GO-apt(graphene oxide-aptamer complex) 기반의 백혈병 검출을 위한 편리하고 저렴하며 고감도의 형광 앱타센서가 개발되었습니다. 산화 그래핀(GO)은 π에 의해 카르복시플루오레세인 표지 Sgc8 앱타머(FAM-apt)를 흡수할 수 있습니다. -π 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 통해 형광을 스태킹하고 소멸시킵니다. Sgc8 표적 세포 CCRF-CEM이 없으면 형광은 거의 모두 소멸됩니다. 반대로 CCRF-CEM 세포를 추가하면 소멸된 형광을 빠르고 크게 회복할 수 있습니다. 따라서 형광 신호의 변화를 기반으로 1 × 10 2 의 넓은 범위에서 CCRF-CEM 세포의 수를 감지할 수 있습니다. ~ 1 × 10 7 10cells/mL의 검출 한계(LOD)가 있는 cells/mL 따라서 그래핀 옥사이드 기반 형광 앱타센서의 이러한 전략은 암 탐지에 유망할 수 있습니다.
<섹션 데이터-제목="배경">백혈병은 공격적이고 흔한 악성 혈액 질환으로, 특히 어린이와 청소년의 생존과 건강에 위협이 됩니다[1, 2]. 이는 신체의 정상 조혈 세포뿐만 아니라 골수 및 면역 체계에도 영향을 미칩니다[3,4,5]. 따라서 백혈병의 치료와 환자의 삶의 질 향상을 위해서는 조기 진단이 필수적이다. 현재 일반적으로 사용되는 백혈병 진단 방법은 말초혈액 세포와 골수를 채취하는 것인데, 그 후 세포 형태, 세포화학[7,8,9], 면역표현형[10,11], 면역조직화학물질[10, 11] 등 다양한 분석[6]이 이루어지고 있다. [12, 13], 압타머 기반 유세포 분석 [14, 15]이 수행되었습니다. 이러한 방법은 백혈병 세포를 검출할 수 있지만, 여전히 고비용, 낮은 감도, 복잡하다는 단점이 있다. 따라서 저비용, 고감도, 간편한 백혈병 진단 방법을 찾는 것이 매우 시급합니다.
짧은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA인 앱타머는 지수 농축(SELEX)에 의한 리간드의 체계적인 진화의 시험관 내 스크리닝에 의해 스크리닝되었습니다[16, 17]. 특별한 3차 구조를 기반으로 하는 압타머는 작은 유기 분자, 단백질, 심지어 세포를 포함한 표적에 대해 강력한 결합 친화성과 높은 특이성을 가지고 있습니다[18,19,20]. 또한, 압타머는 합성 및 변형이 용이한 특성을 가지고 있어 암 검출 프로브로 널리 이용되고 있다[21]. 암 탐지를 위한 앱타머를 기반으로 하는 기능화된 나노물질도 최근 몇 년 동안 핫스팟(예:양자점 및 실리카 나노입자[24])입니다[22, 23].
그래핀 옥사이드(GO)는 새로운 2차원 평면 탄소 나노물질로서 우수한 수용해도[25], 큰 비표면적 및 우수한 형광 소광 능력[26, 27]과 같은 독특한 특성으로 인해 상당한 주목을 받아왔습니다. 이러한 특성에 기초하여, GO는 형광 공명 에너지 전달(FRET)에서 우수한 에너지 수용체로 간주되며, 이는 GO가 형광 앱타센서에서 폭넓은 응용 가능성을 갖게 한다[28]. 또한 GO는 π로 앱타머에 결합할 수 있습니다. -π 스태킹 상호작용은 있지만 이중 가닥 DNA 또는 앱타머-표적 복합체와는 그렇지 않습니다[19, 29, 30]. 따라서 그래핀 기반 압타머 센서는 자유 압타머 프로브에 비해 압타머의 안정성을 향상시킬 수 있다[31].
