AFM 나노역학 매핑을 이용한 대장균 유전자형 특이적 거대분자 규명

초록

미생물 균주의 분류는 관례적으로 분자 생물학적 방법에 기반하며, 세균 균주의 형태학적 특성이 연구되는 경우는 드물다. 본 연구에서는 AFM 역학 매핑을 통해 세균 표면의 거대분자 구조를 규명하였다. 이 기술의 해상도는 나노미터 크기의 팁 크기뿐만 아니라 시편의 기계적 특성에 의해서도 결정된다. 이 기술은 간단한 시편 준비와 유연한 작업 환경으로 미생물 균주의 막 구조를 나노스케일에서 연구할 수 있게 하여, 전자 현미경과 표지 기반 생화학 분석법의 다양한 제약을 극복하였다. 세포 표면 사이에 위치한 특성 거대분자는 표면층 단백질로 간주되었으며, 대장균(Escherichia coli) 유전자형에 특이적인 것으로 밝혀졌다. 평균 분자 크기는 지름 38~66nm 범위였고, 분자 형태는 콩팥 모양 또는 원형이었다. 결론적으로, 표면 거대분자 구조는 대장균 유전자형과 연관된 고유한 특성을 가지며, 이는 유전체 효과가 세포 형태학에 미치는 영향을 AFM 역학 매핑으로 신속하게 식별할 수 있음을 시사한다.

배경

광학 현미경의 열악한 해상도와 전자 현미경의 제한된 작업 환경으로 인해, 미생물학 연구자들은 세균 세포의 외형을 이용하기보다 유전체 단편의 식별, 단백질 발현 등 분자적 또는 화학적 분석 방법을 채택해 왔다. 놀랍게도 이러한 방법들은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되는 단점이 있어, 더 직관적이고 효율적이며 유연한 접근법이 필요하다. 1982년 비니히(Binnig) 등에 의해 발명된 원자 힘 현미경(AFM)은 나노스케일 프로브를 레이저 빔으로 모니터링하여 시편 표면을 나노스코픽 또는 원자 해상도로 관찰하도록 설계되었다[1]. 물리적 프로브 팁으로 형태를 이미징하는 이 기술은 광학 및 전자 현미경의 해상도 한계와 환경 제약을 극복하며, 간단한 시편 준비, 대기 중 또는 유체 조건에서의 유연한 작업 환경 등 여러 장점을 가진다[2,3]. 그럼에도 불구하고 미생물 연구에서 AFM의 현재 응용은 주로 세균 세포의 정적 또는 동적 형태, 편모와 필라멘트의 발현을 정성적으로 이미징하는 데 국한되어 있으며[4-6], 미생물 세포의 표면 초미세 구조와 세포 특성의 정량적 분석에 초점을 맞춘 연구는 거의 없다.

본 연구에서는 대장균(E. coli) 세포의 표면 연구에 AFM을 선택하였고, 개별 세균의 형태와 치수를 AFM 위상 이미지와 위상 이미지로 관찰하였다. 또한, 동시 역학 매핑이 시편의 표면 성분에 대한 추가적인 생체역학적 정보를 드러냄을 발견하였다. 팁과 시편 간의 각 물리적 접촉 동안 거대분자와 주변 매트릭스 사이의 미세한 접착 특성 차이를 감지할 수 있었다. 이러한 첨단 기술을 미생물 분야에 적용하여, 하나의 실험실 균주와 두 개의 인간 병원성 균주를 포함한 세 가지 대장균 유전자형을 표면 거대분자 식별을 위해 조사하였다. 결과는 이 기술이 시편의 기계적 분포를 감지함으로써 AFM 팁의 스케일을 초과하는 이미지 해상도를 제공할 수 있음을 보여주었다. 결론적으로, 이러한 표면 과학의 발전은 미생물 분야 연구자들에게 세포 외형의 세부 사항을 제공할 뿐만 아니라, 다른 생체 또는 나노소재 시스템의 표면 특성에 대한 지식에도 기여할 것으로 제안한다.

방법

미생물 시료

본 연구에서 테스트한 세 가지 대장균 균주는 임상적으로 분리되어 국립 청쿵 대학교 분자 의학 연구소의 Ching-Hao Teng 교수 연구실에서 제공받았다. MG1655는 대장균 K-12의 장내 야생형 실험실 균주이며, 다른 두 균주는 인간 병원체이다: CFT073은 요로 감염의 주요 원인이고, RS218은 영아의 신생아 수막염과 관련된다[7].

