노화 후 그레이디드 나노-글라스/지르코니아 치과 재료의 생체적합성

요약

나노-글라스를 나노-지르코니아 표면에 침투시켜 그레이디드 나노-글라스/지르코니아(G/Z) 시스템을 제작했으며, 이는 코어-베니어 결합 강도를 향상시킵니다. 이트륨 안정화 사방정계 지르코니아 다결정(Y-TZP)의 노화는 중요한 문제이므로, 임상 적용 전 노화가 G/Z 시스템의 생체적합성에 미치는 영향을 평가하는 것이 필수적입니다. 인간 치은 섬유아세포(HGF)를 미노화 및 노화된 G/Z와 Y-TZP 시편에 2-72시간 배양했습니다. 구강 점막 자극, 세포 생존율, 부착, 산화 스트레스 시험을 수행했습니다. 대사 활성은 노화된 G/Z와 Y-TZP에서 72시간에 유의하게 감소했습니다(P < 0.00001). 모든 시간점에서 노화 전후 G/Z와 Y-TZP 간 생존율 유의차는 없었습니다. 노화된 G/Z와 Y-TZP에서 72시간에 ROS 생성이 증가했으나 유의차는 없었습니다(P > 0.05). 노화 후 두 재료 모두 부착률이 상승했으나 G/Z와 Y-TZP 간 비교는 유의하지 않았습니다(P > 0.05). 노화 및 미노화 G/Z의 거시적, 미시적 자극 점수는 0으로 자극이 없음을 나타냅니다.

결론

G/Z 시스템은 우수한 생체적합성을 보이며 향후 임상 적용에 유망합니다.

배경

치과용 지르코니아 세라믹, 특히 3몰% 이트륨 안정화 사방정계 지르코니아 다결정(3Y-TZP)은 변형 강인화 메커니즘 덕분에 높은 강도와 파절 저항성으로 보철 장치에 널리 사용됩니다 [1]. 그러나 지르코니아 코어에 씌우는 베니어 도자기는 열팽창 계수와 탄성률 불일치로 인해 치핑이나 박리가 자주 발생합니다 [2, 3, 4]. 이를 해결하고자 우리는 이전에 소결된 나노-지르코니아 표면에 저탄성 나노-글라스를 침투시키는 그레이디드 나노-글라스/지르코니아(G/Z) 시스템을 도입했으며, 기존 시스템보다 3배 높은 결합 강도를 달성했습니다 [4].

Y-TZP의 노화는 습도, 기계적 하중, 저온에 의해 유발되며 표면 거칠기 증가, 미세 균열, 사방정계-단사정계(t-m) 상전이를 일으켜 기계적 특성을 저하시킬 수 있습니다 [5-9]. 표면 화학과 거칠기가 생체적합성에 영향을 주므로, 노화가 G/Z 시스템의 생체 조직 상호작용에 미치는 영향을 평가하는 것이 중요합니다.

Zhang 등은 글라스 침투 지르코니아 복합체의 기계적 이점을 입증했습니다 [10, 11], 그러나 이 그레이디드 복합체의 생체적합성, 특히 노화 후는 알려지지 않았습니다. 본 연구는 G/Z를 임상적으로 인정받은 Y-TZP와 비교해 세포 생존율, 형태, 부착, 산화 스트레스, 점막 자극을 노화 전후로 평가함으로써 이 공백을 메웁니다.

방법

시편 준비

임상 승인된 Y-TZP 시편을 대조군으로 사용했습니다. 모든 시편은 ISO 13356 표준에 따른 연마된 표면의 균일한 판(1.5 × 1.5 × 0.2 cm)입니다.

G/Z 시편 준비

글라스 분말을 Emax 그라인더로 나노미터 크기로 분쇄했습니다. 침투 글라스 조성은 표 1에 상세히 나와 있습니다 [4]. Y-지르코니아 분말(5.18 wt% Y₂O₃, TZ-3Y-E 등급, Tosoh)을 150 MPa로 2분간 일축 압축하고, 1350°C에서 2시간 부분 소결한 후 200-메시로 볼 밀링했습니다. 기판 시편을 1200°C에서 2시간 예비 소결해 다공성 네트워크를 형성했습니다. 녹인 글라스 슬러리를 상단 표면에 도포하고 1350°C에서 2시간 침투시켜 동시에 침투와 치밀화를 달성했습니다.

Y-TZP 시편 준비

Y-TZP 블랭크를 밀링하고 CAD/CAM 시스템(Zenostar, Weiland Dental)으로 완전 치밀화 소결했습니다.