현재 많은 연구에서 그래핀 옥사이드 기반 형광 앱타센서의 탐지 대상 전략이 실현 가능하다고 보고했다[21, 32]. 그럼에도 불구하고 지금까지 백혈병 세포에 대한 GO 기반 앱타센서를 사용한 연구는 거의 없었다. 여기에서 우리는 GO 및 카르복시플루오레세인 표지 Sgc8 앱타머(FAM-apt)를 기반으로 하는 백혈병 세포의 신호 '켜기' 감지를 위한 새로운 전략을 설계했습니다. 형광 소광제와 표적 제제는 각각 GO와 앱타머를 사용하였다. 백혈병 세포가 없는 경우 GO는 FAM-apt와 상호 작용할 수 있으며 거의 모든 형광을 켄칭하고 검출 신호가 꺼집니다. 그러나 표적 세포가 존재하면 앱타머가 능동적으로 세포를 표적으로 삼아 GO에서 떨어져 검출 시스템에서 형광 회복을 일으키고 검출 신호가 켜진다. 따라서 형광 강도의 변화에 따라 표적 세포 농도를 상응하게 측정할 수 있습니다.
5'-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3' 서열을 갖는 FFAM-apt는 Sangon Biotech Co., Ltd.(중국 상하이)에 의해 합성되었습니다. 이 작업에서는 20mM Tris-HCl(pH 7.4), 5mM MgCl2을 포함한 자가 조절 Tris-HCl 완충액을 사용했습니다. 및 100mM NaCl. 이 실험에 사용된 압타머는 Tris-HCl 완충액으로 용해시켰다. 산화 그래핀 분말은 Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd.(중국 난징)에서 구입했습니다. 모든 용액은 Milli-Q 정제 시스템(Millipore, Bedford, MA, USA)에서 정제한 18MΩ의 초순수로 제조되었습니다.
CCRF-CEM(인간 급성 백혈병 림프모세포주), Ramos(인간 Burkitt 림프종 세포주), 293T(인간 배아 신장 세포주) 및 H22(쥐 간세포 암종 세포주) 세포주는 중국 Cell Bank에서 구입했습니다. 과학 아카데미 (상하이, 중국). 모든 세포주는 5% 이산화탄소 및 37°C에서 배양되었으며 1640의 배지에는 10% 소태아혈청(FBS; HyClone) 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA)이 포함되어 있습니다.
모든 형광 스펙트럼 및 형광 강도는 F-7000 형광 분광 광도계(Hitachi Company, Tokyo, Japan)로 측정 및 기록하였다. 700μL 석영 큐벳을 사용하여 샘플 용액을 고정했습니다. 카르복실플루오레세인(FAM)의 특징적인 피크 파장으로 인해 490nm에서 샘플을 여기시키고 518nm에서 방출을 측정하여 발광 강도를 모니터링했습니다.
모든 원자력 현미경(AFM) 이미징은 SPI3800N 현미경(Seiko Instruments Industry Co., Tokyo, Japan)으로 촬영했습니다.
GO, FAM-apt 및 산화 그래핀-압타머 복합체(GO-apt)의 제타 전위는 나노입자 크기, 제타 전위 및 절대 분자량 분석기(Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK)에 의해 결정되었습니다.
GO, FAM-apt 및 GO-apt의 UV-가시광 흡광도 스펙트럼은 NanoDrop 2000(Thermo, USA)에서 기록되었습니다.
산화그래핀 분말을 Milli-Q 정제수에 녹여 분산시킨 후 초음파로 분산시켜 1 mg/mL 농도의 균질한 흑색 용액을 얻었다. 20mM Tris-HCl 완충액으로 스톡 용액을 희석하여 20nM FAM-apt의 농도를 얻었습니다. 그 후, 1μL FAM-apt(10μM)와 10μL GO 용액(1mg/mL)을 준비하여 혼합한 다음 Tris-HCl 완충액으로 500μL로 희석했습니다.