기능화 기판

고체 표면과 미생물 세포 간의 공유 결합을 위해 두 단계의 표면 수정을 적용하였다. 먼저, 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES, Sigma-Aldrich) 용액을 사용하여 표면에 초기 NH₂ 기능화 층을 형성하였다. 안정한 APTES 코팅은 APTES가 제공하는 Si와 산화 표면의 O 사이의 안정한 Si-O 결합에 기인한다. 두 개의 COOH 관능기를 가진 글루타르알데히드는 한 COOH로 APTES의 NH₂ 관능기와 결합하고, 다른 COOH로 세균 표면의 NH₂와 작용한다.

세척된 기판을 5% 에탄올 중 APTES 용액에 1시간 담근 후 에탄올과 ddH₂O로 헹구었다. 슬라이드를 질소 스트림으로 건조한 후, 2% PBS 중 글루타르알데히드 용액에 하룻밤 담그고 PBS로 세척하였다.

시료 준비

리스테리아(LB) 한천 평판에서 대장균 균주의 단일 콜로니를 선별하여 LB 배지에서 배양하였다. 12시간 배양 후, 세균 용액을 신선한 평형 LB 배지에 1:100으로 희석하였다. 추가 12시간 배양 후, 1500×g(4000rpm)에서 3분간 원심 분리하고 LB 배지에 재현탁하는 과정을 두 번 반복하였다. 세균 용액 200µL를 기능화 기판에 떨어뜨리고 30분간 방치하였다. 시편을 증류수에 두 번 담가 부착되지 않은 세포를 제거하고 즉시 대기 중 AFM으로 이미징하였다.

AFM 특성 분석

AFM 장비(Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA)와 교정된 스프링 상수 0.7N/m, 팁 반경 10nm의 질화 실리콘 프로브를 사용하여 미생물 시편 표면을 조사하였다. AFM 스캔 속도와 라인 픽셀은 10µm 스캔 크기의 초기 지형 감지를 위해 0.5Hz와 256라인, 2µm 스캔 크기의 세부 관찰을 위해 0.3Hz와 512라인으로 설정하였다. PeakForce 정량적 나노역학(QNM) 모드를 사용하여 나노역학 매핑을 수행하였으며, 여기서 표면의 접착 특성은 인력-거리 곡선 중 최대 인력으로부터 계산되었다.

이전 연구에서 Streptococcus mutans의 세균 표면에서 2시간 동안의 기계적 진화를 지속적인 AFM 역학 매핑으로 모니터링하였고, 미생물 시료가 그 기간 동안 생존함을 검증하였다[8-10]. 본 연구에 사용된 대장균 시료의 생존력을 보장하기 위해 사전 연구를 수행하였으며, 4시간 동안 표면 접착력의 지속적인 변화는 시료 준비 후 최소 4시간 동안 세포가 생존함을 시사하였다(추가 파일 1 참조). 따라서 본 연구에서 테스트된 미생물 시료는 시편 준비 후 2시간 이내에 AFM으로 측정하였다. 모든 대장균 유전자형은 개별적으로 그리고 서로 다른 시간에 배양되었으며, AFM 측정은 시편 준비 직후 수행되었다. 즉, 세균 시료가 검사를 위해 대기하지 않았으므로, 보유 시간이 대장균 균주 간 차이에 미치는 영향을 최소화하였다. 본 연구에서 각 대장균 균주의 정량적 데이터는 2시간 이내에 수행된 측정에서 수집되었다.

통계 분석

Prism(GraphPad Software, USA)을 통계 분석에 사용하였다. 세포 길이와 거대분자 크기는 평균값과 표준 오차(SEM)로 제시하였다. 대장균 유전자형 간의 다중 비교는 일원 분산 분석(ANOVA)으로 처리하였다. 신뢰 수준 95%(p<0.05)를 선택하였고, 별표는 유의한 차이의 정도를 나타낸다. 각 균주의 표본 수 n은 >40이었다.

