노화 후 치과용 등급 나노 유리-지르코니아 재료의 생체 적합성

방법

시편 준비

Y-TZP는 이미 임상적용이 승인된 생체적합성 물질이며, 여기서는 Y-TZP 검체를 대조군으로 설정하였다. 모든 시편은 균일한 판(1.5 × 1.5 × 0.2cm)으로 제작되었습니다. ISO 13356은 단순화된 형상(굽힘 막대)과 광택 표면이 있는 시험된 시편의 평가를 설명합니다.

G/Z 시편 준비

나노 크기의 입자가 나노미터 그라인딩 기기(Emax, Retsch, Haan, North Rhine-Westphalia, Germany)로 얻어질 때까지 유리 분말을 밀링했습니다. 침투 유리의 주요 성분 및 백분율(> 1 wt%)은 표 1[4]에 나열되어 있습니다. 이트륨 안정화 지르코니아 분말(5.18wt% Y₂ O₃ , TZ-3Y-E 등급; Tosoh, Tokyo, Tokyo, Tokyo, Japan)을 150MPa의 일축 압력으로 2분 동안 압축한 다음 머플로에서 1350°C에서 2시간 동안 부분적으로 소결했습니다. 원하는 산화물을 200메시 분말로 볼 밀링했습니다. Y-TZP 기질 시편은 1200°C에서 2시간 동안 사전 소결되어 다공성 구조를 형성했습니다. 용융된 유리 슬러리를 사전 소결된 Y-TZP 다공성 기질 시편의 상단 표면에 적용했습니다. 그런 다음 코팅된 시편을 1350°C에서 2시간 동안 침투시켜 등급이 지정된 유리-지르코니아 구조를 생성했습니다. 유리침투와 치밀화가 동시에 이루어졌다.

Y-TZP 표본 준비

Y-TZP 블랭크(Weiland, Weiland Dental, Pforzheim, Baden-Württemberg, Germany)는 CAD/CAM 시스템(Zenostar, Weiland Dental, Pforzheim, Baden-Württemberg, Germany)을 사용하여 최대 밀도로 설계, 밀링 및 소결되었습니다.

세포 배양

인간 치은 섬유아세포(HGF)를 10% 소태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% l-글루타민 및 1% 비필수 아미노산을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Nutrient Mixture F-12)에서 배양하였다. 5% CO₂의 습한 대기 37°C에서 배지는 3일마다 변경되었습니다. PBS(phosphate-buffered saline)로 헹구어 배양 접시에서 세포를 제거하고 트립신-EDTA 용액에서 배양했습니다. 세포를 각 테스트 기질에 1 × 10 ⁵ 로 시딩했습니다. 모든 분석에 대해 동일한 배지에서 세포/mL.

노화

저작 조건을 자극하기 위해 37°C의 인공 타액에서 기계적 노화를 수행하고 2Hz 주파수에서 3점 굴곡 고정구를 사용하여 하중을 가했습니다. 사용된 노화 프로필:80N 부하 및 10 ⁵ 모든 표본에 대한 주기 [12, 13].

세포 생존력

노화되지 않은 G/Z 및 Y-TZP 노출 후 HGF의 생존 가능성은 alamarBlue ^® 를 사용하여 2, 24, 48, 72시간(노출 시간)에 결정되었습니다. DMEM에서 10% 용액으로 염 분석. 분석 테스트 전에 HGF에서 모든 표본을 제거한 다음 500μL의 alamarBlue ^® 염료를 첨가한 다음 4시간 동안 배양했습니다. 분취량(100μL)을 96웰 세포 배양 접시에 옮기고 Synergy™ H4 Microplate Spectrophotometer(BioTek, Winooski, Vermont, USA)를 사용하여 여기(530nm) 및 방출(580nm) 파장에서 형광 강도를 측정했습니다. 모든 실험은 3회에 걸쳐 3회 수행되었습니다. 세포 생존율은 다음과 같이 계산되었습니다:생존율(%) =(처리된 웰의 흡광도) / (대조군 웰의 흡광도).

산화 스트레스

노화 전후의 G/Z 및 Y-TZP 처리 HGF의 활성 산소종(ROS) 수준은 Reactive Oxygen Species Assay Kit(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Jiangsu)를 사용하여 화학 발광으로 확인되었습니다.