CCRF-CEM 및 Ramos 세포를 6웰 플레이트에서 12시간 동안 배양했습니다(5 × 10 5 웰당 세포). 세포를 차가운 PBS(인산염 완충 식염수)로 2회 세척하고 GO-apt 용액과 함께 암실에서 4°C에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 세포를 3회 세척하고 4% 폴리옥시메틸렌으로 20분 동안 고정했습니다. 세포를 PBS로 다시 세척하고 암실에서 5분 동안 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디히드로클로라이드(DAPI; Life Co., USA)로 염색했습니다. 마지막으로 세포를 PBS로 3회 세척하고 형광현미경(Nikon DS-Ri1, Japan)으로 검사하였다.
CCRF-CEM 세포를 원심분리에 의해 수집하고 1mL의 PBS에 현탁했습니다. CCRF-CEM 세포의 다양한 농도(0 ~ 1.0 × 10 7 /mL)를 GO-apt 형광 앱타센서와 함께 4°C의 암실에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 배양 후 CCRF-CEM 세포는 560~500nm의 파장 범위에서 형광 분광법으로 감지되었습니다. 검출 한계(LOD)는 3σ을 기반으로 추정됩니다. / S 계산, 여기서 σ GO-apt 솔루션의 표준 편차입니다(n =10) 및 S 는 선형 방정식[33]의 기울기입니다.
GO 기반 형광 앱타센서의 특이성을 조사하기 위해 우리는 Ramos 세포, H22 세포 및 293T 세포를 포함한 여러 다른 세포로 시스템을 테스트했습니다. 각 100μL 반응 시스템에는 1 × 10 6 이 포함되었습니다. 세포.
각 실험은 세 번 반복되었습니다. 데이터는 소프트웨어 SigmaPlot 12.5에 의해 처리되었고, 통계 분석은 GraphPad Prism 6.02(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 모든 분석에서 유의미한 임계값은 P였습니다. <0.0001.
이 연구에서는 GO 및 FAM-apt를 사용하여 CCRF-CEM 세포를 감지하는 형광 앱타센서를 설계했습니다. CCRF-CEM 세포의 검출을 위한 형광 센서의 원리는 그림 1에 나와 있습니다. CCRF-CEM 세포가 없는 경우 FAM으로 변형된 앱타머는 π에 의해 GO 표면에 흡착됩니다. -π 스태킹. GO와 형광단은 에너지 전달에 너무 가깝기 때문에 소광제로서 GO는 FAM의 형광을 소광합니다. CCRF-CEM 세포가 있는 경우 GO-압타머의 약한 결합력으로 인해 앱타머가 GO 표면에서 떨어져 세포에 결합하여 형광 회복을 유발합니다. 따라서 FAM 형광 강도의 회복에 따라 CCRF-CEM 세포의 수를 상응하게 검출할 수 있습니다.
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CCRF-CEM 세포 검출을 위한 GO-apt 형광 앱타센서의 개략도
CCRF-CEM 세포의 존재 하에 GO의 형광을 켄칭하고 형광을 반환하는 이러한 연속 과정은 형광 분광 광도계로 관찰할 수 있습니다. GO-형광 앱타머를 기반으로 한 센싱의 전체 과정은 그림 2a에 나와 있습니다. 25nM Tris-HCl 완충액에서 FAM-apt의 형광 스펙트럼은 FAM의 존재 덕분에 강한 형광 강도를 나타냅니다(그림 2a, 곡선 a). 그러나 GO를 첨가하면 형광 강도가 현저히 감소하여(그림 2a, 곡선 b), GO와 앱타머가 서로 가까이 있고 함께 흡착될 때 GO가 형광을 효율적으로 소멸시킬 수 있음을 나타냅니다. 놀랍게도 5 × 10 6 일 때 CCRF-CEM 세포가 추가되었고, 소광된 형광은 시간이 지나면서 회복될 수 있었습니다(그림 2a, 곡선 c). 그럼에도 불구하고, GO 접합이 없는 FAM-apt의 형광 강도는 CCRF-CEM 세포가 추가되었을 때 뚜렷한 변화가 없었습니다(그림 2a, 곡선 d). CCRF-CEM은 비형광 셀입니다(그림 2a, 곡선 e). 따라서 형광 회복은 주로 그래핀 표면에서 앱타머가 해리되고 형광 그룹이 노출되기 때문입니다. 형광 소광 및 회복에 대한 이러한 실험은 CCRF-CEM-압타머 복합체(CEM-apt)가 FAM-apt가 GO에 의해 소광되는 것을 막을 수 있고 CEM이 GO보다 앱타머에 더 강한 결합 친화성을 갖는다는 것을 분명히 보여주었습니다. 단일 가닥 압타머와 CEM-압타머 복합체의 구조 차이 덕분에 GO 표면의 압타머는 CEM과 상호 작용한 다음 CEM-압타머 복합체로 변형될 수 있습니다. 이 현상은 또한 CEM-압타머 복합체의 압타머에 대한 결합이 GO보다 약하여 압타머가 GO 표면에서 떨어지도록 한다는 것을 분명히 나타낸다. FAM-apt는 GO 표면에서 멀리 떨어져 있고 에너지 전달 효율이 감소하기 때문에 형광이 복원됩니다. FAM으로 표지된 Sgc8 앱타머와 CCRF-CEM의 형광 방출 스펙트럼의 통계적 분석은 서로 다른 조건에서 수행되었습니다(그림 2b).