결과 및 논의

다중 매핑에 의한 표면 초미세 구조

10µm 관찰 스케일로 세균 시료를 AFM으로 스캔하면 여러 개의 단일 대장균 MG1655 세포를 볼 수 있으며, 위상 이미지(도 1a)에서 세포의 3차원 형태를 관찰할 수 있다. 편차 오차 이미지(도 1b)에서 세포의 명확한 2차원 윤곽을 얻었으며, 세균 세포 옆에 여러 개의 관 모양 구조를 발견할 수 있었다. 파동 모양의 필라멘트(도 1c)는 다른 연구에서 보고된 미생물 편모의 모습과 일치하여 편모임을 확인하였으며, 더 짧고 털 같은 필라(pili)도 관찰되었다[11]. 단일 미생물 세포의 세부 연구를 위해 프로브의 관찰 영역을 줄이면, 지형 이미지에서 세포 표면의 수직 방향에 약간의 차이가 있음을 볼 수 있다(도 1d). 편차 오차 이미지는 더 많은 형태학적 정보를 제공하는 듯하지만, 수집된 환경 잡음이 너무 많아 세포 표면의 초미세 구조를 조사하기 어렵다(도 1e). 팁과 시험 대상 간의 접촉 중 시편의 동시 생체역학적 특성을 측정하면, 세균 표면이 실제로 특정 모양과 크기를 가진 엄청난 양의 거대분자로 구성되어 있음을 접착력 매핑(도 1f)을 통해 알 수 있다. 따라서 지형 및 편차 오차 이미지의 형태학적 해상도가 생체역학적 정보로 더욱 향상되었다.

도 2a에서 대장균 MG1655의 편모 발현이 명확히 보이며, 필라멘트 크기는 도 1b의 것과 유사하고 접착 특성은 기판보다 상대적으로 낮다. 또한, 세균 표면이 주변 매트릭스에 비해 접착력이 낮은 원형 구성 요소로 구성되어 있음을 발견하였다. 이 관찰은 쥐 피부 조직층에 대한 이전 연구 결과와 유사하며, 반복적이고 비교 가능한 알갱이들은 거대분자로 간주되었는데, 그 구조가 분자간 영역에서 보이는 것보다 더 조밀하고 일관되어 접착 성능의 차이를 쉽게 감지할 수 있기 때문이다[12]. 그람 음성 세균의 세포 외피 최외층은 도 2b에 도시된 바와 같이 자가 조립 단백질 층으로, 표면층(S-layer) 단백질로 알려져 있다[13]. S-층 구조는 전통적으로 전자 현미경으로 측정되었으나, 진공 환경과 전도성 코팅 요구 사항으로 인해 단백질에 대한 고유하고 실시간 정보를 잃게 된다. 일부 연구자들은 S-층 단백질을 추출하여 운모 기판에 재조립한 후 AFM 스캔을 수행하였으나, 그 결과는 S-층 구조의 in situ 및 실시간 성능이 부족하였다[14,15]. 세포 구조와 전자 현미경에 의한 미생물 표면의 이전 이미지를 기반으로, 관찰된 거대분자를 S-층 단백질로 간주하였다[16].

AFM과 투과 전자 현미경(TEM) 측정을 비교하면, 전자는 후자에 비해 더 간단한 시편 준비, 덜 제한적인 실험 요구 사항, 더 생물학 친화적인 이미징 응용 등 여러 장점을 가진다. 생물학 분야에서 TEM이 일반적으로 선택되는 이유는 세포 내 소기관을 볼 수 있고 초고해상도(일반적으로 나노미터 또는 서브나노미터) 이미징을 얻을 수 있기 때문이다. 본 연구의 AFM 접착력 매핑은 특징 해상도를 개선하고, 팁 크기에 의존하지 않고 시편 자체의 고유 구조에 기반하여 표면 거대분자의 배열을 제시하였다. 게다가 이 접근법은 수십 마이크로미터 제곱 영역 범위에서 미생물 표면의 나노스케일 해상도를 가능하게 한다.