세포 배양

HGF를 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 1% 비필수 아미노산을 첨가한 DMEM/F-12 배지에서 37°C, 5% CO₂ 조건으로 배양했습니다. 배지는 3일마다 교체했습니다. 세포를 PBS와 트립신-EDTA로 분리한 후, 모든 분석에 1 × 10⁵ cells/mL 밀도로 각 기판에 파종했습니다.

노화

기계적 노화는 씹는 조건을 모사했습니다: 시편을 37°C 인공 타액에 담그고, 80 N의 3점 굴곡 하중을 2 Hz로 10⁵ 사이클 가했습니다. 프로토콜 [12, 13]을 따랐습니다.

세포 생존율

2, 24, 48, 72시간에 알라마블루(alamarBlue®) 분석법(10% in DMEM)으로 생존율을 평가했습니다. 배양 후 500 µL 염료를 첨가하고 4시간 배양한 뒤 형광을 측정했습니다(여기 530 nm, 방출 580 nm, Synergy™ H4 마이크로플레이트 분광광도계, BioTek). 실험은 3회 반복으로 3중 수행했습니다. 생존율(%) = (처리 웰 흡광도) / (대조 웰 흡광도).

산화 스트레스

반응성 산소종(ROS) 수준을 화학발광법으로 정량화했습니다(Reactive Oxygen Species Assay Kit, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).

세포 부착

노화 전후 시편 표면에 HGF를 2시간 배양했습니다. 고정 후 핵을 DAPI(Yeasen)로 염색하고 Carl Zeiss LSM 510 역형 형광 현미경으로 촬영했습니다. 부착률은 ×200 배율에서 무작위 5개 시야(450 µm × 450 µm)에서 부착 세포 수/총 파종 세포 수로 계산했습니다.

세포 형태

2시간 배양 후 G/Z 표면의 세포를 고정하고 로다민 팔로이딘(1:100 in 3% BSA)으로 F-액틴을 염색했습니다. Zeiss LSM 510으로 촬영했습니다. 형태는 SEM(Philips XL-30 ESEM)으로도 관찰했습니다. 시편을 유리 커버슬립에 장착하고 DAPI로 대조 염색했습니다.

구강 점막 자극 시험

수컷 위스타 쥐 10마리에 한쪽 볼주머니에는 노화된 G/Z, 반대쪽에는 미노화 G/Z를 넣고 YY/T 0127.13-2009 표준을 따랐습니다. 2주 후 육안 검사하고, 볼 점막을 H&E 염색으로 조직학적으로 검사했습니다. 자극 지수는 대조군 점수를 시험군 점수에서 빼서 계산했습니다.

통계 분석

생존율, 산화 스트레스, 부착 데이터에 대해 일원 분산 분석(SPSS 22.0)을 수행했습니다. 유의 수준은 P < 0.05로 설정했습니다.

결과

그레이디드 층 구조

그레이디드 층 두께는 평균 0.9-1.0 mm였습니다. SEM 이미지(그림 1a, b)는 잔류 글라스, 글라스 코팅 지르코니아 입자, 입자간 보이드 등 강한 코어-베니어 부착을 돕는 표면 특징을 보여줍니다. EDS 매핑(그림 1c)은 Zr 농도가 깊어질수록 증가하고 Si, Al, La는 감소하는 기울기를 보여 의도된 조성 기울기를 확인합니다 [4].

G/Z의 물리화학적 특성. a 구조도. b SEM 이미지. c 기능적 그레이디드 층의 EDS 분석

세포 생존율

노화된 G/Z와 Y-TZP에서 72시간에 대사 활성이 유의하게 감소했습니다(P < 0.00001) (그림 2a). 2, 24, 48시간에는 유의한 감소가 없었습니다. G/Z와 Y-TZP 생존율은 모든 시간점에서 노화 전후 유의차 없었습니다(P > 0.05). 데이터는 그림 2a에 요약되어 있습니다.

노화 전후 G/Z와 Y-TZP의 생체적합성. 데이터는 평균 ± SD, n = 5. a 노화 및 미노화 시편 처리 HGF의 세포 생존율. b ROS 생성. c 세포 부착률. 대조군 대비 유의성: ^#P < 0.01; ^*P < 0.05

산화 스트레스

노화된 G/Z와 Y-TZP에서 72시간에 ROS가 유의하게 증가했습니다(P < 0.00001). 이전 시점에서는 유의차 없었습니다(P > 0.05). G/Z와 Y-TZP는 연구 전반에서 노화 전후 비교 가능한 ROS 수준을 보였습니다(P > 0.05).

세포 부착

노화 후 G/Z와 Y-TZP 모두 부착률이 증가했습니다(그림 2c). 두 재료 간 유의차는 노화 전후 모두 없었습니다(P > 0.05). Y-TZP와 G/Z의 노화 전후 세포 부착 대표 이미지는 그림 3에 나와 있습니다.

노화 전후 G/Z와 Y-TZP에 대한 세포 부착. a 노화 G/Z. b 미노화 G/Z. c 노화 Y-TZP. d 미노화 Y-TZP

세포 형태

형광 이미징 결과 세포가 노화 및 미노화 G/Z 모두에 부착했으며, 노화 표면에서 퍼짐과 평탄화가 향상되었습니다(그림 4a-c). SEM은 두 표면 모두에서 잘 퍼진 다각형 세포와 광범위한 미세융모를 확인했습니다(그림 5a, b).

노화 전후 G/Z에서 HGF의 부착, 퍼짐, 형태(형광 현미경). a, b 노화 G/Z. c 미노화 G/Z. 기판에 72시간 배양 후 필라멘터스 액틴(F-액틴, 빨강)과 핵(파랑) 염색

노화 전후 G/Z에서 72시간 배양 후 HGF 형태 SEM 사진. a 노화 G/Z. b 미노화 G/Z. 원배율: ×2000

구강 점막 자극 시험

노화 및 미노화 G/Z 모두 거시적, 미시적 자극 점수가 0으로 자극이 없었습니다. 조직병리학적으로도 점막 변화가 없었습니다(그림 6a, b).

노화 G/Z(a)와 미노화 G/Z(b) 처리 점막의 병리 검사

논의

금속-세라믹 합금은 금속 이온 방출 우려로 금속 없는 대안으로 대체되고 있습니다 [14-18]. 세라믹 개선 연구가 많지만, G/Z 시스템은 금속 성분 추가 없이 지르코니아 성능을 향상시킬 유망한 경로입니다. 본 연구는 G/Z가 노화 후에도 Y-TZP와 동등한 생체적합성을 유지함을 보여주며, 이는 실제 구강 조건을 모사합니다.

노화는 두 재료 모두에서 72시간 세포 증식을 감소시켰으며, 이는 노화 후 생체적합성 저하를 보고한 일부 문헌 [20]과 일치하고 개선을 보고한 다른 연구 [21]와 대조됩니다. 차이는 노화 프로토콜 차이에서 기인할 수 있습니다. 우리 프로토콜(80 N 하중, 2 Hz, 10⁵ 사이클, 37°C 인공 타액)은 임상 교합력과 온도를 반영해 노화 효과를 현실적으로 평가합니다 [22].

생존율 감소와 ROS 증가는 t-m 상전이로 인한 이온 확산과 국소 응력이 세포 무결성을 해칠 수 있음을 시사합니다 [6, 23].

흥미롭게도 노화는 두 재료 모두의 부착을 증가시켰으나 상대적 부착률은 변화시키지 않았습니다. 노화 후 거칠어지고 친수성이 된 표면이 단백질 흡착을 촉진해 세포 부착을 개선했을 것입니다 [27-29]. 비교 가능한 부착은 G/Z 표면 특성이 노화 후에도 유리하게 유지됨을 시사합니다.

인체 내 자극 시험에서 조직병리학적 변화가 없어 G/Z의 점막 접촉 안전성을 뒷받침합니다. 침투 중 도입된 소량의 단사정상은 기계적 무결성을 유지하면서 생체적합성을 보존하며, Al₂O₃ 침투 Y-TZP 선행 연구 [30]에서도 확인되었습니다.

다른 글라스-지르코니아 복합체도 체내외에서 좋은 생체적합성과 생체활성을 보였습니다 [31-33]. 우리 결과는 그레이디드 나노-글라스/지르코니아 시스템으로 이 증거를 확장하며, 기계적 강도, 심미성, 생물학적 안전성을 균형 잡은 재료를 제시합니다.

결론

세포 생존율, 부착, 형태, 산화 스트레스, 점막 자극 평가를 통해 G/Z가 노화 전후 Y-TZP와 동등한 생체적합성을 가짐을 입증했습니다. 이는 G/Z를 치과 보철물 유망 후보로 위치시킵니다. 추가적인 포괄적 체내외 연구로 이 예비 결과를 확증할 필요가 있습니다.

약어

DAPI:

4′,6-디아미디노-2-페닐인돌 이염산염

F-액틴:

필라멘터스 액틴

FGM:

HAp-Al₂O₃-ZrO₂

G/Z:

그레이디드 나노-글라스/지르코니아

SEM:

주사 전자 현미경

t-m:

사방정계에서 단사정계로

Y-TZP:

이트륨 안정화 사방정계 지르코니아 다결정