화 반응을 용이하게 합니다. 그림 5b는 DNA 혼성화 반응에 대한 일부 양이온의 효과를 보여줍니다. DNA 혼성화 반응은 Na + 순으로 양전하를 띤 이온의 존재에서 증가하는 것으로 나타났습니다.> K + > Fe 3+ > Ca 2+ . 둘 다 2+ 및 Fe 3+ 이온은 Ca 2+ 의 이온 상호작용으로 인해 DNA 혼성화 반응을 상당히 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. 및 Fe 3+ 불용성 인산염 화합물의 형성으로 이어지는 완충 용액의 인산염 이온과 이온. 이것은 매질의 이온 함량을 감소시켜 DNA 분자 사이의 정전기 반발을 증가시킵니다. Na + 의 존재에서 가장 높은 DNA 혼성화 전류가 얻어졌습니다. 이온은 K + 에 비해 DNA 당-인산 백본에 대한 더 작은 크기와 더 강한 친화성으로 인한 것입니다. 음이온은 DNA의 음전하를 띤 인산기 사이의 입체 장애와 정전기적 반발을 극복하기 위한 것입니다.
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pH의 영향(a ) 다양한 양이온(b ), 완충액 농도(c ) 및 이온 강도(d ) 전기화학적 V의 DNA 혼성화 반응에 대하여. 콜레라 DNA 바이오센서. 5μM cDNA 및 리포터 프로브로 혼성화를 수행한 후 1mM AQMS로 삽입
또한 용액의 이온 강도는 DNA 바이오센서 반응에도 영향을 미칩니다. 그림 5c, d는 최적의 완충 용량을 나타내며, 이온 강도는 각각 pH 7.0으로 고정된 pH와 2.0 M의 NaCl로 고정된 인산나트륨 완충액 0.05 M을 사용하여 달성되었습니다. 이 조건에서 가장 높은 수준의 DNA 혼성화 반응을 선호했습니다. 따라서 높은 DPV 응답이 산출되었습니다. 용액의 최적 완충 용량과 이온 강도에서 DNA 분자 간의 정전기적 반발이 감소하여 DNA 혼성화 반응이 개선되었습니다. 대조적으로, 너무 낮거나 너무 높은 이온 함량이 사용되면 입체 장애와 정전기적 반발이 우세해지고 DNA 분자의 혼성화가 제한됩니다.
도 6a에 나타난 결과로부터, DNA 바이오센서 반응은 1.0 × 10 -21 에서 증가하는 cDNA 농도에 비례하여 증가하였다. ~ 1.0 × 10 −8 남 (R 2 =0.99) 1.0 × 10 −21 의 검출 한계 M. 검출한계는 검출한계에 근접한 반응곡선에서 바이오센서 반응의 표준편차를 선형보정기울기로 나눈 값의 3배를 기준으로 계산하였다. DNA 바이오센서의 넓은 선형 검출 범위는 DNA 고정을 위한 캐리어 매트릭스로 사용되는 서브마이크론 크기 범위의 고도로 단분산된 구형 PSA 라텍스 입자 때문입니다. 라텍스 입자 표면의 아크릴산이 풍부한 층은 DNA 수용 층에 의해 최대로 덮인 표면을 만들기 위해 DNA 포획 프로브의 부착을 위한 큰 결합 부위를 제공했습니다. 또한, PSA로 변형된 SPE에 AuNP를 통합하면 DNA 혼성화 반응의 분석 신호가 더욱 증폭되었으며, 이는 DNA 바이오센서의 높은 감도를 제공했습니다(그림 6b).
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Differential pulse voltammograms (a ) and DNA biosensor linear range (b ) obtained using various cDNA concentrations from 1.0 × 10 −15 to 1.0 × 10 −1 μM V. cholerae target DNA and 5 μM signal probe
It took about 8 h for the capture probe to be immobilised on the PSA copolymer particles surface, as illustrated by the DNA biosensor response in Fig. 7a, which showed a current increment from 1.0 to 8.0 h of capture probe immobilisation time, after which no obvious change in the DPV current was observed. Longer immobilisation time resulted in a higher amount of DNA probes immobilised onto the latex. After 8.0 h of exposure to the DNA probes, the hydrophilic functional latex with reactive carboxyl groups at the surface was presumably fully attached with the DNA probes. DNA hybridisation time, on the other hand, is the rate limiting step, which determines the response time of the DNA biosensor. Based on the DNA biosensor response trend in Fig. 7b, the response time of the V. cholerae DNA biosensor developed in this study was estimated to be about 60 min for the dual hybridisation processes to complete.
DNA probe immobilisation duration on the immobilised PSA latex colloidal particles (a ) and DNA hybridization duration of the DNA biosensor (b ) in 0.05 M potassium phosphate buffer at pH 7.0 containing 5 μM target DNA and reporter probe and 1 mM AQMS at 2.0 M ionic strength
Figure 8 shows the shelf life of the V. cholerae DNA biosensor. The DNA biosensor showed the highest response to the detection of 5 μM of V. cholerae cDNA for the first month of the experimental period. The electrochemical DNA biosensor was able to retain 95% of its initial DPV current after 58 days of storage period. The DNA hybridisation response was then gradually decreased to about 75% of its original response on the 75th day and exhibited 40% of its initial performance on the 100th operational day. The bioactivity of the immobilised capture probe was finally declined to 30% after 3 months of storage period. The reproducibility of each calibration point, which was repeated on five replicate DNA electrodes, gave satisfactory relative standard deviation (RSD) between 2.4 and 4.5% (n =5).
The life span profile of the fabricated V. cholerae DNA sensing electrode. The electrode was stored in 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) at 4 °C after every DPV measurement was taken
Regeneration of biosensor indicates whether the biosensor is reusable for a series of consecutive analyses. The regeneration method used in this study was conducted based on previously reported protocol in other studies [11, 21] with slight modifications. In this study, 0.1 M of NaOH solution was used as the regeneration solution to break the hydrogen bonds between base pairs of hybridised dsDNA. With the result from Fig. 9, it is notable that the DNA biosensor response declined significantly after incubation in 0.1 M of NaOH and the percentage of the DNA biosensor response reduced from 35.1 to 5.2% relative to the DNA biosensor initial response after incubation in 0.1 M of NaOH solution from 30 to 240 s. The DNA biosensor response decreased with the increasing incubation time signifies the hydrogen bonds between hybridised dsDNA were broken up by the alkaline regeneration solution. However, rehybridisation of the DNA biosensor was able to attain almost 100% of its initial response for a consecutive six DNA analyses with a reversibility RSD of 5%.
Repeatability of V. cholerae DNA biosensor using 0.1 M NaOH regeneration solution and rehybridization solution containing 5 μM cDNA and detection probe and 1 mM AQMS at 2.0 M ionic strength in 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0)
The optimised DNA biosensor has been applied to quantify the V. cholerae DNA extracted from various V. cholerae bacterial strains. Table 3 presents the results acquired from DNA tests carried out with the hybridisation medium spiked with different strains of V. cholerae DNAs and other bacterial species at a concentration within the calibration range of the DNA biosensor. The DNA biosensor showed superior selectivity towards V. cholerae J3324–I, V. cholerae J3324–II, and V. cholerae UVC1324 with high DPV current response and low current signals were obtained for the evaluation of both Citrobacter freundii (CF-I) and Citrobacter freundii (CF-II).
Recovery of V. cholerae J3324 and V. cholerae UVC1324 DNAs at three different concentrations spiked into the hybridisation buffer demonstrated 91.4 ± 2.2% to 108.9 ± 4.8% (n =3) of recoveries percentage (Table 4). This result suggests that the proposed PSA-AuNPs-based electrochemical DNA biosensor could be adopted for highly reliable and accurate detection of V. cholerae DNA in environmental and clinical samples.
Based on the data summarised in Table 5, the proposed electrochemical DNA biosensor based on PSA-AuNPs immobilisation material shows an exceptional broad linear quantification range compared to other planar two-dimensional electrodes as the DNA supporters. This clearly demonstrates the advantage of the micro-sized latex particles where the polymeric PSA is capable to intensify the probe binding capacity with a simple loading method via the classical EDC/NHS coupling compared to avidin-biotin technology [24, 26] and ultra-low detection limit in zeptomolar range with reasonable assay time.
This study reports the development of an electrochemical DNA biosensor for the detection of one of the most devastating high-risk V. cholerae pathogens. The PSA-AuNPs-modified DNA biosensor can be used for direct detection of DNA of interest from the extracted DNA without the need of amplification reaction via conventional PCR method, which is commonly used in those previously reported V. cholerae DNA biosensors. In addition, no further dilution of the extracted DNA is needed as the high-capacity AuNPs-doped latex microspheres-based DNA biosensor is highly sensitive for the quantitation of DNA at extremely low level in sub zeptomolar range. Therefore, the electrochemical DNA biosensor is greatly suitable as a surveillance and diagnostic tool to control the epidemic of the fatal intestinal infection.
나노물질
초록 본 논문에서는 전금속 메타물질 기반의 테라헤르츠(THz) 바이오센서를 이론적으로 조사하고 실험적으로 검증한다. 이 THz 메타물질 바이오센서는 레이저 드릴링 기술을 통해 제조된 스테인리스 스틸 소재를 사용합니다. 시뮬레이션 결과에 따르면 이 메타물질 센서의 최대 굴절률 감도와 성능 지수는 각각 294.95GHz/RIU 및 4.03입니다. 그런 다음 이 바이오센서의 유효성을 평가하기 위한 검출 물질로 소 혈청 알부민을 선택했습니다. 실험 결과에 따르면 감지 감도는 72.81GHz/(ng/mm2 ) 검출 한계는 0.035mg/m
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