새로운 톨 유사 수용체 9(TLR9) 작용제로서 합성 비메틸화 시토신-포스페이트-구아닌(CpG) 올리고데옥시뉴클레오티드는 Th1 면역 반응을 자극할 수 있으며 잠재적으로 암 치료를 위한 치료제 또는 백신 보조제로 사용될 수 있습니다. 그러나 CpG의 몇 가지 단점은 뉴클레아제 매개 분해에 의한 빠른 제거 및 불량한 세포 흡수와 같은 적용을 제한합니다. 따라서 치료를 위해서는 반복적인 고용량 약물 투여가 필요하다. 이 연구에서 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)-변성 Fe3를 기반으로 하는 CpG 전달 시스템 O4 나노 입자(FeNP)는 CpG의 더 나은 생체 활성을 달성하기 위해 처음으로 설계 및 연구되었습니다. 결과에서 우리는 CpG를 FeNP에 로딩하여 평균 크기가 약 50nm인 FeNP 전달 CpG 입자(FeNP/CpG)를 설계했습니다. FeNP/CpG 입자 전달 시스템은 시험관 내 및 종양 내 주사를 통해 골수 유래 수지상 세포(BMDC)에서 CpG의 세포 흡수를 강화하여 C26 결장암 및 4T1 유방에서 더 나은 체액 및 세포 면역 반응을 자극함으로써 상당한 항종양 능력을 보여주었습니다. 유리 CpG에 비해 생체 내 암 이종이식 모델. 더욱이, FeNP/CpG 입자로 처리된 마우스는 94.4%의 높은 억제율로 종양 성장을 지연시켰다. 또한, C26 모델에서 종양의 약 50%가 완전히 퇴행하는 것으로 나타났습니다. 유사하게, 처리되지 않은 대조군보다 4T1 유방암 종양 모델에서 폐 전이가 더 낮았고 종양 억제율이 69%였다. FeNP/CpG 입자의 효과 외에도 쉬운 준비, 안전성 및 높은 안정성으로 인해 매력적인 항종양 면역요법이 됩니다.
<섹션 데이터-제목="배경">악성종양은 인간의 건강과 생명을 위협하는 주요 질환 중 하나로 종양 발생률이 지속적으로 증가하고 있다[1, 2]. 불행히도, 악성 종양에 대한 방사선 요법, 화학 요법 및 수술과 같은 전통적인 치료법의 결과는 그다지 효과적이지 않았습니다. 빠르게 증식하는 세포를 사멸시키는 화학 요법 및 방사선 요법과 달리 면역 요법은 종양 세포를 표적으로 삼고 제거하기 위해 숙주 자신의 면역 방어 시스템을 강화하도록 설계되었습니다.
면역 요법 CpG가 종양 예방 및 퇴행에 대한 효능에 대해 광범위하게 연구되었다는 점은 주목할 만합니다[3]. 고무적인 임상 데이터에도 불구하고 free CpG의 사용은 여전히 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, CpG는 생물학적 조건에서 뉴클레아제 매개 분해에 취약합니다. 둘째, 전신 투여 후 표적 세포에 대한 특이성이 부족하고 세포 흡수가 불량하다. 따라서 개선이 필요할 것으로 보입니다. TLR9가 엔도솜에 위치하기 때문에 우리는 종양 관련 염증 세포에 의한 CpG 흡수 불량이 약한 임상 반응을 유발한다고 가정했습니다. 따라서 CpG 내재화를 강화하는 방법은 면역 자극 반응을 강화할 수 있습니다.
유리 CpG의 단점을 제외하고 CpG의 투여 경로는 항종양 능력과 독성에 영향을 미칩니다. 정맥 주사에 의해 투여되는 유리 CpG 및 기타 안정한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 빠르게 제거되고 광범위한 조직 분포를 갖는다[4, 5]. 또한, 전신 투여된 유리 CpG는 비특이적 면역 활성화를 유도하여 면역 세포 소진, 림프 여포 파괴, 간 손상, 자가 면역 질환 악화 등의 심각한 부작용을 유발할 수 있다[6,7,8]. 이러한 특성은 인간 환자에서 전신적으로 투여된 유리 CpG의 실패를 설명할 수 있습니다[9]. 이전 연구에서는 CpG의 종양 내 주사가 종양 부위에 면역 자극을 "집중"함으로써 뛰어난 항종양 효과가 있음을 입증했습니다[10]. 종양에 주입된 CpG의 머무름 시간을 어떻게 조절하느냐가 문제입니다.
toll-like receptor-9를 이용하여 수지상 세포, 대식세포, NK 세포가 세균 DNA에서 흔히 볼 수 있는 CpG를 인식할 수 있다[11]. CpG는 면역 세포가 케모카인과 사이토카인을 생성하도록 유도하고, T 세포의 공동자극 세포 표면 분자를 상향조절한다[12,13,14,15]. 따라서 CpG는 강력한 유형 1-편광 보조제로 등장했습니다[16, 17]. 또한, CpG를 종양에 직접 주입하는 것은 계내 종양을 항원 공급원으로 사용하고 CpG를 보조제로 도입하여 종양 내 면역 반응을 활성화하는 면역화의 한 형태입니다. 따라서 우리는 CpG의 종양 내 주사가 1형 항종양 T 세포 반응 경로에 따라 국소 수지상 세포를 모집하고 활성화함으로써 종양의 면역 특권을 폐지할 것이라고 가정했습니다.
