쥐의 복강 및 정맥 투여 경로에 의한 생합성 구리 및 산화아연 나노입자의 생체 내 비교 비교

결과 및 토론

Bio-CuNPs와 Bio-ZnONPs의 합성은 Enterococcus faecalis에 반응물을 노출시키는 동안 세포외 효소법에 의해 수행되었습니다. 상등액. Bio-CuNPs 및 Bio-ZnONPs의 FeSEM 분석은 분포에서 1~100nm 범위의 크기로 볼 수 있습니다(추가 파일 1). TEM 분석은 12~90nm 크기의 코어 쉘 형태와 16~96nm 범위의 CuNP[31] 및 ZnONP[32]에 대해 구형인 생합성 CuNP 및 ZnONP의 존재를 보고합니다(추가 파일 2).

수컷 wistar 쥐에 대한 Bio-Cu 및 ZnONP의 평가는 NP 처리 시 사망의 징후 없이 조사되었습니다. 또한, 처리 후 및 실험 기간이 끝날 때까지 9.5~11.5μg/kg 용량의 Bio-CuNPs를 i/v 투여한 후 백변의 빈번한 검사를 모니터링했습니다. 3주에서 4주 사이에 Bio-CuNPs로 처리된 쥐는 사료 섭취량이 크게 증가했으며 i/v에 대한 물 소비량은 9.5μg/kg(IC₅₀ ) 및 11.5μg/kg(TLC)인 반면, i/p 경로(용량 범위:24.8~30.3μg/kg) 및 대조군 래트의 경우 3주에서 4주 사이. i/v 및 i/후 래트의 체중 변화 Bio-CuNPs 및 Bio-ZnONPs의 투여는 표 3 및 4에 나와 있습니다. 체중의 감소 및 증가는 시험 시료의 독성을 평가하는 중요한 지표입니다[37]. 13.5nm 금[33] 및 100nm 은[38]에 대한 독성 연구에서 입증된 이전 보고서에 따르면 i/v 주사에 의한 체중에 대한 나노입자의 효과는 i/p 및 경구 투여보다 적습니다. Rhiouani et al.,에 따르면 모든 처리군에서 처리 4일 후 체중 감소가 적었다는 것은 동물에 대한 독성 물질의 부작용을 시사할 수 있습니다[39].

세 가지 다른 용량(NOAEC, IC₅₀)에서 Bio-ZnONP의 i/v 및 i/p 투여는 및 TLC) 체중은 대조군에 비해 투여 2주차까지 약간 감소하였다. 그러나 14일 후 체중이 회복되었습니다. i/p 투여의 경우, 총 치사 농도에서 Bio-ZnONPs(30.3 μg/kg)에 의해 체중 감소가 유도되었고 대조군보다 낮아 i/v 경로를 통한 i/p 경로를 통한 사소한 독성을 나타냅니다. (표 4, 그림 1a). 유사하게, i/v 경로를 통해 9.5μg/kg 및 11.7μg/kg 농도의 Bio-CuNP로 처리된 쥐는 체중이 약간 감소하는 것으로 나타났습니다. Bio-CuNPs로 14일 치료할 때까지 성장 및 체중 증가에 대한 부작용 징후는 관찰되지 않았습니다. 11.7μg/kg의 용량(i/v 경로)에서 28일 이내의 체중 변화를 표 3에 나타내었습니다. 처리 14일 후 대조군과 비교하여 i/v 경로를 통한 체중의 상당한 감소를 발견했습니다. 그룹. 따라서 이 경로를 통한 Bio-CuNP의 독성을 나타냅니다(그림 1b). i/p 경로 투여를 통해 Bio-CuNPs 처리된 쥐는 체중의 경미한 감소를 유도했으며 i/p 및 i/v 경로 모두에서 사망의 징후가 관찰되지 않았습니다. 따라서 i/p 주사는 더 낮은 독성을 유도했습니다(표 4 및 그림 1a 참조).

