원자력 현미경 나노규모 기계적 매핑에 의한 대장균 유전형의 특징적인 거대분자 식별

결과 및 토론

다중 매핑에 의한 표면 미세구조

박테리아 샘플에서 10μm의 관찰 규모에서 AFM으로 스캔할 때 여러 개의 단일 E. 대장균 MG1655 세포를 볼 수 있으며 지형 이미지에서 3차원 세포 모양을 관찰할 수 있습니다(그림 1a). 편향오차영상(Fig. 1b)을 통해 2차원으로 보여지는 세포들의 명확한 윤곽을 알 수 있었고, 세균 세포 외에 여러 개의 세관을 발견할 수 있었다. 물결 모양의 필라멘트(그림 1c)는 다른 연구에서 보고된 미생물 편모의 출현과 일치하여 편모와 같은 소견을 확인하였으며, 더 짧고 털이 많은 섬모도 볼 수 있었다[11]. 단일 미생물 세포에 대한 상세한 연구를 위해 프로브의 관찰 면적을 줄였을 때, 지형은 그림 1d와 같이 세포 표면 사이의 수직 방향에 약간의 차이를 보였고, 편향 오차 이미지는 더 많은 형태학적 정보를 제공하는 반면, 수집된 환경 소음은 세포 표면의 미세 구조를 조사하기에는 너무 많았습니다(그림 1e). 시편의 동시 생체역학적 특성을 팁과 피검체 사이의 접촉 상태에서 측정한 결과, 접착력 매핑(adhesive force mapping)을 통해 알 수 있듯이 실제로 박테리아 표면은 특정 모양과 크기를 가진 엄청난 양의 거대분자로 구성되어 있음을 알 수 있었습니다. 그림 1f); 따라서 지형 및 편향 오류 이미지의 형태학적 해상도는 생체 역학 정보로 더욱 향상되었습니다.

E의 표면 미세구조 대장균 AFM 다중 매핑을 사용하는 MG1655. 아 그리고 b 지형 및 편향 오류 이미지 및 c 편모와 선모가 발현된 세균 세포의 상세한 편향 오차 영상이었다. 그런 다음 d에서 단일 셀에 초점을 맞췄습니다. 및 e 지형 및 편향 오류 이미지 및 f 해당 접착 매핑이었습니다. 눈금 막대 =1 μm in a 그리고 b , c에서 500nm , 200nm(d) –f

Fig. 2a에서 E에 의한 편모의 발현. 대장균 MG1655는 필라멘트의 크기가 그림 1b와 유사하고 접착 특성이 기판보다 상대적으로 낮은 곳에서 분명히 볼 수 있습니다. 또한, 박테리아 표면은 주변 매트릭스에 비해 접착력이 덜한 것을 특징으로 하는 원형 구성요소로 구성된 것으로 밝혀졌습니다. 이 관찰은 생쥐 피부의 조직층에 대한 우리의 이전 연구 결과와 유사하며, 반복적이고 유사한 입자는 거대분자로 간주되었으며, 그 구조는 분자간 영역에서 볼 수 있는 것보다 더 조밀하고 일관성이 있어 접착 성능의 차이가 쉽게 감지할 수 있다[12]. 그람음성균의 세포외피의 가장 바깥층은 그림 2b와 같이 자가조립 단백질층으로 표면층(S-layer) 단백질로 알려져 있다[13]. S층 구조는 전통적으로 전자 현미경으로 측정되었지만 진공 환경 및 전도성 코팅의 요구 사항은 단백질에 대한 기본 및 실시간 정보를 잃어버렸습니다. 일부 연구에서는 AFM 스캐닝을 위해 S층 단백질을 추출하고 운모 기질에 재조립했지만 S층 구조의 현장 및 실시간 성능에 대한 결과는 부족했습니다[14, 15]. 세포 구조와 전자현미경에 의한 미생물 표면의 일부 이전 이미지를 기반으로 우리는 관찰된 거대분자를 S-층 단백질로 간주했습니다[16].