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CEM 세포의 Go-apt 검출 가능성. 아 다른 조건에서 FAM-apt 및 CCRF-CEM 세포의 형광 방출 스펙트럼:(a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM- apt + CCFF-CEM 및 (e) CCRF-CEM FAM-apt(20nM); GO(25μg/mL); CCRF-CEM(1 × 10 6 세포). 여기 490nm ㄴ 다른 조건에서 FAM-apt 및 CCRF-CEM의 형광 방출 스펙트럼의 통계 분석. NS는 중요하지 않습니다. ****피 <0.0001
디자인을 검증하기 위해 균일하고 분산된 GO를 얻었습니다. 그림 3a에서 두께 1.17nm의 GO 시트가 AFM에 의한 전형적인 2차원 외관을 가지고 있음을 알 수 있습니다. 그러나 1.94nm 두께의 GO-apt는 FAM-apt가 GO 표면에 성공적으로 흡수되었음을 보여주었습니다. FAM-apt 및 GO의 제타 전위는 각각 - 11.35 및 - 23.90mV였으나 GO가 FAM-apt와 비공유적으로 상호작용할 때 제타 전위의 절대값이 증가했습니다(그림 3b). 이러한 결과는 앱타센서가 성공적으로 구축되었음을 나타냅니다. 그림 3c에서 GO가 π에 기인하는 234nm에서 강한 흡수를 나타냄을 알 수 있습니다. -π * 방향족 C=C 결합의 전이. FAM-apt는 DNA 서열(260nm)과 FAM(503nm)의 흡수 밴드가 특징인 반면, FAM-apt 용액에 GO를 추가하면 적색 편이가 발생하고 503nm에서 FAM의 흡광도가 증가합니다. 가능한 이유는 FAM-apt가 GO 표면에 흡착되어 두 π 사이의 전자 상호 작용을 나타냅니다. GO 시스템과 바닥 상태의 염료. 따라서 결과는 GO-apt가 성공적으로 구축되었음을 나타냅니다.
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GO-apt의 특성화. 아 GO 및 CEM-apt의 AFM 이미지. ㄴ FAM-apt, GO 및 CEM-apt의 표면 제타 전위. 오차 막대는 ± SD를 나타냅니다(n =3). ㄷ (a) GO, (b) FAM-apt 및 (c) GO-apt의 UV 가시광선 흡광도 스펙트럼
세포 수준에서 떨어진 FAM-apt 결합의 특이성을 직접 시각화하기 위해 CCRF-CEM 및 Ramos 세포를 Go-apt와 함께 배양한 다음 형광 현미경을 사용하여 분석했습니다. 형광 스펙트럼 실험과 일치하게 FAM-apt는 Go-apt에서 떨어져 형광 염색을 위해 CCRF-CEM 세포에 결합할 수 있지만 Ramos 세포에는 결합하지 않습니다(그림 4).
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GO-apt와 혼합한 후 CCRF-CEM 및 Ramos 세포의 형광 현미경 사진. 핵은 DAPI로 염색되었습니다. 눈금 막대는 25μm
를 나타냅니다.형광 앱타센서의 우수한 성능을 얻기 위해 형광 소광 및 회복 시간을 최적화하였다. FAM-apt 및 GO의 동역학 거동은 CCRF-CEM 세포가 있는 균질한 GO 용액에서 FAM-apt와 함께 형광 강도를 소광 및 회복 시간의 함수로 모니터링하여 조사했습니다(그림 5a, b). 도 5a에 도시된 바와 같이, GO 존재하에서 배양 시간의 함수로서 FAM-apt의 형광 소광을 관찰할 수 있다. FAM-apt는 GO의 표면에 빠르게 흡착한 후 에너지 전달을 거치며 동시에 형광 강도가 현저히 감소하고 2분 후에 느려지는 경향이 있습니다. 대조적으로, CEM-apt가 형성되고 GO 표면으로부터의 방출은 더 느립니다. 인큐베이션 시간이 30분 이상일 때 형광 강도가 플랫폼에 도달했습니다(그림 5b). 이러한 시간 의존적 실험은 우수한 소광제로서 GO가 FAM-apt 형광을 빠르게 소광시키고 CEM 존재하에서 점차적으로 형광을 회복한다는 것을 보여줍니다.
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실험 조건의 최적화. 아 시간의 함수로 GO에 의한 Tris-HCl 완충액에서 FAM-apt(20nM)의 형광 소광. ㄴ CCRF-CEM에 의한 GO 용액에서 FAM-apt의 형광 복원(1 × 10 6 ) 시간의 함수로. ㄷ 1 × 10 6 의 부재(곡선 a) 및 존재(곡선 b)에서 FAM-apt의 형광 강도에 대한 GO 농도의 영향 CCRF-CEM 세포. d 형광 강도 비율(F /F 0 ) FAM-apt의 1 × 10 6 GO 농도의 함수로서의 CCRF-CEM 세포. 여기 490nm
형광 앱타센서를 CCRF-CEM의 검출에 더 민감하게 만들기 위해서는 GO 농도를 최적화하는 데 사용되는 반응 시스템이 필수적이 됩니다. 우리의 전략을 명확하게 보여주는 그림 5c는 CCRF의 부재(그림 5c, 곡선 a)와 존재(그림 5c, 곡선 b)에서 FAM-apt의 형광 강도에 대한 다양한 GO 농도의 영향을 보여줍니다. -CEM. 그림 5c에서 볼 수 있듯이 GO를 추가하면 형광 신호 배경이 크게 감소합니다. 그림 5d는 FAM-apt의 복원된 형광을 1 × 10 6 으로 보여줍니다. GO 농도의 함수로서의 CEM 세포. 그림 5d에서 GO 농도가 20μg/mL일 때 F의 비율이 /F 0 (여기서 F 0 및 F CCRF-CEM의 부재 및 존재에서 각각 518nm에서 FAM의 형광 강도)는 13.0354인 가장 높은 값을 얻습니다. 따라서 20μg/mL가 최적의 GO 농도로 간주되었습니다.
좋은 실험 결과를 얻기 위해 최적의 실험 조건을 사용하여 CCRF-CEM을 검출했습니다. 그림 6a는 CCRF-CEM의 수가 0에서 1 × 10 7 으로 증가함에 따라 , 형광 강도도 그에 따라 증가합니다. 또한 F /F 0 1 × 10 2 범위에서 CCRF-CEM의 수에 대한 명확한 선형 의존성을 보여줍니다. –1 × 10 7 (그림 6b). 선형 회귀 방정식은 Y입니다. (F /F 0 ) =3.2608 × log C − 5.1892(여기서 C 회귀 계수가 R인 CCRF-CEM의 수입니다. 2 =0.9922. 검출한계는 10셀 미만으로 간주한다. 따라서 GO 기반 형광 압타머 센싱은 검출 범위가 넓어 CCRF-CEM 검출에 이상적인 바이오센서로 사용될 수 있다. 이 방법은 다른 방법에 비해 민감도가 높습니다(표 1)[34,35,36,37,38,39].
