Verapamil의 세포 흡수를 향상시키는 동결건조 하이브리드 나노구조 지질 운반체:통계 최적화 및 시험관 내 평가

결과 및 토론

2를 사용한 분석 ⁴ 완전 요인 설계

균질화시간(A), 고형지질농도(B), 액상지질농도(C), 계면활성제 농도(D)와 같이 선택된 독립변수의 값과 선택된 반응의 결과인 PS, PDI , ZP 및 %EE는 표 2에 나와 있습니다. 각 독립 변수와 상호 작용은 ANOVA를 사용하여 통계적으로 평가되었습니다. 각 종속 변수에 대한 다항식 계수는 Eqs에 표시된 대로 각 독립 변수의 효과를 정량화하기 위해 Design-Expert® 소프트웨어에 의해 생성되었습니다. 3, 4, 5, 6. 방정식은 중요한 요소와 상호 작용만을 나타냅니다.

여기서 A 균질화 시간(분), B 고체 지질 농도(mg), C 는 액체 지질 농도(mg), D 는 계면 활성제 농도(mg)입니다. 방정식에서 각 요인 또는 상호 작용 요인 앞의 양수 및 음수 기호는 각각 상승 효과 또는 적대 효과를 나타냅니다. 반응 매개변수에 대한 각 요인 또는 요인 상호작용의 동시 효과를 관찰하기 위해 반응 표면 플롯이 생성되었습니다.

평균 입자 크기에 대한 변수의 영향

식과 같이 3, 요소 A , C , 및 D 입자 크기(PS)에 길항 효과가 있습니다. 균질화 시간(인자 A )는 동시에 NLC의 PS의 상당한 감소와 관련이 있습니다(p <0.05). 이것은 아마도 지질 소구를 더 작은 입자로 효율적으로 분해하는 균질화의 높은 전단력 때문일 것입니다. 유사하게, 액체 지질 농도(C )는 NLC의 PS를 동시에 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. 이는 올레산이 Compritol 888 ATO®와 결합하여 시스템의 점도와 표면 장력을 감소시켜 NLC의 더 작은 입자 크기를 생성하는 능력 때문일 수 있습니다. 액체 지질이 고체 지질과 결합될 때 시스템의 점도를 감소시키는 능력은 또한 Jenning et al. 그들이 SLN 분산을 준비할 때 [5]. 저자는 지질 매트릭스 조성물에서 액체 지질 농도를 0에서 38%로 증가시키면 입자 크기를 감소시킬 수 있음을 관찰했습니다. 또한, 계면활성제 농도(D ) 시스템에 존재하는 더 많은 양의 계면활성제가 제형의 총 지질 함량을 쉽게 유화시켜 더 작은 나노입자를 형성하기 때문에 PS가 감소합니다.

그림 2는 중요한(p NLC의 PS에 대한 요인(AC, BD 및 CD) 상호작용의 <0.05) 효과. 요인(BD)의 긍정적인 영향과 요인(AC 및 CD 상호작용)의 부정적인 영향은 NLC 입자 크기에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 인자(AC)의 부정적인 영향은 균질화 시간이 길고 액체 지질 농도가 높을수록 PS가 감소한다는 것을 보여주었습니다. NLC 제형에서 더 높은 농도의 고체 지질과 계면활성제 사이의 상호작용(BD 상호작용)은 입자 크기에 상당한 긍정적인 영향을 나타내었고, 이는 더 큰 입자 크기를 초래했습니다. 대조적으로, 더 높은 농도의 액체 지질과 계면활성제 사이의 상호작용(CD 상호작용)은 더 작은 크기가 생성되는 입자 크기에 상당한 부정적인 영향을 보였습니다.