E의 수직 및 표면 구조의 그림. 대장균 세포. 아 E의 표면 거대분자. 대장균 AFM 접착 매핑으로 이미지화한 MG1655 세포. ㄴ 세포질 막, 펩티도글리칸, 외막 및 S층으로 구성된 그람 음성 미생물의 세포 외피의 분자 구조. 눈금 막대 =200nm

AFM과 투과전자현미경(TEM) 측정을 비교하면 전자는 표본 준비가 간단하고 실험 요구 사항이 덜 제한되며 생물학적으로 친화적인 이미징 응용 프로그램과 같이 후자에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 생물학적 분야에서 TEM의 선택은 일반적으로 얻을 수 있는 초고해상도(일반적으로 나노미터 또는 서브나노미터) 이미징과 세포 간 소기관을 볼 수 있는 능력으로 인해 선택됩니다. 현재 작업에서 AFM 접착 매핑은 기능 해상도를 개선하고 팁 크기에 의존하지 않고 대신 샘플 자체의 고유 구조에 의존하는 방식으로 표면 거대분자의 배열을 제시했습니다. 또한, 이 접근 방식은 수십 마이크로미터 제곱 영역에 걸쳐 미생물 표면의 나노 스케일 분해능을 가능하게 합니다.

형태학적 특성의 게놈 조작 차이

E의 표면 미세구조를 관찰한 후. 대장균 MG1655 세포에서 관심 있는 한 가지 문제는 거대분자가 다른 균주에서 어떻게 배열되어 있는지입니다. 인간 병원체 E. 대장균 따라서 CFT073과 RS218은 동일한 실험 매개변수를 사용하여 AFM으로 검사했으며, 그림 3a-c에서 볼 수 있듯이 10μm의 특징 크기에서 이 세 가지 유전자형 사이에 세포 모양과 치수에는 큰 차이가 없었습니다. 접착력 매핑을 사용하여 S층 단백질을 식별했으며, 다양한 E 사이에서 다양한 모양과 크기의 이종 구조가 감지되었습니다. 대장균 그림 3d–f에 표시된 대로 변형 비교의 편의를 위해 E의 상세한 접착 매핑 이미지. 대장균 균주는 그림 3g-i에 표시되었습니다. 표면 거대분자는 MG1655 및 RS218 세포에서 둥근 모양을 갖는 것으로 특징지어졌으며, 38 ± 1.1 nm(n =80) MG1655 및 58 ± 2.7nm(n =46) RS218의 경우. 반면에 CFT073 세포는 66 ± 3.2nm(n =44). 다중 비교를 위해 이들 3가지 유전자형의 S층 단백질의 크기를 분석한 결과, 이들 균주 사이에 상당한 차이가 있음을 보여주었다(그림 4).

E의 형태학적 특성. 대장균 유전자형. 상단 행은 a의 편향 오류 이미지를 표시했습니다. MG1655, b CFT073 및 c RS218. 중간 행은 d에 접착 매핑으로 채색된 3D 지형을 보여줍니다. MG1655, e CFT073 및 f RS218 셀. 하단 행은 g에 대한 자세한 접착 매핑이었습니다. MG1655, h CFT073 및 i RS218. 접착 매핑에서 색이 짙을수록 접착 성능이 낮고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 스케일 바는 a의 경우 2μm였습니다. –ㄷ , d의 경우 200nm –f , g의 경우 100nm –나

E의 분자 크기. 대장균 유전자형. 표면 단백질의 직경은 AFM에 의해 검출되었고 다중 비교를 위해 일원 ANOVA를 통해 처리되었습니다. ****p <0.001 및 *p <0.05

미생물 S-층은 가혹한 환경, 식균 작용 및 포식 박테리아로부터 세포를 보호하는 것을 포함하는 많은 기능에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고됩니다. 또한, S층은 효과적인 집락화를 가능하게 하는 점착제 역할도 합니다[17]. S층 구조는 TEM에 의해 잘 연구되었으며 4-35nm 범위의 중심 간 공간을 가진 다양한 격자 유형으로 분류되었습니다[16]. AFM 결과와 문헌의 TEM 보고서 사이의 차이는 TEM이 S층 구조의 2D 형태를 제공하고 AFM이 세포 라디안 및 거칠기에 의해 기여되는 여러 영향을 포함하는 3D 지형을 캡처하는 다른 이미징 방법론으로 생각되었습니다. AFM 프로브의 기하학.

서로 다른 유형의 S-층 구조는 원래 박테리아 종을 구별하기 위해 다양한 분류학적 특성을 사용하는 것이 가능하다고 생각되었지만, 단일 종에 대해서도 미생물 얼룩이 다른 단백질 격자를 가질 수 있음이 발견되었습니다[13, 16, 18, 19]. 일부 연구에서는 필라멘트 형성에서 S-층의 역할, 세포막의 단백질 유형 및 E. 대장균 유전형에서 S층 단백질의 차이는 거의 언급되지 않았습니다[20,21,22]. 본 연구의 결과 E. 대장균 MG1655, CFT073 및 RS218에 따르면 표면 거대분자의 모양은 아마도 개별 E에 특이적일 수 있음을 시사합니다. 대장균 유전자형.