앞서 언급한 문제를 극복하기 위해 Fe3 기반의 수정된 자성 입자 플랫폼을 개발했습니다. O4 종양 부위에 종양내 주사를 통해 CpG의 방출을 지시하고 제어하는 입자. Fe3의 고유한 특성으로 인해 O4 자성 입자, 특히 우수한 조직 적합성[18], 초상자성[19, 20], 낮은 독성[21], 외부 자기장을 통한 쉬운 준비 및 표적 약물 전달[22, 23], 이들의 움직임과 농도는 다음에서 제어될 수 있습니다. Fe3를 허용하는 외부 자기장이 있는 몸체 O4 유전자 형질전환 효율이 향상된 유전자 의약품의 운반체로 사용되는 입자[24]. 또한 Fe3에 APTES 코팅 O4 공유 결합에 의한 입자는 응집체의 형성을 방지하고 CpG 결합에 대한 추가 도움을 위해 더 많은 변형 부위(아미노기)를 제공합니다[25, 26]. 이 연구에서 Fe3 O4 자성 입자는 공침법[27]에 의해 제조되었고 APTES로 변형되었다. CpG는 수정된 Fe3의 표면에 단단히 결합되었습니다. O4 정전기적 상호작용에 의해 입자가 약 50nm 직경의 FeNP/CpG 입자를 형성합니다. 추가 연구에 따르면 FeNP 입자 전달 시스템은 수지상 세포에서 유리 CpG에 비해 CpG의 흡수 효율이 향상되었으며 FeNP/CpG 입자의 종양 내 주사는 효과적인 항종양 Th1형 면역 반응을 자극하여 종양을 억제할 뿐만 아니라 생체내 C26 결장암 및 4T1 유방암 모델에서 종양 전이를 억제할 뿐만 아니라 제자리 성장을 억제합니다. 따라서 나노제제 요법은 잠재적인 종양 면역요법 전략이 될 수 있습니다.
3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)은 Aladdin Company, Inc.로부터 입수했습니다. 염화 제2철 6수화물(FeCl3 ∙6H2 O) 및 염화제1철 사수화물(FeCl2) ∙4H2 O) Tianjin Guangfu Fine Chemical Industry Research Institute에서 구입했습니다. 다음 CpG는 Invitrogen Co.에서 합성되었습니다:5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'. Fluorescein isothiocyanate(FITC)는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구입했습니다.
인간 배아 신장 세포주(293T), 뮤린 유방 종양 세포주(4T1) 및 결장암 세포주(C26)는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 획득하였고, 골수 유래 수지상 세포(BMDC)는 획득하였다 BALB/c 마우스에서. 암컷 6-8주령 BALB/c 마우스를 Beijing HuaFuKang Laboratory Animal Co. Ltd.에서 구입했습니다. 마우스를 병원균이 없는 조건에서 사육하고 보관했습니다. 모든 동물 프로토콜은 국립 보건원의 실험 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다.
공침법은 Fe3 합성에 사용되었습니다. O4 입자 [29]. 실험 절차에서 11.68g FeCl3 ∙6H2 O 및 4.30g FeCl2 ∙4H2 O를 80°C에서 200mL의 탈이온수를 포함하는 3구 플라스크에 첨가한 다음 15ml의 25% NH3를 첨가했습니다. ·H2 O. 1시간 반응 과정에서 혼합물을 N2로 퍼징했습니다. 그리고 저어주었다. 준비된 Fe3 30밀리그램 O4 60ml의 탈이온수와 무수 에탄올의 혼합물에 30분 동안 초음파 진동으로 분산시켰다. 0.3g의 준비된 Fe3 O4 4mL 탈이온수와 600mL 무수 에탄올의 혼합물에 30분 동안 초음파 진동으로 분산시켰다. 그런 다음 1.2mL의 APTES를 7시간 동안 일정한 기계적 교반 하에 혼합물에 첨가했습니다. 결과적으로 기능화된 APTES 수정 Fe3 O4 (FeNP) 나노 입자는 자석에 의해 상등액으로부터 자기적으로 분리된 다음 에탄올로 세척하고 24시간 동안 진공 하에 40°C에서 건조되었습니다. 마지막으로, FeNP의 침전물은 추가 사용을 위해 준비되었습니다.
Fe3의 입자 크기 분포 스펙트럼 O4 , FeNP 및 FeNP/CpG 입자는 25°C에서 Zetasizer Nano ZS90 레이저 입자 크기 분석기(Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 측정되었습니다. 각 시험은 3회 실시하여 평균값을 취하였다. 투과전자현미경(H-6009IV; Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)과 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 제조된 입자의 형태를 관찰하였다.
FeNP 입자의 CpG 결합 능력을 평가하기 위해 아가로스 지연 분석을 수행했습니다. 간단히 말해서, 기능화된 APTES 수정 Fe3 O4 입자(FeNP)를 1μg CpG와 다양한 비율(FeNP:CpG, w /와 ) 증류수에. 실온에서 30분 동안 동시 배양한 후 혼합물을 1%(w /v ) 30분 동안 120V에서 아가로스 겔. 그런 다음 겔을 Golden View™(0.5mg/mL)로 염색하고 UV 조명기(Bio-Rad ChemiDox XRS, USA)로 사진을 찍었습니다.