유의성을 나타내는 반응 표면 플롯(p <0.05) 균질화 시간, 액체 지질 농도, 계면활성제 농도 및 a 간의 상호작용 효과 AC, b BD 및 c HVD-NLC의 PS에 있는 CD. A 균질화 시간, B 고체 지질, C 액체 지질, D 계면활성제

변수가 PDI에 미치는 영향

Eq. 도 4에 도시된 바와 같이, 올레산은 PDI에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이는 올레산 농도가 증가하면 PDI 값이 낮아지고 NLC 입자의 더 나은 분포로 이어질 것임을 의미합니다. NLC에 대한 올레산의 유사한 효과가 일부 연구에서도 관찰되었습니다[6]. 그림 3은 균질화 시간과 액체 지질 농도 사이의 상호작용(AC 상호작용)을 보여줍니다. 이 상호작용은 PDI에 유의한 부정적인 영향을 보였다. 이는 균질화 시간이 길고 액체 지질 농도가 높을수록 PDI 값이 감소한다는 것을 의미합니다. 또한, 액체 지질과 계면활성제 농도 간의 상호작용(CD 상호작용)은 PDI 값에 상승적인 효과를 나타냈다. 따라서, 액체 지질 및 계면활성제 농도를 동시에 증가시키면 PDI 값이 증가하고 덜 균질한 HVD-NLC 입자가 생성됩니다. 이는 최적화된 값을 초과하는 계면활성제 농도의 추가 증가로 인해 나노입자의 외부 표면에 계면활성제가 축적되어 PDI 값이 증가할 수 있기 때문일 수 있습니다. 동일한 패턴이 Shamma et al.에 의해서도 관찰되었으며, 이에 따라 계면활성제 농도가 증가하면 NLC의 PDI 값이 증가합니다[7].

유의미한(p <0.05) 액체 지질 농도의 효과와 a 간의 상호작용 AC 및 b HVD-NLC의 PDI에 있는 CD. A 균질화 시간, C 액체 지질, D 계면활성제

ZP에 대한 변수의 영향

HVD-NLC 제형은 글리세릴 베헤네이트(Compritol 888 ATO®의 지방산), 올레산 및 덱스트란 설페이트 잔기의 이온화로 인해 음전하를 띠었습니다. 식을 기반으로 합니다. 도 5에 도시된 바와 같이, 올레산의 양을 증가시키면 나노입자에 부정적인 영향을 미치고 결과적으로 나노입자의 음전하를 증가시켜 HVD-NLC의 ZP를 증가시킨다. 이것은 아마도 올레산(액체 지질)에 있는 풍부한 카르복실기의 과도한 이온화 때문일 수 있습니다[8]. 더욱이, 글리세릴 베헤네이트(고체 지질)도 ZP 값에 부정적인 영향을 미치며, 농도를 증가시키면 나노입자의 ZP가 증가합니다. 이는 글리세릴 베헤네이트에서 카르복실산의 더 높은 이온화로 인해 나노입자의 외부 표면에서 더 높은 음전하를 띠기 때문입니다.

BD 상호작용은 NLC의 ZP에 상당한 양의 영향을 미치는 반면 CD 상호작용은 음의 영향을 나타냈다(그림 4). 고체 지질의 농도를 높이고 계면 활성제의 농도를 낮추면 나노 입자의 음전하가 감소하고 ZP 값이 감소합니다. 아마도 이 단계에서 더 낮은 계면활성제 농도는 고체 지질의 총량을 이온화할 수 없어 나노입자 표면의 음전하를 감소시켜 HVD-NLC의 ZP를 감소시킬 수 있습니다. 더욱이, 액체 지질 및 계면활성제의 농도를 동시에 증가(CD 상호작용)하면 HVD-NLC의 ZP 값이 상당히 증가할 것입니다. 이는 제형에 더 높은 농도의 계면활성제가 존재하면 더 많은 카르복실산이 이온화되기 때문입니다.

유의미한(p <0.05) 액체 지질 농도, 계면 활성제 농도 및 a 간의 상호 작용 효과 BD 및 b HVD-NLC의 ZP에 있는 CD. 나 고체 지질, C 액체 지질, D 계면활성제

%EE에 대한 변수의 영향

방정식 6은 균질화 시간을 증가시키면 상당히 (p <0.05) 약물의 %EE를 감소시킵니다. 더 긴 균질화 시간은 나노입자의 외부 표면에 부착된 약물 분자를 벗겨내거나 벗겨낼 수 있으며, 이는 HVD-NLC에서 약물의 더 낮은 %EE를 초래합니다. 대조적으로, 계면활성제 농도를 증가시키면 HVD-NLC에서 약물의 더 높은 %EE가 발생했습니다. 이것은 더 높은 계면활성제 농도가 NLC의 외부 표면 코팅을 증가시켜 약물의 일부가 그 안에 갇힐 수 있기 때문일 수 있습니다. Zhuang et al. 및 Das et al. 지질 격자 내부와 나노 입자의 외부 표면에서 약물 분자의 가용화를 위해서는 적절한 농도의 계면 활성제가 필수적이라고 제안했습니다[9, 10].

그림 5에서 볼 수 있듯이 AD 상호작용은 유의미한(p <0.05) 부정적인 영향으로 균질화 시간을 늘리고 계면활성제의 양을 줄이면 HVD-NLC에서 약물의 %EE가 낮아집니다. 대조적으로, 고체 지질과 계면활성제 농도 사이의 상호작용(BD 상호작용)은 약물의 %EE에 긍정적인 영향을 나타냈다. 따라서, 고체 지질 및 계면활성제의 농도를 증가시키면 HVD-NLC에서 약물의 %EE가 증가할 것입니다. 이것은 아마도 과량의 약물 분자를 가용화하는 더 높은 계면활성제 농도 때문일 것입니다. NLC.

유의미한(p <0.05) 균질화 시간, 액체 지질 농도, 계면활성제 농도 및 a 간의 상호작용 효과 광고 및 b HVD-NLC에서 베라파밀의 EE에 대한 BD. A 균질화 시간, B 고체 지질, D 계면활성제

바람직함 함수를 사용하여 최적화된 HVD-NLC 선택

코드 번호가 VER-9, VER-11, VER-13 및 VER-15인 HVD-NLC 공식은 각각 0.863, 0.852, 0.811 및 0.840의 더 높은 만족도 값을 가졌습니다. 이 공식은 만족도 값이 1에 가까웠기 때문에 추가 연구를 위해 선택되었습니다. 선택한 공식에 대한 모든 응답의 개별 및 결합된 만족도 함수가 그림 6에 나와 있습니다. 이들의 평균 PS, PDI, ZP 및 %EE 49.16 ± 1.55 및 93.95 ± 4.10 98.81 ± 1.01 각각

Bar graph displaying the individual and combined desirability of several responses on selected HVD-NLCs formulations. 아 VER-9, b VER-11, c VER-13, and d VER-15

Lyophilization Study

Lyophilization is one of the commonly used methods in the pharmaceutical field to change aqueous formulation into the dried form to prolong the physical and chemical stability of the nanoparticle during storage [11, 12]. However, the lyophilization step produces various stresses to the sample during the process. So, the need of cryoprotectant is essential to avoid the stress condition and protect the sample. Among the screened cryoprotectants, trehalose was found to be the most suitable one for protecting the HVD-NLCs formulations from aggregation after the lyophilization process. The HVD-NLCs formulations protected with trehalose had the smallest particle size and lowest PDI (Table 3). Trehalose offers many advantages over other cryoprotectants including less chemical interactions and exhibit higher glass transition temperature which may help to prolong the stability of nanoparticles. Furthermore, trehalose has been demonstrated as an efficient cryoprotectant for freeze drying of Compritol 888 ATO® (Glyceryl behenate) in the lipid-based nanoparticles [13, 14]. Thus, in the present study, trehalose was selected as cryoprotectant for the HVD-NLCs formulations.

In the next study, different ratios of trehalose were used in the HVD-NLCs formulations after or during the homogenization process. Table 4 shows the effects of different ratios of trehalose added into the formulations after homogenization on PS, PDI, and %EE.

The mean PS was found in the nano size range, while PDI was < 1 in all ratios of lipids to trehalose used in the study. However, the %EE of verapamil was decreased significantly with increasing the ratio of trehalose to lipids. The %EE of lipid:trehalose at the ratio of 1:1 was significantly higher than the lipid:trehalose ratio of> 1:1. Increasing the amount of trehalose beyond the lipid trehalose ratio of 1:1 enhanced the removal of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex. This is possibly due to the interaction between trehalose and dextran at the outer surface of nanoparticles, which promotes the displacement of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex and hence, lowers the %EE of drug in the HVD-NLCs. The interaction between trehalose and dextran takes place due to the formation of sugar-salt complex (trehalose-dextran complex), in that the trehalose (sugar) competes with cationic verapamil and forms complex with polyanionic dextran [15]. Miller et al. measured the viscosity and glass transition temperature of trehalose with boric acid and proposed the formation of chemical complex between trehalose and borate ion (B(OH)₄ ^- ) [15]. Therefore, based on the obtained results, the lipid to trehalose ratios of 1:1 and 1:2 were selected for the next study of trehalose addition during homogenization. Table 5 shows that the results of PS, PDI, and %EE were significantly better when trehalose were added during homogenization. This could be due to better mixing of trehalose in the HVD-NLCs formulation by the homogenization process. It is evident from the data that there was no significant difference in the %EE of lipid:trehalose ratios of 1:1 and 1:2. Therefore, formulation VER-9 and VER-11 at lipid:trehalose ratio of 1:1 was selected for further studies.

In Vitro Release of HVD-NLCs

The release profile of verapamil solution from the selected HVD-NLCs formulations (VER-9 and VER-11) in SGF and SIF are shown in Fig. 7. The release profile of verapamil from the VER-9 and VER-11 formulations was significantly longer than verapamil solution in both SGF and SIF media. Verapamil was loaded as an ionic complex with dextran sulfate in the HVD-NLCs formulation. This could be the reason for the sustained release of verapamil from the HVD-NLCS. The formulations released about ~ 85% of verapamil after 48 h and the drug had a prolonged release profile up to 72 h. On the other hand, the verapamil solution released approximately 99% of verapamil within 4 h. The release profiles of the selected formulations VER-9 and VER-11 were found almost similar in SGF and SIF release media. However, the release of verapamil from VER-9 was found slightly better as compared to VER-11 in the SGF release medium. The percentage cumulative release of verapamil at 72 h from VER-9 (95.91 ± 1.40) was found significantly higher as compared to VER-11 (90.67 ± 1.16) in the SGF medium. Therefore, VER-9 was selected as a final formulation and proceeded for further investigations.

Cumulative percentage of verapamil released in a SIF (pH 6.8) and b SGF (pH 1.2) release media for 72 h

DSC Study

The DSC analysis of verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, physical mixture (including Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), lyophilized blank formulation (Placebo), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 8. Verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, and trehalose had the melting peak at 144.96 °C, 220.41 °C, 72.46 °C, 50.80 °C, and 100.13 °C, respectively. The thermograms showed that there was no significant shift in the peaks of physical mixture, lyophilized blank formulation, and HVD-NLCs formulation (VER-9) when compared to the individual peak components such as Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate. This indicated the physical compatibility between the components. The endothermic peak of verapamil at 144.96 °C was no longer seen in the thermogram of HVD-NLCs formulation (VER-9) (Fig. 8f), which could be due to verapamil that had changed to amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs matrix [16].

DSC thermograms of a Compritol 888 ATO, b Polomxamer 188, c verapamil HCl, d dextran sulfate, e trehalose, f verapamil HCl and dextran sulfate physical mixture, g physical mixture (including Compritol 888 ATO, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), h placebo, and i HVD-NLCs formulation (VER-9)

WAXS Study

The WAXS/2θ scans of pure verapamil, dextran sulfate, bulk Compritol 888 ATO®, trehalose, lyophilized blank formulation (containing Compritol 888 ATO®, oleic acid, poloxamer 188, Tween 80®, trehalose, and dextran sulfate), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 9. The diffraction peaks of pure verapamil showed specific crystalline nature of the drug at 2θ scattered angles 14.42°, 16.67°, 17.07°, 18.07°, 18.82°, 20.22°, 23.77°, and 26.27° [17]. However, the WAXS/2θ scans of HVD-NLCs formulation (VER-9) showed that the peaks of verapamil diminished indicating a decrease in the crystallinity of the drug when incorporated in the lipids of HVD-NLCs. The scan also showed the predominant peaks at 2θ scattered angles 12.47°, 15.17°, 16.87°, 21.07°, and 23.82° which possibly attributed to the crystalline structure of Compritol 888 ATO® and trehalose because none of these peaks showed similarity with any of the pure verapamil peaks [10]. The results suggested that verapamil was in the amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs formulation. The Compritol 888 ATO® revealed polymorphic crystalline transformation upon heating, whereby it changed to a more stable form, and showed reduced intensity peaks at 21.1° and 23.3° in the HVD-NLCs and blank formulations. The WAXS pattern of pure dextran sulfate indicated its amorphous form.

X-ray patterns of a lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9), b lyophilized blank formulation, c trehalose, d dextran sulfate, e verapamil HCl, and f Compritol 888 ATO

Electron Microscopic Examinations

The particle shape and size of the HVD-NLCs formulation (VER-9) were examined using the electron microscope. The liquid preparation of HVD-NLCs formulation (VER-9) observed under transmission electron microscope (TEM) showed that the particles had a spherical shape with the size less than 200 nm (Fig. 10). In contrast, observation under scanning electron microscope (SEM) revealed that the nanoparticles no longer had a spherical shape following lyophilization of the formulation without trehalose. However, the cryoprotective effect of trehalose could be seen when it was incorporated in the HVD-NLCs formulation (VER-9). The SEM image indicated that the trehalose helped to protect the structure of the nanoparticle to such extent when compared to the lyophilized formulation without the cryoprotectant (Fig. 11).

TEM image of VER-9 before lyophilization

SEM images of VER-9 formulation a without trehalose; ㄴ with trehalose

Cellular Uptake Study of HVD-NLCs

Caco-2 cells have been extensively used to study drugs intestinal cellular uptake [18]. The Caco-2 cells lines is spontaneously differentiating to form monolayer which has significant morphological and biological resemblance to the intestinal epithelium [19]. Several researchers have reported the in vitro cytotoxicity studies of Compritol ATO 888® [20], oleic acid [21, 22], Tween 80® [23, 24], and poloxamer 188 [25]. These substances were used as excipients in the optimized formulation of HVD-NLCs (VER-9). Based on their finding, these excipients were safe within the concentration used, the cell line type, and cell density that have been employed in the present study. The concentration of verapamil in the samples of VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex used in the cellular uptake study was in the range of 10.03 μg/200 μL to 30.1 μg/200 μL. It was found that the verapamil cellular uptake was increased with increasing the verapamil concentration in the samples. The cellular uptake values of verapamil from VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex were increased from 6.45 ± 2.62 to 15.92 ± 4.78 μg, 0.89 ± 0.28 to 1.46 ± 0.65 μg, and 0.064 ± 0.019 to 0.118 ± 0.003 μg, respectively (Fig. 12). The verapamil cellular uptake from the VER-9 formulation was 10.90- and 134.91-fold higher than the verapamil solution and verapamil-dextran complex, respectively. The results indicated that verapamil was passively transported from HVD-NLCs, verapamil solution, and verapamil-dextran complex in the caco2-cells. A similar finding of higher cellular uptake of drugs from a lipid-based nanoformulation was reported [26].

In vitro model of Caco-2 cell line showing cellular uptake of HVD-NLCs (VER-9), verapamil solution, and verapamil-dextran complex (mean ± SD, n =3)

Caco-2 cells act similarly as cell in animals when stimulated by fatty acid. van Greevenbroek et al. suggested that the incorporation of long-chain unsaturated fatty acids (e.g., oleic acid and linoleic acid) into the Caco-2 cells stimulate the secretion of very low-density lipoproteins (VLDL) and chylomicrons. In contrast, administration of saturated fatty acids primarily secretes intermediate- and low-density lipoproteins (IDL and LDL) [27]. Similar findings of increasing chylomicron secretion by the long-chain fatty acids were also reported by Caliph et al. in animal model [28]. In the present investigation, the long-chain fatty acids (Compritol 888 ATO® and oleic acid) used in the preparation of the HVD-NLCs may also stimulate the secretion of chylomicron, and hence increase the cellular uptake of the model drug.

Stability Study

The lyophilized VER-9 formulation was found stable for 6 months at refrigerated condition (5 ± 3 °C) (Table 6). There were no significant differences in the PS, PDI, ZP, and %EE after 6 months of stability study at storage temperature of 5 ± 3 °C. However, the VER-9 formulation was not stable after 1-month storage at the temperatures of 25 ± 2 °C/60 ± 5%RH and 40 ± 2 °C/75 ± 5% RH. The PS and PDI were increased significantly, while the total drug content decreased significantly. After 1 month of stability study, the samples were not measurable due to aggregation and sticky behavior of the nanoparticles.