Bio-CuNPs 및 Bio-ZnONPs로 처리되지 않은 쥐(대조군)와 처리된 쥐의 체중 변화. 관찰 28일째까지 (A) 복강내(i/p) 및 (B) 정맥내(i/v) 투여 경로를 통해 처리된 Bio-CuNP 및 Bio-ZnONP. 총 치사 농도에서 Bio-CuNPs(Cu) 및 Bio-ZnONPs(ZnO)의 모든 처리는 투여되었고 28일 동안 관찰 상태로 유지되었습니다. 아니 =그룹당 쥐 6마리

혈액학 지수

RBC 수, WBC 수, 혈소판 수, 헤모글로빈 수준 및 혈액 응고 시간과 같은 혈액학적 매개변수의 추정은 처리된 NP의 독성을 측정하는 중요한 요소입니다. 14일과 28일에 농도 의존적 ​​혈액학 결과는 i/p 및 i/v 투여 경로에 대한 표 5 및 6에 나와 있습니다. 9.5μg/kg(IC₅₀)에서 Bio-CuNP의 투여량 ) 및 i/v 경로를 통한 11.7μg/kg(TLC)은 Bio-ZnONP와 대조적으로 감소된 RBC 수를 보여주었습니다. 그러나 농도 의존적 ​​경향은 관찰되지 않았다. i/v 투여 경로를 통해 Bio-ZnONP를 처리한 쥐의 경우 헤모글로빈 수치, 혈소판 수 및 백혈구는 변화했지만 세 가지 농도(NOAEC, IC₅₀ 및 TLC). 그러나 i/p 투여 경로의 경우 관찰 14일째에 대조군 및 Bio-2에 비해 적혈구수, 백혈구수, 헤모글로빈 수치 및 혈소판 수의 유의한 감소 및 변화가 관찰되었다(표 5). CuNPs 처리. 놀랍게도 혈액학적 효과는 28일째에 정상인 것으로 밝혀졌습니다(표 6).

14일과 28일 관찰일에 두 개의 서로 다른 Bio-NP에 대한 서로 다른 주사 방법(i/v, i/p)의 혈액학적 효과는 다양합니다. 헤모글로빈, 적혈구, 백혈구 및 혈소판은 Bio-CuNPs 처리에서 i/v 경로를 통해 감소하고 Bio-ZnONP 처리된 쥐에서 i/p 경로를 통해 감소하는 것을 관찰할 수 있습니다. 그러나 적혈구 수의 현저한 감소가 관찰되었습니다. 이는 Bio-CuNPs(i/v route)를 주사한 쥐를 제외하고 다른 주사 경로가 혈소판 수, 헤모글로빈 또는 백혈구에서 유의한 차이를 유도하지 않았음을 나타냅니다. 적혈구는 i/p 및 i/v 주사 후 상당한 차이를 보여줍니다(표 5 및 6 참조).

혈청의 생화학적 분석

혈청 크레아티닌은 폐기물입니다. 더 높은 크레아티닌 생산은 신장 손상을 나타냅니다. Bio-ZnONPs(i/v 경로:11-16μg/kg의 투여량, i/p 경로:24-30μg/kg의 투여량)는 14일 및 28일째의 대조군과 비교할 때 혈청 크레아티닌 수준에 유의한 영향을 미치지 않았습니다. (표 7 및 8, 그림 2a, b). Bio-CuNPs(i/v 경로:06-12μg/kg의 투여량)로 처리된 쥐는 대조군과 비교할 때 혈청 크레아티닌 수준이 2.3mg/dl로 증가하는 것으로 나타났습니다. 그러나 i/p 주입 경로는 큰 변화를 보이지 않았습니다(표 7 및 8). 혈청에는 많은 효소가 있지만 간의 정상 및 병리학적 증상을 평가하기 위해서는 알라닌 아미노전이효소(glutamate pyruvate transaminase)와 아스파르테이트 아미노전이효소(glutamate oxalate acetate transaminase)가 유용합니다. Aspartate transaminase는 간, 심장, 신장 및 골격근에 다량으로 존재하는 미토콘드리아 기원입니다. 혈청 알칼리성 인산분해효소는 저분자량의 글로불린 효소로 뼈, 간담도 및 신장에서 더 높은 농도로 발견됩니다. 이 효소의 활성은 글리세롤 포스페이트로부터 유리된 유기 포스페이트의 추정에 의해 결정될 수 있다. 효소의 혈청 수준은 간세포 및 폐쇄성 황달 모두에서 증가했습니다. i/v 투여 경로에서 Bio-ZnONP(40.7 mg/dl, 37.9 IU/L, 82.4 IU/L)는 대조군과 비교하여 혈청 ALT, 혈청 AST 및 ALP 수준에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다. i/p 투여는 14일 및 28일째에 대조군에 비해 ALT, AST 및 ALP 수준에서 유의한 증가를 나타내었지만(그림 2a 및 b). 혈청에 대한 독성 연구 결과 Bio-ZnONP는 28일까지 i/v 경로에 대한 크레아티닌, ALT, AST 및 ALP 수준에 변화가 없음을 보여주었습니다.

Bio-CuNP와 Bio-ZnONP를 처리한 쥐의 생화학적 결과. S. creatinine, ALT, AST 및 ALP 수준은 (A) 14일째 및 (B) 복강내(i/p) 및 정맥내(i/v) 투여 경로를 통해 Bio-CuNPs 및 Bio-ZnONPs로 처리된 쥐에서 측정되었습니다. 28일. 모든 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균의 평균 ± SD로 표시됩니다. 각각은 N 세 번 수행되었습니다. =그룹당 6 쥐. 참고:Cu:Bio-CuNPs, ZnO:Bio-ZnONPs, i/p:복강내, i/v:정맥내

대조적으로, i/v 경로를 통해 Bio-CuNP를 처리한 쥐는 혈청 ALT(67.7mg/dl), AST 수준(70IU/L) 및 ALP(128IU/L)에서 유의한 증가를 보였습니다. i/p 경로를 통한 Bio-CuNPs의 효과는 대조군에 비해 상당히 낮았습니다. 결과의 차이는 투여 경로, 나노 입자의 독성 및 투여 기간의 차이에 기인할 수 있습니다. 우리는 Bio-ZnONP가 Bio-CuNP와 비교하여 신장 및 간 기능 바이오마커(i/v 및 i/p 모두)에 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했습니다.

소기관 무게 감지 및 조직학적 연구

다양한 Bio-NPs 투여량에서 쥐의 장기 무게 변화는 장기에 대한 NP의 부작용을 보여줍니다. 표 9, 10과 같이 Bio-ZnONP를 처리한 쥐에서 심장, 간, 비장, 폐, 신장, 뇌의 무게가 감소함을 알 수 있다. 또한 장기 반응과 변화의 정도를 고려하였다. 장기 지수(O_X)를 계산하여 검사했습니다. ) 각 기관의 개별. 심장, 간, 비장, 폐, 신장, 뇌 및 흉선에 대한 기관 지수는 표 9 및 10에 나와 있습니다.

Bio-CuNPs와 Bio-ZnONPs 처리 쥐에서 i/v 및 i/p 투여 후 비장과 흉선의 무게 차이가 관찰되었습니다. 14일째에 Bio-ZnONP는 i/p 주사를 통해 비장 지수가 감소하고 i/v 투여에 의해 증가하는 것으로 나타났습니다(표 9). Bio-CuNPs의 경우 i/v 투여를 통해 처리된 쥐는 14일(0.265) 및 28일(0.49)에 비장 지수에서 유의한 감소를 보였습니다. 따라서 면역 체계는 i/v Bio-CuNPs 투여 및 i/p Bio-ZnONP 투여에 의해 영향을 받았습니다. i/p Bio-ZnONPs 투여의 경우 14일 이후에 쥐의 면역체계가 정상으로 회복되어 효과가 지속되지 않음을 입증하였다. 이전 체중 변화와 함께 Bio-CuNP의 i/v 투여 경로는 심장, 간, 폐, 신장 및 뇌에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보입니다. 또한 면역 체계를 손상시킬 수 있습니다. 그림 3a에서 비장과 흉선이 Bio-CuNPs의 주요 장기 표적임을 의미합니다.

소기관 형태의 변화. a 위치 비장, b 간, c 신장, d 뇌, 폐 및 f 28일째 관찰에서 대조군과 비교하여 정맥 경로를 통해 Bio-CuNPs로 처리된 수컷 Wistar 쥐의 심장

i/v 및 i/p Bio-CuNPs 처리 그룹의 경우 IC₅₀에서 장기 지수에 대한 명백한 효과가 관찰되었습니다. 및 TLC 용량. 또한, 두 가지 다른 투여 경로 중 복강 내 주사는 Bio-ZnONPs 처리 그룹에서 적당한 독성을 보여주고 Bio-CuNPs 처리 그룹에서 가장 높은 독성을 보여줍니다. i/p 주사에 의한 효율적인 약물 흡수는 쥐의 복막에 있는 조밀한 혈관과 림프로 인해 빠른 것으로 알려져 있다[40]. 이에 따라 정맥 주사는 Bio-ZnONP 처리군에서 독성이 가장 낮고 Bio-CuNPs 처리군에서 가장 높은 독성을 나타냅니다.

쥐의 독성 변화

우리는 Bio-NPs의 다양한 복용량과 시간 간격에서 독성의 영향을 조사하려고 했습니다. Bio-ZnONP로 처리된 조직(i/v 경로:투여량 범위 11-16μg/kg, i/p 경로:투여량 범위 24-30μg/kg)은 대조군 조직(그림 4, 5, 6, 7). 부검 관찰(부검:죽은 쥐의 해부 검사)은 Bio-NPs 처리된 쥐의 모든 기관이 처리되지 않은 동물의 모양을 기반으로 예상되는 해부학적 특징(예:색상, 모양 및 크기의 특성)을 나타내도록 지정했습니다. Bio-ZnONP와 비교하여 Bio-CuNPs 처리된 쥐는 대조군과 대조적으로 신장, 간, 비장 및 뇌 조직의 해부학적 특징에서 더 큰 변화를 보였습니다(그림 4, 5, 6, 7).

쥐 신장의 H&E 염색 섹션. i/v 및 i/p 경로를 통해 Bio-Cu 및 ZnONP로 처리된 쥐; 처리되지 않은 샘플을 대조군으로 간주했습니다. Bio-CuNP로 처리된 섹션은 14일(A–C) 및 28일(D–F)에 관찰되었습니다. 14일(G-I) 및 28일(J-L)에 Bio-ZnONP의 처리된 섹션. BC 보우만 캡슐, G 사구체, PT 근위 세뇨관, GN 사구체 괴사, PTD 근위 세뇨관 손상

쥐 비장의 H&E 염색 섹션. i/v 및 i/p 경로를 통해 Bio-Cu 및 ZnONP로 처리된 쥐; 처리되지 않은 샘플을 대조군으로 간주했습니다. Bio-CuNP로 처리된 섹션은 14일(A–C) 및 28일(D–F)에 관찰되었습니다. 14일(G-I) 및 28일(J-L)에 Bio-ZnONP의 처리된 섹션. WP 백색 펄프, RP 적색 펄프, 적색 펄프의 DRP 감소

쥐 간의 H&E 염색 섹션. i/v 및 i/p 경로를 통해 Bio-Cu 및 ZnONP로 처리된 쥐; 처리되지 않은 샘플을 대조군으로 간주했습니다. Bio-CuNP로 처리된 섹션은 14일(A–C) 및 28일(D–F)에 관찰되었습니다. 14일(G-I) 및 28일(J-L)에 Bio-ZnONP의 처리된 섹션. CV 중심 정맥, KC 쿠퍼 세포, CVV 중심 정맥 액포화(세포질 액포화), HH 간 출혈