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CEM 세포의 Go-apt 검출. 아 CCRF-CEM 세포의 농도가 다른 GO-apt 형광 앱타센서의 형광 방출 스펙트럼. ㄴ 형광 강도 비율(F /F 0 ) 및 CCRF-CEM 세포의 농도
GO-apt 형광 어댑터의 특이성을 조사하기 위해 Ramos 세포, H22 세포 및 293T 세포와 같은 여러 다른 세포를 사용하여 시스템을 테스트했습니다. 각 100μL 반응 시스템에는 1 × 10 6 이 포함되었습니다. 세포. 그림 7은 CCRF-CEM이 다른 대조군보다 형광 강도가 더 높음을 보여줍니다. 결과는 또한 설계된 형광 앱타센서가 고도로 특이적이라는 것을 분명히 보여주었습니다.
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CEM용 형광 앱타센서의 특이성. 형광 강도 비율(F /F 0 ) CEM 세포, Ramos 세포, H22 세포 및 293T 세포의 존재 하에서 각각 GO-apt 형광 앱타센서의 (1 × 10 6 ), 여기서 F 0 및 F 는 518nm에서 검출 세포가 있거나 없을 때의 형광 강도입니다. 여기 490nm
CCRF-CEM 세포의 검출을 위한 편리하고 저렴한 고감도 형광 앱타센서를 개발했습니다. 이 전략은 π에 의한 비공유 결합 상호작용을 영리하게 사용합니다. -π 그래핀과 단일 가닥 DNA 사이의 적층 및 우수한 그래핀 소광 형광 성능. 압타머에 비해 GO에 대한 CEM-압타머 복합체의 결합이 약하기 때문에 그래핀에 의해 소광된 형광이 점차 회복될 수 있다. 최적화된 조건에서 감지 한계는 100개 미만의 셀로 간주됩니다. 따라서 형광 앱타센서는 우수한 성능을 바탕으로 종양 세포 검출 분야에서 폭넓은 전망을 가지고 있습니다.
원자력 현미경
CCRF-CEM-압타머 복합체
FAM 라벨 Sgc8 앱타머
형광 공명 에너지 전달
산화 그래핀
그래핀 옥사이드-압타머 복합체
인산염 완충 식염수
나노물질
초록 파킨슨병(PD)은 중뇌에서 도파민성 뉴런의 점진적인 소실을 특징으로 하며, 줄기 세포 이식 방법은 치료를 위한 유망한 전략을 제공합니다. 이러한 연구에서 생체 내 이식된 세포의 생물학적 행동을 추적하는 것은 줄기 세포 기능에 대한 기본 이해와 임상 효과 평가에 필수적입니다. 본 연구에서 우리는 열분해 방법과 2단계 개질을 통해 폴리아크릴산(PAA)과 메톡시폴리에틸렌글리콜아민(PEG)으로 코팅된 새로운 초소형 초상자성 산화철 나노입자를 개발했습니다. USPIO-PAA/PEG NP는 TEM 및 FTIR에서 볼 수 있듯이 10.0
로봇 용접 셀을 사용할 수 있는 산업에 대해 생각할 때 자동차 또는 전자 산업, 심지어 항공 우주 산업을 고려할 수 있습니다. 그러나 그들의 첫 번째 생각이 의료 산업이 될 것인지는 의심스럽습니다. 그것은 잘못된 것입니다. 의료 산업은 수년간 로봇 공학을 사용하여 제품을 제조해 왔으며 이러한 응용 분야에는 용접이 포함됩니다. 의료 제품 제조업체인 Midmark Corporation은 2005년부터 Motoman 용접 셀을 로봇 용접기 및 로봇 포지셔너와 통합한 이후 시설에서 용접 셀 자동화를 도입했습니다. 용접 셀은 진찰대 캐비