C26, 4T1 및 293T 세포주에 대한 FeNP 입자의 세포독성을 MTT 분석으로 평가했습니다. C26, 4T1 및 293T 세포는 5 × 10 3 의 밀도로 플레이팅되었습니다. 96웰 플레이트에 10% FBS를 함유하고 24시간 또는 72시간 동안 성장시킨 100μL RPMI 1640 배지에서 웰당 세포. 준비된 세포를 1.25, 0.625, 0.3, 0.15, 0.07, 0.03, 0.01, 0mg/ml의 서로 다른 농도에서 일련의 FeNP 입자에 노출시켰습니다. 지정된 시간 동안 배양한 후 100μl 완전 배지와 10μl MTT를 각 웰에 피펫으로 옮기고 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션했습니다. DMSO를 30분 동안 용질에 첨가하면 포르마잔이 형성되었습니다. 그런 다음 Spectramax M5 Microtiter Plate Luminometer(Molecular Devices, USA)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정했습니다. 처리되지 않은 세포의 세포 생존율은 100%로 간주되었습니다.
BMDC는 BALB/c 마우스로부터 준비되었습니다. 간단히 말해서, 대퇴골 및 경골의 골수 세포를 주사기를 사용하여 유리 FBS 함유 1640 배양 배지로 씻어내었습니다. 세포를 1500rpm에서 3분 동안 원심분리하고 ACK 용해 완충액(Lonza Inc.)으로 처리하여 적혈구를 제거하고 10% FBS, 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신( 100U/mL) 37°C, 5% CO2, 20ng/mL 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 그런 다음 세포를 10 6 의 밀도로 6웰 플레이트에 접종했습니다. 웰당 세포 수, 성장 배지는 2일마다 교체했습니다. 7일째에 수지상 세포를 수확했습니다.
7일째에, 0.2μg 유리 FITC-접합 CpG(CpG-FITC) 또는 10:1의 질량 비율로 CpG-FITC를 전달하는 FeNP의 미립자 등가물을 미리 설계된 웰에 추가했습니다. 형질감염 1시간 또는 3시간 후, 성장 배지를 제거하고, 세포를 10분 동안 DAPI로 염색하고, 세포를 생리 식염수로 3회 세척했습니다. 각 웰의 사진은 레이저 주사 공초점 현미경(LSCM)으로 촬영하였으며, 형질감염 효율은 유세포분석기(NovoCyte Flow Cytometer, ACEA Biosciences, USA)로 측정하였다.
10만 개의 C26 또는 4T1 세포를 각 BALB/c 마우스(6~8주령)의 등에 피하 주사했습니다. 이후에 디지털 캘리퍼스를 사용하여 종양의 부피를 측정하고 다음 공식으로 계산했습니다. 종양 부피 =0.5 × 길이(mm) × [폭(mm)] 2 . 종양이 약 50mm에 도달하면 3 크기에 따라 처리가 적용되었습니다. 마우스(n =10) 20μg CpG 또는 CpG 단독에 해당하는 CpG/FeNP(10:1 비율) 미립자의 종양 내 주사를 4회 처리 동안 3일마다 받았습니다. 생리 식염수(NS) 또는 FeNP 입자와 동등한 수준의 마우스를 대조군으로 간주했습니다. 종양 크기와 동물 체중을 3일마다 모니터링했습니다. 31일째에 모든 마우스를 경추 탈구로 희생시켰다. 종양 조직 및 기타 중요한 기관을 4% 중성 포르말린으로 고정한 다음 HE 염색을 위한 파라핀 절편으로 형태학적 차이를 평가하고 면역형광을 통해 종양 미세 환경을 테스트했습니다. 4T1 모델에서는 종양의 무게를 측정하고 폐전이 결절의 수를 세었습니다.
종양 재도전 실험은 C26 모델에서 진행되었습니다. 간단히 말해서, FeNP/CpG 처리로 치료된 마우스는 5 × 10 5 로 다시 챌린지되었습니다. C26 또는 4T1 세포 s.c. 추가 처리 없이 옆구리 반대편에 있는 두 개의 개별 부위로 분리합니다. 4T1 종양의 부피가 200–300mm 3 로 증가했을 때 마우스를 희생했습니다. 또는 20일
CTL 분석은 공개된 방법에 따라 수행되었습니다. 구체적으로, 이펙터 세포인 비장의 림프구를 수확하여 염화암모늄으로 적혈구를 고갈시킨 후 처리 실험의 마지막에 나일론 울을 통과시켰다. 표적 세포로서 4T1 또는 C26은 300mci의 Na2로 표지되었습니다. 51 CrO4 2시간 동안 PBS로 세척하고 96웰 플레이트에 분주했습니다. 준비된 이펙터 세포는 다른 E:T 비율로 표적 세포와 함께 배양되었습니다. 표적 세포로부터의 방사능을 함유하는 상청액을 섬광 계수기로 측정하였다. 특이적 용해는 다음과 같이 결정되었다:% 특이적 용해 =100 [(CTL 자발적 방출의 존재 하에 방출)/(최대 방출 자발적 방출)]. 모든 실험에서 자연방출은 최대방출의 30% 미만이었다.
실험 종료 시 대조군 또는 CpG 처리된 마우스로부터 비장세포를 수확하고, 제조사의 지침에 따라 마우스 IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot 키트를 사용하여 ELISpot 분석을 수행했습니다. 수확한 비장세포를 각각의 처리와 함께 96시간 동안 공동 인큐베이션하고 현탁액을 떨어뜨리고 IFN-γ 및 IL-4의 혼합 항체를 추가하기 전에 세포를 세척 완충제로 3회 세척했습니다. 발색제에 의해 처리된 후, 반점 형성 세포(SFC)의 수를 현미경으로 세었습니다.
제조업체의 지침에 따라 Ct-특이 혈청 항체 역가의 수준을 결정하기 위해 ELISA를 수행했습니다. 요약하면, 정제된 전체 Ct 단백질(BestBio Biotechnology Co. Shanghai, China)로 코팅된 마이크로 플레이트를 0.05% Tween 20(PBST)을 함유한 PBS 용액으로 헹군 다음 100μl 차단 완충액(PBST 중 5% 탈지유)으로 차단했습니다. 37°C에서 1시간 PBST로 5회 헹군 후 플레이트를 37℃에서 면역 혈청(차단 완충액에 1:1000으로 희석, 100μl/웰) 또는 질 세척액(차단 완충액에 1:10으로 희석, 100μl/웰)과 함께 인큐베이션했습니다. °C에서 2시간 PBST로 5회 헹군 후 플레이트를 HRP-접합 염소 항-마우스 IgG 항체(차단 완충액에서 1:1000으로 희석, 100μl/웰) 또는 HRP-접합 염소 항-마우스 IgA 항체( 1:2000 차단 완충액, 100μl/웰) 37°C에서 1시간 동안
생체내 억제 연구에서 채취한 종양 조직 및 주요 기관을 고정하고 파라핀에 포매했습니다. 탈랍 및 재수화 후, 왁스가 포함된 조직 절편이 Mayer의 HE로 염색되었습니다. 각 그룹의 종양 조직 내 침윤성 림프구(TIL)를 분석하기 위해 섹션에 고압 항원 복구를 적용하고 항-마우스 FITC-CD4, PE-CD8 및 PE-CD49b(NK 메이커)로 염색했습니다(BD, USA) 4°C에서 1시간 동안 처리한 다음, 이미징을 위해 PBS로 세척하기 전에 10분 동안 DAPI로 염색했습니다. 각 그룹의 이미지는 양성 형광 현미경(Olympus, Japan)을 통해 촬영되었습니다.
데이터는 평균값 ± 표준편차로 표현하였다. Prism 5.0c Software(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) SPSS 17 소프트웨어를 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)으로 통계 분석을 수행했습니다. 단일 요인 분산 분석(ANOVA)에 대한 Tukey의 테스트를 사용하여 그룹 간 비교를 수행했습니다. 피 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
<섹션 데이터-제목="결과">세포독성이 낮은 CpG 전달용 자성입자 개발을 위해 Fe3 O4 입자는 그림 1a와 같이 공침법을 사용하여 합성되었습니다. Fe3 표면에 APTES의 아미노프로필실란기(–O)3Si–CH2–CH2–CH2–NH2 접목 O4 FeNP 입자를 형성합니다(그림 1b). 음으로 하전된 CpG(CpG)는 APTES가 제공하는 효과적인 작용기에 결합하여 그림 1c에 개략적으로 표시된 것처럼 정전기 상호작용을 통해 FeNP/CpG 입자를 형성합니다. 동적 광산란 측정을 기반으로 준비된 Fe3의 크기는 O4 입자는 10.7 ± 4.1nm였습니다(그림 2a). TEM(그림 2b)과 SEM(그림 2c)을 통해 관찰한 바와 같이 Fe3 O4 이 작업에서 개발된 균일하고 구형에 가까운 모양을 나타냅니다. APTES 수정 Fe3의 동적 직경 O4 입자는 34.5 ± 5.0 nm(그림 2d)로 TEM 결과와 잘 일치했습니다(그림 2e).
<그림>
FeNP/CpG 입자의 준비. 아 Fe3 합성 방정식 O4 공침법을 이용한 자성입자. ㄴ FeNP 입자를 형성하기 위해 자철석 표면에서 실란 중합체의 생성 및 APTES의 실란화 반응과 함께 가수분해 및 축합 반응. ㄷ FeNP/CpG 입자의 개략도. CpG는 정전기적 상호작용을 통해 FeNPs의 표면에 결합되어 FeNP/CpG 입자를 형성합니다.
<사진>
FeNP/CpG 입자의 특성화. 아 Fe3의 크기 분포 스펙트럼 O4 입자. ㄴ Fe3의 투과 전자 현미경 이미지(TEM) O4 . ㄷ Fe3의 주사 전자 현미경 이미지 O4 입자. d APTES 코팅된 Fe3의 크기 분포 O4 (FeNP) 입자. 이 FeNP 입자의 TEM 이미지. 에 겔 지연 분석에 의해 결정된 FeNP의 CpG 결합 능력. 모든 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타냅니다.
FeNP 입자가 CpG에 결합하는 능력을 설명하기 위해 겔 지연 분석을 수행했습니다(그림 2f). FeNP와 CpG의 몰비가 10:1일 때 밝은 CpG 밴드가 관찰되지 않았으며, 이는 음전하를 띤 CpG가 전기영동 후 정전기적 상호작용을 통해 FeNP 입자에 완전히 흡착될 수 있음을 보여줍니다. 따라서 우리는 연구에서 추가 적용을 위해 그 처방 비율을 선택했습니다. 함께, 이러한 결과는 CpG가 정전기적 상호작용을 통해 FeNP의 표면에서 성공적으로 결합할 수 있음을 입증하여 안정성과 작은 치수를 보여줍니다.
시험관 내 생물물리학적 특성을 추가로 설명하기 위해 24시간 또는 72시간 시점에 293T, 4T1 및 C26 세포에서 FeNP의 세포독성을 검출했습니다(그림 3a). 293T, C26 및 4T1 세포에서 세포 생존율과 FeNP 입자 사이에는 명백한 용량 의존적 관계가 없었습니다. 1.25mg/ml의 FeNP 농도에서도 3가지 세포에서 세포 생존율은 24시간에서 80% 이상, 72시간에서 60% 이상이었습니다. 이러한 결과는 정상 세포(293T)이든 종양 세포(C26, 4T1)이든 FeNP 입자의 생체 적합성을 입증했습니다.
<그림>
시험관내 FeNP/CpG 입자의 세포독성 및 흡수 활성. 아 MTT 분석. 우리는 24시간 또는 72시간 동안 다양한 농도의 FeNP 입자로 처리한 후 293T, 4T1, C26 세포의 생존력을 감지했습니다. 모든 용량의 FeNP에서 세포 생존율에는 유의한 차이가 없었습니다. ㄴ , ㄷ BMDC에서 FeNP/CpG 흡수 감지. GM 이후에 준비된 BMDC -CSF 7일 동안의 처리는 집중적으로 세척, 고정 및 DAPI로 표시되기 전에 1 또는 3시간 동안 CpG-FITC 또는 FeNP 전달 CpG-FITC로 형질감염되었습니다. 이미지는 레이저 스캐닝 공초점 현미경(LSCM)으로 캡처되었습니다. 유리 FITC 표지 CpG와 비교하여 형광 강도가 향상된 FeNP/CpG(b ) 및 형질감염 효율은 통계적으로 유의했습니다(c ). 이 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표합니다. 평균 ± 표준 오차; *P < 0.05, *P < 0.01 및 ***P < 0.001 대 미처리 그룹
CpG에 대한 주요 수용체 세포인 수지상 세포는 TLR9에 의해 매개되는 항종양 면역 반응에서 중요한 역할을 합니다. 강력한 1형 극성화 보조제로서의 CpG는 DC가 케모카인과 사이토카인을 분비하여 종양 내에서 면역 반응을 활성화하도록 유도합니다. 따라서 DC 세포로의 CPG의 효율적인 전달은 항종양 반응을 달성하는 데 중요합니다. 우리 연구에서 FITC-컨쥬게이션된 CpG는 시험관 내에서 DC로 FeNP 입자의 전달 능력을 조사하는 데 사용되었습니다. 형질감염 후 1시간 또는 3시간 후, 레이저 스캐닝 공초점 현미경(LSCM)을 통해 FITC 결합 CpG 코팅 FeNP 입자(FeNP/CpG-FITC) 처리 그룹의 세포 형광 강도가 세포 형광 강도보다 더 높았다. 동등한 양의 무료 CpG 그룹(그림 3b). FeNP/CpG-FITC 입자는 1시간 후 DC의 최대 18.3%를 형질감염시킬 수 있었습니다. 그런 다음 형질감염 3시간 후에 양성 세포의 비율이 39.2%로 증가했습니다(그림 3c). 한편, free FITC-conjugated CpG 처리된 세포의 경우 10% 미만의 transfection으로 transfection 3시간 후에도 최소한의 형광을 관찰할 수 있었습니다. 따라서 FeNP 입자에 의한 CpG 전달은 CpG의 세포 흡수를 증가시켰음을 시사합니다.
CpG/FeNP 입자의 항암 활성은 생체 내 C26 결장암 및 4T1 유방암 피하 이식 종양 모델에서 먼저 평가되었습니다. 종양 부피가 약 50mm 3 인 경우 , 마우스를 무작위로 4개 그룹으로 나누어 치료를 시작했습니다(n =10). 마우스는 전체 실험에 걸쳐 3회 CpG/FeNP 입자의 종양 내 주사로 처리되었습니다(그림 4a). 우리 연구에서 FeNP/CpG 입자의 종양내 주사는 대조군에 비해 이종이식편 종양 성장의 현저한 억제를 가져왔고 억제율은 최대 69%(P <0.05 대 NS)(그림 4b). 생리식염수(NS) 처리군(0.90 ± 0.08 g) 및 FeNP 그룹(0.81 ± 0.03 g)과 비교하여 FeNP/CpG 입자 처리군은 통계적으로 유의한 종양 중량 감소(0.38 ± 0.03 g, i>피 <0.001). 이에 비해 유리 CpG군은 최소 항암력(0.68 ± 0.03 g)을 보였다(Fig. 4c). 또한 PBS 대조군의 마우스는 광범위한 폐 전이가 발생했으며, 이에 비해 FeNP/CpG 입자로 처리된 마우스는 폐의 종양 결절 수가 64.1% 감소하여 위력을 입증했습니다(그림 4d, e). 전이성 종양 치료에서 FeNP/CpG 입자의 도 4f에 도시된 바와 같이, 폐의 H&E 염색은 다른 그룹보다 FeNP/CpG 처리 후 폐 전이가 명확하게 폐 부담 감소를 보였다. 이러한 결과는 4T1 세포로의 FeNP 전달 CpG가 4T1 종양 성장을 유의하게 억제했을 뿐만 아니라(P <0.001 대 NS) 그러나 유방암의 폐로의 전이도 억제했습니다.
<그림>
생체 내 FeNP/CpG 입자의 항종양 능력. 아 생체내 종양내 주사를 통한 C26 결장암 및 4T1 유방암 이종이식 모델 모두에서 FeNP/CpG 입자에 의한 항종양 치료 일정. ㄴ –d FeNP/CpG 입자 처리는 4T1 종양의 성장을 억제했습니다. ㄴ 4T1 종양 모델의 대표적인 종양 성장 곡선. ㄷ 평균 종양 무게. d FeNP/CpG 종양내 주사 후 폐 전이를 명확하게 보여주는 각 그룹의 평균 폐 종양 결절. 이 , f 폐의 명시야 이미징 및 H&E 염색:e 보이는 폐 전이의 수, 화살표는 폐 전이를 나타냅니다. 에 폐 전이의 H&E 염색. 스케일 바, H&E 염색용 100μm. 지 , h FeNP/CpG 입자는 C26 이종이식 종양의 성장을 유의하게 억제했습니다:e 실험 중 각 그룹의 종양 성장 곡선 및 f 평균 종양 무게. 각 그룹에 10마리의 마우스가 있었습니다. 지 종양 재도전 실험. 나 C26 모델에서 FeNP/CpG 처리로 치료된 마우스는 5 × 10 5 로 다시 챌린지되었습니다. C26(오른쪽 옆구리) 또는 4T1 세포(왼쪽 옆구리) s.c. 추가 처리 없이 옆구리 반대편에 있는 두 개의 개별 부위로 분리합니다. 표시된 이미지는 종양 재공격 후 20일의 대표적인 마우스입니다. 모든 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표했습니다. 평균 ± SEM; *P < 0.05, *P < 0.01 및 ***P < 0.001
유사하게, FeNP/CpG 처리군으로 유의하게 향상된 항종양 효과가 C26-인큐베이션 마우스의 피하 모델에서 관찰되었다. 도 4g에 나타난 바와 같이 대조군 마우스, 비히클 그룹 및 CpG 그룹에서 종양이 빠르게 성장했으며 평균 종양 부피는 약 2300 ± 239.4 mm 3 였습니다. , 2116.7 ± 360.9mm 3 및 1353.3 ± 158.9mm 3 대조적으로, FeNP/CpG 그룹에서는 평균 종양 부피가 약 153.7 ± 62.7mm 3 로 종양 성장이 극도로 억제되었습니다. (피 <0.01 대 NS) 및 94.4%의 억제율. 초기 치료 후 종양이 천천히 자라는 것처럼 보였으며 3회 치료가 끝나면 종양의 일부가 점차 사라지기 시작합니다. 훨씬 더 중요한 것은 FeNP/CpG 입자 처리 그룹에서 실험이 끝날 때까지 거의 절반의 마우스에서 종양이 완전히 사라졌다는 것입니다. 그림 4h에서 볼 수 있듯이 FeNP/CpG 처리군은 다른 군에 비해 평균 종양 무게가 훨씬 낮았습니다(P <0.001):FeNP/CpG 처리군(0.14 ± 0.08 g), NS 군(2.41 ± 0.26 g), FeNP 군(2.50 ± 0.4 g), CpG 군(1.44 ).3±2 FeNP/CpG 입자가 특정 항종양 반응을 매개하기에 충분한지 여부를 결정하기 위해 C26 모델에서 종양 재공격 실험을 진행했습니다(그림 4i). C26 결장암 모델에서 FeNP/CpG 입자 처리 후 종양이 완전히 퇴행한 마우스에 BALB/c 마우스의 다른 위치에 4T1 및 C26 종양을 피하 접종하고 더 이상의 치료는 제공하지 않았다. 모든 4T1 종양은 빠르게 성장했고, 항원공격 후 20일째에 부피가 1000mm3를 초과했습니다. 대조적으로, C26 모델에는 육안으로 볼 수 없는 고형 종양이 있었는데, 이는 FeNP/CpG 입자 그룹이 특정 항종양 반응을 자극함을 시사합니다. 이러한 결과는 FeNP/CpG 입자의 종양 내 주사가 종양의 성장을 효율적으로 억제한다는 것을 시사했습니다. 피하 이종이식편.
위의 두 모델에서 FeNP/CpG 입자의 생체 내 항종양 메커니즘이 추가로 연구되었습니다. 면역 반응의 유형을 연구하기 위해 ELISpot 분석을 적용하여 마우스 비장의 IFN-γ/IL-4 수준을 분석했습니다. 비장 림프구의 IFN-γ 수준(ELISpot 판에 홍반 표시)이 IL-4 수준(ELISpot 판에 파란색 반점 표시)보다 훨씬 더 높은 경우 자극된 면역 반응의 유형은 Th1, 즉 CD8을 활성화하는 것이었습니다. 섭>+ T 림프구 및 주로 신체의 CTL 반응. 그렇지 않으면 면역 반응의 유형은 Th2, 즉 주로 CD4 + 를 활성화하는 것이었습니다. T 림프구, 따라서 B 림프구를 자극하고 항원 특이적 항체를 생성합니다. 서로 다른 처리에서 IFN-γ 및 IL-4의 발현을 측정하기 위해 이중 색상 ELISpot 분석을 수행했습니다(그림 5a). 다른 세 그룹과 비교하여 마우스 비장 림프구에서 분비되는 IL-4 및 IFN-γ의 반점 형성 세포(SFC)의 수는 FeNP/CpG 입자 처리 그룹에서 증가하는 경향을 보였고, SFC의 수는 IFN-γ 분비는 IL-4보다 1.5배 더 높았다(P <0.05), 이는 FeNP/CpG 입자 종양 내 주사 후 항종양 세포 면역 반응이 향상되었음을 의미합니다. 또한, NS, FeNP, CpG 및 FeNP/CpG 처리된 마우스의 혈청을 3회의 면역화 후 총 종양 특이적 IgG의 존재에 대해 ELISA 분석을 사용하여 분석했습니다. C26 종양 모델에서 FeNP/CpG 면역 마우스가 다른 그룹보다 종양 특이적 IgG 역가가 훨씬 더 높았지만(그림 5b), FeNP/CpG 면역 마우스와 CpG 면역 마우스 사이에는 통계적 차이가 없었습니다. .
The mechanism of antitumor immune response. 아 ELISpot assay. Splenocytes were harvested from NS or treated mice after the final treatment, and ELISpot assays were performed using the mice IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot kit in the C26 xenograft model. ㄴ In the C26 model, serum antibody titers in tumor-bearing mice treated by FeNP/CpG particles were tested using an ELISA assay. Each symbol represents an individual mouse, and horizontal lines indicate the median as determined by Mann–Whitney U tests. ㄷ CTL assays. The cytotoxicity of splenocytes against C26 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay. d Representative immunofluorescence images showing infiltrating immune cells in tumor tissues in each group. The FeNP/CpG particles treatment groups with enhanced CD4 + T, CD8 + T and NK (CD57 + ) cell infiltration in tumors compared to that of other groups. 이 The cytotoxicity of splenocytes against 4T1 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay
To assess the cell-mediated immune response stimulated by the FeNP/CpG, CTL activity was assessed using the 51Cr release assay on C26 and 4T1 cells ex vivo (Fig. 5c, e). When the killing activity of CTL was at a 100:1 ratio of effector cells to target cells, in the C26 cells, the effectors in the FeNP/CpG groups showed 8.2-fold more tumor-killing activity than that in the NS group and 9.7-fold and 1.7-fold more than that in the FeNP and CpG groups (P < 0.05 versus NS) (Fig. 5c). Similarly, this observation was coincident with the result in the 4T1 cells; the FeNP/CpG group had 7.4-fold more tumor-killing activity than that of the NS group and 6.6-fold and 1.4-fold more than that of the FeNP and CpG groups (P < 0.01 versus NS). These results illustrated that compared to that of free CpG, the use of APTES-coated Fe3 O4 to deliver CpG can stimulate a more intense humoral immune response and result in a better antitumor efficiency in vivo.
Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), a primary immune component infiltrating solid tumors, are considered the manifestation of the host antitumor reaction. Immunofluorescence analyses were performed to study TILs in tumors. The intensity of infiltration by CD4 + T cells, CD8 + T cells and CD49B + NK cells was studied (Fig. 5d). There was a significant increase in the intensity of infiltration of NK cells, CD4 + T cells, and CD8 + T cells in tumors from the FeNP/CpG groups compared with that in the FeNP, CpG, and NS groups (P < 0.005), which suggests that FeNP/CpG not only stimulates a higher immune response but also alters the tumor microenvironment by activating more immune cells into the tumor tissues. During the entire experiment, the mouse body weight and state were observed, and there was no piloerection, poor appetite, weight loss, or abnormal behavior in the C26 xenograft model (Fig. 6a). As shown in Fig. 6b, no significant pathological changes in heart, liver, spleen, lung, or kidney were observed through HE analysis. No histopathological changes and changes of body weight were observed in the 4T1 subcutaneous xenograft model (data not shown). Overall, our data suggested that the developed FeNP particles for CpG delivery were capable of treating cancer and inhibiting tumor metastasis with high safety.
Safety and toxicity evaluation of FeNP/CpG formulation. (아 ) Body weight changes in NS, FeNP, CpG, and FeNP/CpG groups. ㄴ The section of the heart, liver, spleen, lung, and kidney in each group was collected and stained with H&E staining. No significantly pathological changes were observed in any group (magnification, × 200)
Synthetic CpG, identified as an effective drug in immunotherapy by simulating the immune activation of natural bacterial DNA [28,29,30], have been characterized in a variety of tumor models. CpG intratumoral injection is one of treatments in clinical trials on CpG. Molenkamp and his colleagues showed that the intratumoral injection of CpG alone or combined with radiotherapy could obviously increase the tumor-specific CD8 + T cell immune response in lymphoma or melanoma patients, causing systemic tumor regression [31]. So far, CpG combined with other treatments showed both a great antitumor effect and good security, which suggests that CpG are quite effective in tumor immunotherapy. However, the greater challenge of CpG truly coming into clinical application is if they can efficiently be delivered into the cells to combine with receptors such as TLR9 to stimulate an immune response. Nanotechnology can address such concerns by enhancing the delivery of CpG to antigen-presenting cells, and a number of nanocarriers have been explored for this purpose [32,33,34]. The nanoparticle formulations explored include gelatin particles, liposomes [35, 36], and DNA origami structures, but these were only explored in the context of combination treatments.
In this study, we first developed a non-viral delivery system, FeNPs, which were easily formed via APTES-modified Fe3 O4 , to deliver CpG into BMDCs. The CpG surrounded the surface of the modified magnetic Fe3 O4 particles via electrostatic interactions to form FeNP/CpG particles with a small size distribution. The FeNP/CpG particles not only showed enhanced transfection efficiency compared to that of free CpG but also had a great antitumor effect in subcutaneous tumor models of C26 colon cancer, with 94.5% tumor inhibition, and 4T1 breast cancer, with a 64.3% inhibitory rate, though intratumoral injection in vivo. Moreover, FeNP/CpG treatments significantly stimulate an effective antitumor immune response and alter the tumor microenvironment by recruiting a number of immune cells to tumor tissues.