세포 접착

HGF는 노화 전후에 G/Z 및 Y-TZP 표본 표면에서 2시간 동안 배양되었습니다. 고정 후, 세포 핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) (Yeasen, Shanghai, Shanghai, Shanghai District, China)로 염색되었습니다. 반전된 LSM 510 형광 현미경(Carl Zeiss, Jena, Tuttlingen, Germany)으로 이미지를 얻었다. 부착된 세포는 무작위로 선택된 5개 섹션(450 μm × 450 μm)에서 × 200의 배율로 분석되었습니다. 세포 부착률은 부착된 세포의 수를 전체 접종된 세포의 수로 나눈 값으로 결정되었습니다.

세포 형태

HGF는 노화 전후에 노화되지 않은 노화된 G/Z 표본 표면에서 2시간 동안 배양되었습니다. 고정 후, 세포는 로다민 팔로이딘(PBS 중 3% BSA 중 1:100)을 사용하여 사상 액틴(F-액틴)에 대해 염색되었습니다. 반전된 LSM 510 형광 현미경(Carl Zeiss, Jena, Tuttlingen, Germany)으로 이미지를 얻었다. 세포 핵의 시각화를 위해 DAPI(Yeasen, Shanghai, Shanghai District, China)를 사용하여 샘플을 유리 커버슬립에 장착했습니다. 노화 전후의 G/Z 및 Y-TZP 표면의 세포 형태는 XL-30 ESEM(Philips, Eindhoven, North Brabant, The Netherlands)을 사용한 주사 전자 현미경(SEM)을 통해 관찰되었습니다.

구강 점막 자극 테스트

구강 점막 자극 테스트는 중화 인민 공화국의 YY/T 0127.13-2009 의학 표준에 따라 수행되었습니다. 10마리의 Wistar 수컷 마우스가 이 테스트를 위해 선택되었습니다. 노화된 G/Z 표본을 시험물질로 각 동물에 대해 하나의 볼 주머니에 넣고, 대조군으로 노화되지 않은 G/Z 표본을 반대쪽에 두었다. 2주 후에 동물을 희생시키고 디스크를 제거한 후 파우치를 육안으로 검사했습니다. 협측 점막의 조직학적 분석은 hematoxylin과 eosin으로 염색된 cryosection에서 추가로 수행되었습니다. 모든 거시적 및 미시적 관찰에 대한 평균 등급이 얻어졌습니다. 대조군 평균을 시험군 평균에서 빼서 자극 지수를 산출했습니다.

통계 분석

일원 분산 분석(ANOVA)은 개별 치과 표본(SPSS 22.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 평가를 위해 풀링된(모든 노출 시간) 세포 생존율, 산화 스트레스 및 세포 접착율 데이터에 사용되었습니다. ).

결과

등급 레이어 구조

차등층의 두께는 약 0.9~1.0mm로 제어되었습니다. G/Z 시스템의 구조 및 SEM 이미지는 그림 1a, b에 나와 있습니다. 그림 1a, b는 잔류 유리, 유리 코팅된 지르코니아 입자 및 입계 공극의 흔적으로 구성된 형태를 나타내며, 이는 코어-베니어 결합 강도를 높이는 데 이상적인 표면 형태를 생성합니다. 또한, 경사층의 EDS 분석은 그림 1c에 나와 있으며, 표면으로부터의 거리가 멀어질수록 Zr 원소의 함량이 증가하고 Si, Al 및 La 원소의 함량이 감소함을 보여줍니다. 자세한 내용은 이전 연구[4]에 설명되어 있습니다.

G/Z의 물리화학적 성질. 아 구조도. ㄴ SEM 이미지. ㄷ 기능 등급 레이어의 EDS 분석

세포 생존력

노화된 G/Z 및 Y-TZP 처리된 세포의 상당한 대사 감소가 72시간에 관찰되었습니다(P <0.00001) (그림 2a). 노화된 G/Z 처리된 세포의 유의한 대사 감소는 2시간에서 관찰되지 않았습니다(P =0.47), 24시간(P =0.82) 및 48시간(P) =0.53) (그림 2a). 2시간에 노화된 Y-TZP 처리된 세포에서 유의한 대사 감소가 관찰되지 않았습니다(P =0.82), 24시간(P =0.32) 및 48시간(P =0.54) (그림 2a). G/Z 표본은 2시간에서 Y-TZP와 비교하여 세포 생존율에서 유의한 차이를 나타내지 않았습니다(P =0.94), 24시간(P =0.86), 48시간(P =0.68) 및 72시간(P) =0.61) 노화 전 노출. G/Z 표본은 2시간에서 Y-TZP와 비교하여 세포 생존율에서 유의한 차이를 나타내지 않았습니다(P =0.98), 24시간(P =0.54), 48시간(P =0.73) 및 72시간(P =0.50) 노화 후 노출.