쥐 뇌의 H&E 염색 섹션. i/v 및 i/p 경로를 통해 Bio-Cu 및 ZnONP로 처리된 쥐; 처리되지 않은 샘플을 대조군으로 간주했습니다. Bio-CuNP로 처리된 섹션은 14일(A–C) 및 28일(D–F)에 관찰되었습니다. 14일(G-I) 및 28일(J-L)에 Bio-ZnONP의 처리된 섹션. [모든 슬라이드는 배율 × 40, NIKON eclipse E200 (Trinacular microscope)에서 관찰됨]

Bio-CuNPs는 i/v 경로 투여를 통해 손상을 유도하고 조직에서 용량 의존적 경향을 보였다. TLC(11.7μg/kg) 농도에서 Bio-CuNPs는 Wistar 쥐의 간 및 신장 조직에 심각한 손상을 보였습니다. 또한 i/v 및 i/p 경로를 통해 처리된 Bio-CuNPs는 그룹 14일 및 28일째 쥐에서 사구체 세포(사구체 위축), 보우만 캡슐 및 근위 세뇨관의 괴사를 유도했습니다(그림 4b, e, c 및 f). ) 처리되지 않은 대조군과 비교할 때. 사구체 괴사는 면역학적 보상에 의한 것이지만, 세뇨관 손상은 대부분 나노입자의 독성 효과에 기인한다. i/v 및 i/p 경로를 통한 Bio-CuNPs의 독성 효과로 인한 세뇨관 손상도 사구체 압력을 증가시키고 사구체 위축을 유발합니다.

정상 대조군은 정상 간세포로 둘러싸인 중심정맥과 간소엽의 조직학적 구조가 정상이었다(Fig. 6). i/p 경로(19.82μg/kg)를 통해 처리된 Bio-CuNPs는 14일 및 28일 관찰 모두에서 Kupffer 세포 활성화를 포함한 가벼운 조직학적 변화를 보여주었습니다(그림 6b, e). i/v 경로를 통해 Bio-CuNPs로 처리된 쥐는 14일 관찰 동안 중심 정맥으로 둘러싸인 간세포의 세포질 공포화 및 간 출혈을 포함하여 심각한 변화를 보였습니다(그림 6c). 놀랍게도 28일째 그룹은 간세포의 지방 변화와 간세포 핵의 pyknosis를 포함하여 중간 정도의 변화를 보였다(Fig. 6f). i/p 경로 투여군 14일째에 Bio-ZnONP를 처리한 간 조직은 간세포의 지방 변화로 인해 중등도의 변화를 보였다(그림 6i). Bio-ZnONP의 처리군은 약간의 개선을 보였고, 14일째와 비교하여 28일째에 상당한 간 보호 활성이 관찰되었습니다(그림 6l). 14일째부터 Bio-ZnONP를 처리한 동물에서 간 구조가 정상으로 회복되었습니다.

i/v 경로를 통해 Bio-CuNPs로 처리한 쥐에서 추출한 비장 조직에서 비장 세포(적색 펄프)의 감소와 림프구(백색 펄프)의 증가가 관찰되었습니다(그림 5c, f). 1차 관찰에서 비장 내 Bio-CuNPs의 부착은 적색 펄프에서 관찰되었으며 세포 덩어리의 적당한 손실과 관련이 있었습니다. reduced cell mass was obvious on the 28th day time point when compared with 14th day of i/v administration (Fig. 5f), whereas minor changes were observed in red pulp depletion when rats were treated with Bio-CuNPs via i/p route on both 14th and 28th day time point. Structural changes were not seen in the white pulp or in splenic blood vessels (arteries or venous sinuses) and intravascular erythrocytes (Fig. 5b, e). No morphological changes have been found in spleen tissues treated with Bio-ZnONPs (Fig. 5). The H&E-stained brain sections of rats, treated (i/v and i/p) with NPs, showed no changes in brain region, olfactory bulb (perivascular localization) and the choroid plexus and ependyma of the lateral ventricles (Fig. 7).