We further discuss possible reasons to account for the enhanced transfection and therapeutic efficiency of FeNP/CpG particles over that of free CpG. First, the developed FeNPs take advantage of characteristics such as their good histocompatibility, superparamagnetism, and a strong positive charge (for the Fe3 O4 particles) to assist in delivering the CpG into the intracellular space, resulting in drug-carrier particles focusing on the tumor site to increase the drug concentrations in the area, reduce the drug loss, and improve drug utilization. Simultaneously, APTES was used to modify Fe3 O4 , providing more CpG binding sites to firmly bind the CpG onto the carrier. FeNPs exerted higher cell viability on 293T, C26, and 4T1 cells in vitro, and there was no remarkable pathological change after FeNP/CpG treatment by intratumoral injection that could avoid the side effects due to CpG entering into circulation by systemic administration. Second, the FeNP load CpG into DCs with a higher transfection efficiency than that of free CpG, increasing opportunities for integration with intracellular TLR9, which is widely expressed in macrophages, NK cells, DCs, and so on. The combination of CpG and TLR9 induces the secretion of local cytokines and chemokines, recruiting and activating immune cells of the innate immune response to stimulate the antitumor immune response; additionally, NK cells and CTLs could kill tumor cells directly or use IFN-γ or granzyme B to kill tumor cells [37, 38]. We suspected that FeNP/CpG may be taken up by the recruited immune cells to trigger the secondary cascade amplification of the immune response. Third, some studies have indicated that CpG can react with tumor cells expressing TLR9, aiming to induce tumor cell autophagy [39]. Autophagy may enhance the sensitivity of tumor cells to the immune response, and the ATP dependent on autophagy could be released extracellularly and used to recruit DCs into the tumor tissue, activating the tumor-specific T cell immune response. This therapy is a form of immunization that uses the in situ tumor as a source of antigen and introduces CpG as an adjuvant to activate an immune response within the tumor. In our study, although the FeNP/CpG was injected without any specific tumor antigen, a cell-specific and systematic immune response could be elicited, and the contralateral tumors appear regressive, as shown in the tumor re-challenge experiment and the two-tumor site model. In addition, being coated with the lysate of tumor cells in a 96-well plate, the ELISA assay showed after FeNP/CpG intratumoral injection in mice that the antitumor antibody titer in the serum appeared to significantly increase. The ELISpot assay suggested that FeNP/CpG treatment, to a great degree, increased the spleen lymphocyte secretion of IFN-γ and IL-4, especially that of IFN-γ , which indicated that the humoral immunity responses and cellular immunity responses were both enhanced by treatment with FeNP/CpG in mice. In addition, immunohistochemistry analyses were performed to study TILs in the tumor microenvironment. Compared to that in the other groups, in the FeNP/CpG group, the number of CD4 + T, CD8 + T, and NK cells in the tumors showed a significant increase. Taken together, our study suggested that FeNP/CpG particle intratumoral injection may be a potential tumor immunotherapy strategy.
In recent years, treatment strategies based on nucleic acids have become one of the important areas of tumor treatment. The negative charge of the lipid bilayer of cell membranes makes it difficult for nucleic acid drugs with the same charge to pass through the cell membrane into the cell. Thus, APTES-modified Fe3 O4 as a safe and efficient delivery system is expected to be used for other nucleic acid drugs to contribute to the carrier solution.
In summary, magnetic APTES-modified Fe3 O4 particles (FeNP) were used to deliver CpG adjuvants via intratumoral injection to treat C26 colon carcinoma and 4T1 breast cancer, with enhanced antitumor ability over that of free CpG. The prepared FeNPs showed high stability, low toxicity, and high transfection ability for CpG in vitro and in vivo. Our results demonstrated the potential capacity of FeNP particles in non-viral nucleic acid drug delivery and offered an alternative strategy for CpG immunotherapy.
3-Aminopropyltriethoxysilane
Bone marrow-derived dendritic cell
Cytosine-phosphate-guanine
FITC-conjugated CpG
3-Aminopropyltriethoxysilane-modified Fe3 O4 nanoparticle
FeNP-delivered CpG particles
FeNP-delivered CpG-FITC particles
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
나노물질
초록 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 기반 나노의약품의 임상 번역은 부분적으로는 식세포에 의한 비특이적 식세포 작용으로 인한 낮은 전달 효율로 인해 제한적입니다. 암세포와 면역 세포 사이의 나노입자 상호작용을 이해하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 이 연구에서는 단일 배양 또는 공동 배양 시스템에서 단핵구/대식세포가 있거나 없는 후두 암종 세포에 대한 형광 PLGA 입자(100 nm, 500 nm 및 1 µm)의 세포 내재화에 대한 정량적 조사가 먼저 수행되었습니다. 5~20µg/mL 농도의 PLGA 입자는 500nm 및
초록 기존의 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 인해 비판을 받아왔다. 나노 입자의 돌파구는 전통적인 치료법과 진단을 업그레이드하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 실제로 나노 입자는 기존의 암 진단 및 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단 및 치료를 위한 새로운 관점과 첨단 장치를 만들 수 있습니다. 그러나 나노입자에 대한 연구는 대부분 in vivo 및 in vitro 단계에 머물고 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극히 소수에 불과하다. 이 리뷰에서 우리는 먼저 암 진단 및 치료에