노화 전후의 G/Z와 Y-TZP의 생체적합성. 데이터는 평균 ± SD, n을 나타냅니다. =5. a 노화 및 노화되지 않은 표본 처리 HGF의 세포 생존율. ㄴ 노화 및 미 노화 표본 처리 HGF의 로스 생산. ㄷ 노화 및 노화되지 않은 표본 처리 HGF의 세포 접착율. 유의성 대 대조군: ^# 피 <0.01; ^* 피 <0.05

산화 스트레스

노화된 G/Z 및 Y-TZP 처리된 세포에 대한 산화 스트레스 데이터는 72시간에 상당한 증가를 보였습니다(P <0.00001, 그림 1b). 대조적으로, 노화된 G/Z 처리된 세포는 2시간에서 ROS 생산에 유의한 차이를 나타내지 않았습니다(P =0.91), 24시간(P =0.42) 및 48시간(P =0.62). 또한, 노화된 Y-TZP 처리된 세포는 2시간에 ROS 생산에 큰 차이를 나타내지 않았습니다(P =0.07), 24시간(P =0.40) 및 48시간(P =0.53). G/Z 표본은 2시간에서 Y-TZP와 비교하여 ROS 생산에 큰 차이를 나타내지 않았습니다(P =0.16), 24시간(P =0.79), 48시간(P =0.14) 및 72시간(P) =0.43) 노화 전 노출. G/Z 표본은 2시간에서 Y-TZP와 비교하여 ROS 생산에 큰 차이를 나타내지 않았습니다(P =0.27), 24시간(P =0.17), 48시간(P =0.07) 및 72시간(P =0.15) 노화 후 노출.

세포 접착

G/Z와 Y-TZP의 세포 접착율은 노화 후에 크게 증가했습니다(그림 2c). 노화되지 않은 G/Z와 Y-TZP의 세포 부착율은 유의한 차이가 없었습니다(P =0.71) (그림 2c). 노화된 G/Z와 Y-TZP의 세포 부착율은 유의한 차이가 없었습니다(P =0.71) (그림 2c). G/Z와 Y-TZP의 세포 부착율은 노화 후 유의한 차이를 보이지 않았다(P <0.00001) (그림 2c). 노화 전후의 Y-TZP 및 G/Z에 대한 세포 접착의 특성 사진은 그림 3a-d에 나와 있습니다.

노화 전후의 G/Z 및 Y-TZP에 대한 세포 접착. 아 오래된 G/Z. ㄴ 숙성되지 않은 G/Z. ㄷ 세 Y-TZP. d 숙성되지 않은 Y-TZP

세포 형태

다양한 배양 시간에서의 형광 이미지는 세포가 G/Z 표면에 부착되었음을 보여주었습니다. 그러나 세포가 평평하고 다각형 모양으로 잘 퍼진 노화된 G/Z 표면(그림 4a–c)에서 퍼짐이 더 컸습니다.

형광현미경으로 관찰한 노화 전후의 G/Z 상의 HGF의 부착, 퍼짐 및 형태. 아 , b 오래된 G/Z. ㄷ 숙성되지 않은 G/Z. 세포를 기질에서 72시간 동안 배양한 다음 고정하고 사상체 액틴(F-액틴, 빨간색) 및 핵(파란색)에 대해 염색했습니다.

SEM 이미지는 노화 및 노화되지 않은 G/Z 표면에서 배양된 세포가 확장 또는 연장된 몸체 및 수많은 미세 융모로 상당히 평평하다는 것을 보여주었습니다(그림 5a, b). 둥근 핵이 관찰되어 세포질의 확산이 표본 표면에 부착되어 있음을 확인할 수 있습니다(그림 5a).

배양 후 72시간 숙성 전후의 G/Z 상의 HGF 형태의 SEM 현미경 사진. 아 오래된 G/Z. ㄴ 숙성되지 않은 G/Z. 원래 배율:× 2000

구강 점막 자극 테스트

테스트 및 반대측 모두에 대한 거시적 관찰에 대한 점수는 0이었고, 결과적인 자극이 없음을 입증했습니다. 또한, 양쪽에 대한 현미경 평가 점수는 0으로 명백한 자극 반응이 없음을 나타냅니다. 그림 6a, b는 노화되지 않은 G/Z와 노화된 G/Z를 처리한 협측 점막에서 조직병리학적 변화가 관찰되지 않았음을 보여줍니다.

노화된 G/Z로 처리된 점막의 병리학적 검사(a ) 및 숙성되지 않은 G/Z(b )