유전체 조작에 따른 형태학적 특성의 차이

대장균 MG1655 세포의 표면 초미세 구조를 관찰한 후, 다른 균주에서 거대분자가 어떻게 배열되는지에 대한 관심이 생겼다. 인간 병원체인 대장균 CFT073과 RS218을 동일한 실험 파라미터로 AFM으로 조사하였으며, 10µm 특징 크기에서 이 세 유전자형 간의 세포 형태와 치수에 유의미한 차이는 없었다(도 3a-c). 접착력 매핑을 사용하여 S-층 단백질을 식별하였고, 다른 대장균 균주 간에 다양한 모양과 크기의 상이한 구조가 감지되었다(도 3d-f). 비교를 용이하게 하기 위해 대장균 균주의 상세 접착력 매핑 이미지를 도 3g-i에 표시하였다. 표면 거대분자는 MG1655와 RS218 세포에서 원형으로 특성화되었으나, 분자 직경이 달랐다: MG1655는 38±1.1nm(n=80), RS218은 58±2.7nm(n=46). 반면, CFT073 세포는 독특한 S-층 단백질 형태를 가졌는데, 양 끝점 간 길이 차이가 66±3.2nm(n=44)인 콩팥 모양이었다. 이 세 유전자형의 S-층 단백질 크기를 다중 비교 분석한 결과, 이들 균주 간에 유의미한 차이가 있음을 보였다(도 4).

미생물 S-층은 세포를 가혹한 환경, 식균 작용, 포식성 세균으로부터 보호하는 등 중요한 역할을 수행한다고 보고된다. 또한 S-층은 효과적인 정착을 가능하게 하는 부착소(adhesin) 역할도 한다[17]. S-층 구조는 TEM으로 잘 연구되어 왔으며, 중심간 거리가 4-35nm 범위인 다양한 격자 유형으로 분류되어 왔다[16]. 우리의 AFM 결과와 문헌의 TEM 보고서 간의 차이는 다른 이미징 방법론 때문으로 생각된다: TEM은 S-층 구조의 2D 형태를 제공하는 반면, AFM은 세포 곡률과 거칠기, AFM 프로브의 기하학에 기여하는 다중 영향을 포함하는 3D 지형을 포착한다.

서로 다른 유형의 S-층 구조가 원래 다양한 분류학적 특성으로 세균 종을 구별하는 데 사용될 수 있다고 생각되었으나, 단일 종 내에서도 미생물 균주가 다른 단백질 격자를 가질 수 있음이 밝혀졌다[13,16,18,19]. 일부 연구가 S-층의 필라멘트 형성에서의 역할, 세포막 상의 단백질 유형, 대장균 유전자형 간의 크기 유전적 다양성을 조사하였음에도 불구하고, S-층 단백질의 차이는 거의 주목받지 못했다[20-22]. 현재 연구 결과는 대장균 MG1655, CFT073, RS218 간의 형태학적 특성 차이를 드러내며, 표면 거대분자의 외형이 개별 대장균 유전자형에 특이적일 가능성을 시사한다.

결론

본 연구에서는 AFM 역학 매핑을 통해 세균 표면에 대한 유전자형 특이적 나노구조 정보를 검출하였으며, 이는 거대분자와 주변 매트릭스 간의 접착 차이를 구분하였다. 미생물 세포의 표면 거대분자는 그람 음성 미생물의 분자 구조에 따라 표면층 단백질로 간주되었다. 이들 거대분자의 배열과 크기는 테스트된 대장균 유전자형에 특이적인 독특한 모양과 크기를 가지며, 이러한 차이가 통계 분석으로 유의미함이 입증되었다. 결론적으로, 세균 S-층 구조는 게놈 의존적이며 미생물 관련 질병 또는 미생물 균주의 신속한 진단을 위한 잠재적 방법이 될 수 있다고 생각한다. S-층 특성의 실제 적용을 위해 더 많은 세균 유전자형에 대한 조사가 필요하며 보완 카탈로그를 구축해야 한다. 현재 우리는 세균 형태학적 특성과 생리적/병리적 성능을 연결하는 데이터베이스를 구축 중이며, 이것이 AFM 검사의 실제 응용을 위한 유망한 진전이 될 것으로 믿는다.

약어

AFM

원자 힘 현미경(Atomic force microscope)

ANOVA

일원 분산 분석(One-way analysis of variance)

APTES

3-아미노프로필트리에톡시실란(3-Aminopropyltriethoxysilane)

LB

리스테리아 배지(Lysogeny broth)

QNM

정량적 나노역학(Quantitative nanomechanical)

S-layer

표면층(Surface layer)

TEM

투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy)