아밀로이드-β(Aβ) 플라크의 침착과 신경독성 활성산소종(ROS)의 형성은 알츠하이머병(AD)의 중요한 병리학적 특징입니다. 여기에서 셀레늄 나노 입자의 고유한 Aβ 흡수 특성을 천연 항산화제인 클로로겐산(CGA)과 결합하여 CGA@SeNP를 형성하는 새로운 전략이 보고되었습니다. 시험관 내 생물학적 평가는 CGA가 Aβ40 응집체에 의해 유도된 ROS를 제거할 수 있지만 Aβ40 응집체에 의해 유발된 Aβ40 응집체 및 세포막 손상을 억제하지 않는 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, CGA@SeNPs는 Aβ40 응집에 대한 향상된 억제 효과를 보여주고, 더 중요하게는 Aβ 응집 유도 세포 사멸로부터 PC12 세포를 보호합니다. CGA@SeNPs는 장기간 사용 시 Aβ40 독성을 줄이는 데 CGA보다 더 효율적이라고 믿어집니다.
<섹션 데이터-제목="배경">알츠하이머병(AD)은 진행성 인지장애와 신경세포 소실을 특징으로 하는 비가역적인 진행성 신경퇴행성 질환이다[1]. 뇌에서 세포외 아밀로이드 플라크의 축적은 AD에서 흔한 병리학적 특징이라는 것이 이제 널리 받아들여지고 있다[2, 3]. 플라크는 아밀로이드-β(Aβ) 단백질의 잘못된 접힘 및 응집을 포함합니다[4]. 알츠하이머병 발병에서 Aβ 원형섬유 또는 올리고머의 정확한 역할은 완전히 이해되지 않았지만, 축적된 증거에 따르면 대부분이 신경 기능 장애 및 사망에 책임이 있는 독성 종이라는 것을 암시합니다[5,6,7,8]. 더욱이, Aβ 응집체는 이미 알츠하이머병 환자의 뇌에 존재합니다. 이러한 응집체는 계속해서 신경독 활성 산소 종(ROS)을 형성하여 DNA, 지질 및 단백질과 같은 세포 구성 요소의 일련의 손상을 유발하고 AD에서 산화 스트레스를 유발할 것입니다[9]. 뉴런 손상은 일반적으로 학습 및 기억력 결핍을 초래합니다. 따라서, 아밀로이드 β 응집 및 활성 산소 종 형성을 억제하는 것은 알츠하이머병의 병리를 예방하거나 완화하기 위한 유망한 치료 표적이 될 수 있다고 생각됩니다.
나노물질은 작은 크기, 넓은 표면적, 높은 반응성과 같은 독특한 물리화학적 특성을 가지고 있습니다. 최근 연구에서는 적절한 표면 변형을 통해 나노입자(NP)가 AD에서 약물 전달, 영상화 및 치료 응용을 위한 도구로 사용될 수 있다고 강조했습니다[10,11,12]. 일반적으로 NP는 표면적이 넓어 흡착력이 뛰어납니다. 특히, Aβ는 Aβ의 세동 과정을 지연시키기 위해 일부 NP에 결합할 수 있습니다. 예를 들어, 폴리옥소메탈레이트에 대한 Aβ 단량체의 결합은 자유 단량체의 농도를 낮추고 평형을 피브릴화로부터 멀어지게 할 것입니다[13]. 이러한 나노 물질 중에서 셀레늄 나노 입자(SeNPs)는 간단한 준비 및 안정성과 같은 생물 의학 응용 분야에 적합하도록 만드는 몇 가지 기능을 표시합니다. 셀레늄은 세포 산화 환원 조절, 해독 및 면역 체계 보호에 중요한 역할을 하는 필수 미량 원소입니다[14]. 따라서 무기 및 유기 셀레늄 화합물에 비해 SeNP는 생체 적합성이 우수하고 독성이 낮습니다[15]. 오늘날, NP의 표면 변형은 NP와 Aβ 간의 결합 친화도를 촉진하고 접합된 분자의 생화학적 특성을 개선하는 데 도움이 됩니다. 우리의 이전 연구는 SeNP 표면에 항-아밀로이드 펩티드(LPFFD)를 접목함으로써 SeNP의 항-아밀로이드 능력을 더욱 향상시킬 수 있음을 발견했습니다[12]. 그러나 이들 연구의 대부분은 표면 개질 후 나노입자의 항산화 능력에 초점을 맞추지 않았다.
클로로겐산(CGA)은 사과, 배, 베리와 같은 과일의 주요 폴리페놀 성분이며 특히 커피에 풍부합니다[16]. CGA는 항암, 항염, 항박테리아와 같은 많은 약리학적 특성을 가지고 있습니다[16]. 특히 CGA는 항산화 및 신경보호 활성이 있어 알츠하이머병 치료에 적용할 수 있다[17, 18]. 그러나 Aβ 응집에 대한 CGA의 효과는 보고된 적이 없습니다. 또한 CGA는 생체이용률과 안정성이 낮아 사용이 제한되고 위장관에서 흡수된 CGA의 3분의 1만이 혈액순환에 도달한다[19]. 많은 연구에서 NP의 크기가 작기 때문에 흡입, 섭취 및 순환을 통해 많은 기관으로의 수송을 통해 혈류에 직접 들어갈 수 있다고 보고했습니다. 따라서 이 문제를 해결하기 위해 우리는 CGA의 잠재적 치료 효능을 개선하기 위해 SeNPs(CGA@SeNPs)에 CGA의 결합을 탐구했습니다. 이러한 맥락에서, 이 연구의 목적은 항-Aβ 응집 및 항산화에서 CGA@SeNPs의 잠재적인 치료 효능을 조사하는 것이었다. 우리가 아는 한, 알츠하이머 치료에 CGA@SeNPs를 사용한 이전 보고는 없습니다.
Aβ40은 GL Biochem Ltd.(Shanghai, China)에서 합성되었습니다. 이산화셀레늄(Na2 SEO3 ), NaBH4 , 티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(MTT), 티오플라빈 T 및 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. CGA는 Aladdin(중국 상하이)에서 구입했습니다. Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM), 태아 소 혈청(FBS) 및 말 혈청은 Gibco(Life Technologies AG, Switzerland)에서 얻었습니다. PC12 세포(rat pheochromocytoma, American Type Culture Collection)를 5% FBS 및 10% 말 혈청이 보충된 DMEM 배지에서 37°C, 5% CO2에서 배양했습니다. 37°C의 습한 환경
첫째, 25mM CGA, 0.1M Na2의 스톡 솔루션 SEO3 및 0.1M NaBH4 준비했습니다. 그런 다음 Na2의 200μL 분취량 SEO3 용액을 다양한 부피의 CGA와 혼합하고 반응물의 농도 비율은 Na2 SEO3 CGA에 대한 비율은 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 및 1:8이었습니다. 그 후, 200μL의 0.1M NaBH4 혼합물에 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 용액의 색상이 빨간색으로 변경되었습니다. 초과 CGA 및 Na2 SEO3 투석으로 제거했습니다. 우리는 Na2의 최고의 농도 비율을 발견했습니다. SEO3 CGA는 1:6이었습니다.
준비된 CGA@SeNPs는 투과 전자 현미경(TEM; Hitachi, H-7650), 푸리에 변환 적외선 분광기(FT-IR, Equinox 55 IR 분광기) 및 UV-vis 분광기(Carry 5000 분광 광도계)로 특성화되었습니다. 크기 분포는 Zetasizer Nano ZS 입자 분석기(Malvern Instruments Limited)에 의해 결정되었습니다. 나노입자의 형광은 JASCO FP6500 분광형광계(λ 예 =350nm).
하이드록실 라디칼, 2,29-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS + ) 및 CGA 및 CGA@SeNPs의 슈퍼옥사이드 음이온 소거 활성을 상업용 키트(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)로 분석했습니다. 샘플의 환원력은 다음과 같이 측정되었습니다. 2mL의 CGA 또는 CGA@SeNPs를 2mL의 인산염 완충액(0.2mol/L, pH 6.6) 및 2mL의 K3와 함께 인큐베이션했습니다. Fe(CN)6 (1%, w /v ) 50°C에서 20분 동안 그 후, 2.5mL의 트리클로로아세트산(10%, w /v ) 및 3000rpm에서 10분 동안 원심분리합니다. 2ml의 상등액을 2mL의 증류수 및 1mL의 FeCl3과 혼합했습니다. (0.1%, w /v ) 실온에서 10분 동안 마지막으로 흡광도는 700nm에서 측정되었습니다. 비타민 c(Vc)는 항산화 활성 분석에서 양성 대조군으로 사용되었습니다.
H2 O2 Aβ40의 생성은 DCFH-DA에 의해 분석되었습니다. Beyotime Institute of Biotechnology(중국 상하이)에서 구입한 DCFH-DA 스톡 솔루션(1mM) 4 마이크로몰의 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 완충액(20mM Tris-HCl/150mM NaCl, pH 7.4)에서 준비했습니다. 20, 40, 60μg/mL CGA@SeNPs/CGA가 있거나 없는 35μM Aβ40을 포함하는 샘플 용액을 37°C에서 3일 동안 배양했습니다. Ascorbate(10μM)를 각 샘플에 첨가하고 1시간 동안 추가로 배양했습니다. DCFH-DA(20μL, 100μM) 및 HRP(2μL, 0.04μM)를 샘플 용액(10μL)에 추가하여 샘플 분석을 수행했습니다. 여기 및 방출 파장이 488 및 525nm인 형광 스펙트럼은 JASCO FP6500 분광형광계로 측정되었습니다.
Aβ40 세동의 동역학은 염료 thioflavine T(ThT)를 사용하여 감지되었습니다. 간단히 말해서, 35μM Aβ40을 0~5일 동안 37°C에서 20, 40, 60μg/mL의 CGA@SeNPs/CGA와 함께 배양했습니다. 매일 50μL의 용액을 꺼내서 200μL ThT 용액(50mM PBS 중 15μM ThT, pH 7.4)에 첨가했습니다. 그러면 ThT의 여기가 440 nm이고, 490 nm의 방출 파장이 기록되었습니다.
CGA@SeNPs/CGA의 존재 또는 부재하에 Aβ40의 형태는 TEM(Hitachi, H-7650)에 의해 관찰되었다. ThT 형광 분석과 동일한 방법으로 샘플을 준비했습니다. 3일의 인큐베이션 후 10분 동안 탄소 코팅된 구리 그리드에 10μL의 샘플 용액이 나타났습니다. 그런 다음 각 그리드를 1.5%(w /v ) 인텅스텐산(pH 7.4)을 넣고 건조시킵니다.
Aβ40에 대한 나노입자의 결합도 TEM에 의해 확인되었다. 먼저 35μM Aβ40을 3일 동안 배양하여 섬유를 형성했습니다. 그런 다음 20μg/mL 나노입자를 사전 인큐베이션 용액에 추가하고 6시간 더 인큐베이션했습니다. 그 후 이 샘플을 TEM에서 검사했습니다.
공명 광산란(RSL)은 Yu et al. [20] 약간의 수정이 있습니다. 일정량의 Aβ40 분산액을 H2로 1mL로 희석했습니다. O, CGA@SeNPs의 최종 농도는 0.05에서 0.45μg/mL까지 다양했습니다. 혼합물을 10분 동안 인큐베이션했습니다. RLS 강도는 여기 및 방출 모노크로메이터(Δλ =0 nm) 200~800nm 여기 및 방출 슬릿 폭은 모두 5nm로 설정되었습니다.
세포 생존력은 MTT 분석을 사용하여 분석되었습니다. PC12 세포는 FBS가 없는 신선한 배지에서 96-웰 플레이트에 웰당 5000개 세포의 밀도로 플레이팅되었습니다. Aβ(35μM)는 60μg/mL CGA@SeNPs/CGA와 함께 또는 없이 3일 동안 공동 인큐베이션되었습니다. 그 후, 세포를 추가로 72시간 동안 이 샘플로 처리했습니다. 인큐베이션 후, Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation assay(Promega) 설명서에 따라 세포를 웰당 10μL MTT로 처리했습니다. 젖산 탈수소효소(LDH)의 방출은 상업용 검출 키트를 사용하여 분석되었습니다. PC12 세포를 위와 같이 처리하였다. 처리가 끝나면 96웰 플레이트를 1500×g에서 원심분리했습니다. 10분 동안 상등액의 LDH 활성은 제조업체의 지침에 따라 측정되었습니다.
Aβ40-유도된 세포내 ROS 생성에 대한 CGA@SeNPs/CGA의 효과는 DCFH-DA 분석에 의해 모니터링되었다. PC12 셀(1 × 10 5 per well) MTT assay와 동일한 방법으로 처리하였다. 그런 다음, 세포를 PBS로 두 번 세척하고 DCFH-DA(10mM)와 함께 37°C에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 세포 내 ROS 수준은 각각 488 nm 및 525 nm에서 여기 및 방출 파장으로 형광 현미경(배율 ×200)으로 조사되었습니다. 세포 내 ROS 수준을 측정하기 위해 동일한 방식으로 세포를 처리하고 원심분리에 의해 수확하고 PBS에 재현탁시켰다. 그런 다음 세포를 유세포 분석기로 분석했습니다.
PC12 세포는 MTT 분석과 동일한 방식으로 처리하였다. 그 후, 챔버 슬라이드의 세포를 3.7% 포름 알데히드로 고정하고 PBS 중 0.1% Triton X-100으로 투과화했습니다. 염색 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 말단 전이효소 dUTP nick end labeling(TUNEL) 분석 키트(KeyGen BioTECH, Nanjing, China)를 사용하여 수행되었습니다. 이미지는 형광 현미경을 사용하여 캡처되었습니다(배율 ×200).
통계적 유의성은 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Bonferroni의 사후 검정을 사용하여 추정되었습니다. 통계적 유의성은 P로 설정되었습니다. <0.05.
이 연구에서는 CGA와 Na2의 혼합물을 환원하여 CGA@SeNPs를 합성하는 간단한 방법을 사용합니다. SEO3 NaBH4 포함 . 크기가 30~150nm인 나노입자가 세포 흡수에 더 유리했습니다[21]. TEM은 CGA@SeNPs가 약 100nm 직경의 구형 구조를 가지고 있음을 보여주었으며(그림 1a), 이는 CGA@SeNPs의 크기가 생물학적 응용에 적합했음을 시사합니다. 원소 조성 분석은 Se, C 및 O가 CGA@SeNPs의 에너지 분산 X선 분광법(EDX) 그래프에서 쉽게 발견될 수 있음을 보여주었습니다(그림 1b). Se 원자의 신호는 CGA의 강한 C 원자 신호(52.60%) 및 O 원자 신호(1.50%)와 함께 30.00%로 CGA@SeNP를 성공적으로 준비했음을 나타냅니다.
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CGA@SeNP의 특성화. 아 CGA@SeNPs의 TEM 이미지. ㄴ CGA@SeNPs의 EDX 분석. ㄷ CGA@SeNPs의 UV-vis 흡수 스펙트럼. d CGA@SeNPs의 방출 스펙트럼
CGA의 UV-vis 흡수 스펙트럼은 334nm에서 특징적인 흡수 피크를 보여줍니다(그림 1c). 그러나 CGA@SeNPs의 UV-vis 흡수 스펙트럼에서 약간의 이동이 관찰되었으며 흡수 피크가 337nm로 변경되었습니다. CGA 및 CGA@SeNPs의 방출 파장은 형광 분광 광도계로 감지되었습니다. CGA의 방출 파장은 442.9nm였으며 CGA@SeNPs에서 437.5nm로 이동했습니다(그림 1d). 이 결과는 SeNPs 표면에 CGA가 존재함을 확인했습니다. CGA@SeNPs의 FT-IR 스펙트럼은 CGA가 나노복합체의 일부를 형성했다는 증거를 제공합니다. OH 스트레칭 주파수는 3353.99cm −1 에 있습니다. CGA의 FT-IR 스펙트럼(추가 파일 1:그림 S1) 그러나 CGA@SeNPs의 이 특성 피크는 3419.00cm −1 로 변경되었습니다. . 이동은 CGA가 -OH 그룹을 통해 SeNPs의 표면에 접합되었음을 확인했습니다.
생리적 조건에서 CGA@SeNPs의 안정성은 향후 응용 프로그램을 평가하는 데 중요합니다. 따라서 PBS(pH 7.4)에서 CGA@SeNP의 크기 분포를 실온에서 7일 동안 모니터링했습니다. 추가 파일 1:그림 S2에서 볼 수 있듯이 CGA@SeNP의 크기는 평균 크기가 약 100nm로 안정적으로 유지되었으며 CGA@SeNP는 7일 이내에 PBS에서 우수한 수분산성을 유지했습니다. CGA@SeNPs의 유리한 안정성은 의료 분야에서의 잠재적인 응용을 뒷받침합니다.
침착된 Aβ는 미세아교세포를 활성화하고 미세아교세포를 자극하여 ROS와 같은 신경독을 생성하여 뇌에 심각한 신경 손상을 유발할 수 있습니다[22]. 또한 과산화수소(H2)와 같은 ROS O2 ) Aβ 응집체에 의해 생성될 수도 있습니다[23]. 따라서 우리는 CGA@SeNPs의 항산화 활성과 Aβ 응집체 유도 H2에 대한 CGA@SeNPs의 효과를 조사했습니다. O2 형성. 추가 파일 1:그림 S3에서 볼 수 있듯이 CGA@SeNP는 농도 의존적 방식으로 라디칼에 대한 강력한 소거 활성을 가지고 있습니다. 농도가 60μg/mL에 도달하면 하이드록실 라디칼, ABTS + , 및 초과산화물 음이온 소거 활성은 각각 70.3%, 95.2% 및 95.1%에 도달했습니다. 분명히 CGA@SeNPs의 환원력은 농도가 증가함에 따라 증가했습니다. 모든 샘플 중에서 CGA@SeNPs는 하이드록실 라디칼인 ABTS + 에서 강력한 환원력과 소거력을 나타냈습니다. , 및 Vc 및 CGA보다 슈퍼옥사이드 음이온. 이러한 결과는 CGA@SeNP가 더 높은 항산화 활성을 보여 AD에서 활성 산소를 소거하는 데 도움이 될 수 있음을 시사했습니다. 주목해야 할 점은 SeNPs에 대한 CGA의 변형이 항산화 활성에 시너지 효과를 발휘한다는 것입니다.
Aβ 매개 H2에 대한 CGA@SeNPs의 효과 O2 H2의 생성을 나타낼 수 있는 DCFH-DA 분석[24]에 의해 생성이 조사되었습니다. O2 CGA@SeNP의 존재 여부에 관계없이 Aβ로부터. 그림 2와 같이 CGA@SeNPs와 CGA는 H2를 감소시켰습니다. O2 용량 의존적 방식으로. 더 중요한 것은 CGA@SeNPs를 포함하는 Aβ 샘플이 H2 O2 CGA를 함유한 것보다 CGA@SeNPs의 높은 항산화 활성이 Aβ-유도 H2 감소에 CGA보다 더 많은 효과를 나타냄 O2 세대.
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H2 O2 나노 입자의 존재 또는 부재하에 Aβ40의 반응으로부터 생성. Aβ =35μM, 나노입자/CGA =20, 40, 60μg/mL
CGA의 항산화 활성은 잘 알려진 특성이지만 CGA의 항아밀로이드 응집 활성은 아직 알려져 있지 않습니다. AD 치료 적용을 위한 CGA@SeNPs의 가능성을 확인하기 위해 Aβ 응집에 대한 CGA@SeNPs의 억제 효과를 먼저 ThT 기반 형광 분석법으로 조사했습니다. 시간 [25]. 도 3a에 도시된 바와 같이, Aβ40은 자발적으로 응집되었고 Aβ 원섬유의 형광은 배양 3일까지 안정기에 도달할 때까지 점진적으로 증가하였다. 우리는 CGA@SeNPs가 농도가 증가함에 따라 천천히 아밀로이드 단백질을 응집시킬 수 있음을 관찰했습니다. Aβ40 섬유의 형광 강도는 60μg/mL CGA@SeNP와 함께 배양된 Aβ40의 형광 강도보다 약 2배 더 높았습니다. 그러나 ThT 형광 강도의 변화는 CGA에서 거의 또는 전혀 관찰되지 않았으며, 이는 CGA가 Aβ40 응집을 약간만 억제함을 시사합니다.
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Aβ40 세동에 대한 CGA@SeNPs의 억제 효과. 아 0일에서 5일까지 나노입자/CGA의 존재 또는 부재하에 Aβ40 원섬유 형성의 ThT 형광. Aβ40 =35μM, 나노입자/CGA =20, 40, 60μg/mL. ㄴ 3일 동안 나노 입자 또는 CGA와 함께 또는 없이 배양된 Aβ40의 형태. Aβ40 =35μM, 나노입자/CGA =60μg/mL
CGA 또는 CGA@SeNP의 유무에 관계없이 배양된 Aβ40의 형태학적 변화는 그림 3b에 나와 있습니다. 3일 동안 배양된 Aβ40은 풍부한 섬유소를 형성한 반면 CGA@SeNPs(60μg/mL)가 있는 경우 섬유소가 형성되지 않았습니다. 예상대로 CGA는 Aβ 섬유소 형성을 유의하게 억제하지 않은 반면, CGA 처리된 Aβ40 용액에서는 다량의 응집체가 관찰되었으며 이는 ThT 형광 분석과 일치했습니다. 이러한 결과는 SeNP에서 CGA를 수정한 후 β-시트 형성을 분명히 감소시킬 수 있음을 나타냅니다.
Aβ 응집에 대한 CGA@SeNPs의 억제 활성을 더 잘 이해하기 위해 Aβ40에 대한 CGA@SeNPs의 결합 친화도를 조사했습니다. 첫째, 초미세 구조 수준에서 Aβ40 섬유에 대한 나노 입자의 결합을 평가하기 위해 Aβ40 섬유를 CGA@SeNP와 함께 배양했습니다. 우리는 결합되지 않은 부유 나노 입자의 존재 없이 SeNP의 표면에 피브릴이 특이적으로 결합하는 것을 관찰했습니다(그림 4a).
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Aβ40에 대한 CGA@SeNP의 친화도. 아 Aβ40 섬유에 대한 CGA@SeNPs의 결합 능력. 수행된 Aβ40 섬유를 CGA@SeNP와 함께 배양하고 TEM에서 검사했습니다. Aβ40 =35μM, CGA@SeNPs =60μg/mL. ㄴ Aβ40 단량체에 대한 CGA@SeNP의 친화도 및 지정. 다른 농도의 CGA@SeNPs가 존재할 때 Aβ40 단량체의 RLS 스펙트럼. Aβ40 =600nM, 나노입자 농도, 1-9:0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4μg/mL. ㄷ CGA@SeNPs의 RLS 스펙트럼, 나노입자 농도, 1–9:0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4 및 0.45μg/mL
공명 광 산란(RLS)은 탄성 광 산란을 기반으로 하는 강력한 광학 기술이며 용액에서 나노 입자의 크기, 모양 및 분포를 연구하는 데 널리 적용되었습니다[26]. 따라서 우리는 다음으로 RLS를 사용하여 Aβ40 단량체와 CGA@SeNP 간의 상호 작용을 분석했습니다. 그림 4b, c에서 볼 수 있듯이 NP의 RLS 강도는 동일한 농도의 600nM Aβ40 단량체와 함께 배양된 NP의 RLS 강도보다 훨씬 낮습니다. CGA@SeNPs가 Aβ 분자에 노출되면 Aβ는 아미노산 측쇄를 포함하는 N-donor를 통해 SeNPs 표면에 결합하여 Se-N 결합을 형성하는 것으로 여겨집니다[27]. CGA@SeNPs에서 Aβ 분자의 접합체가 형성되면 산란 크기가 증가하여 시스템의 RLS 강도가 향상됩니다(그림 4b). ThT 분석 및 TEM의 결과와 결합하여 큰 CGA@SeNP 표면과 Aβ40 단량체 사이의 상호 작용은 단량체 간의 직접 접촉을 차단하여 핵 생성 및 원섬유 성장에 불리한 조건을 초래할 수 있다고 추측됩니다. 따라서 CGA@SeNPs는 Aβ40 응집을 억제하는 데 CGA보다 더 많은 효과를 발휘합니다.
PC12 세포에서 CGA@SeNP의 존재 또는 부재하에 Aβ40의 세포독성을 MTT 분석에 의해 조사하였다. 그림 5a는 Aβ40 섬유가 PC12 세포에 독성을 나타내어 세포 생존율을 53%로 감소시켰음을 보여줍니다. CGA@SeNPs의 존재하에, 세포의 생존은 약 95%까지 증가하였다. 그러나 CGA로 세포를 전처리하면 세포의 생존이 66%로 약간 증가했습니다. 또한 CGA@SeNP는 PC12 세포에 독성이 없었으며(추가 파일 1:그림 S4), 이는 CGA@SeNP가 Aβ40의 신경독성을 억제할 수 있음을 시사합니다.
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CGA@SeNPs/CGA와 함께 또는 CGA 없이 배양된 Aβ40의 신경독성. 아 MTT 분석에 의해 테스트된 CGA@SeNPs 또는 CGA의 존재 하에서 Aβ40에 대한 PC12 세포의 세포 생존력. ㄴ 배양 배지로의 LDH 방출. Aβ40 =35μM, CGA@SeNPs/CGA =60μg/mL
Aβ는 우선적으로 세포 표면에 고정되어 세포막 손상을 유발하는 것으로 보고되었다[28]. 따라서 NP/CGA의 존재 또는 부재하에 Aβ40에 노출된 후 세포막 무결성을 결정하기 위해 세포 배양 배지에서 세포외 LDH 수준을 측정했습니다. 이 분석에서 높은 수준의 LDH는 세포막의 손상을 반영합니다. 도 5b에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 Aβ40에 노출된 후 LDH 방출이 142%로 증가하였다. MTT의 결과에 따르면 CGA@SeNPs의 존재하에서 LDH 방출은 정상 수준으로 감소되었다. 흥미롭게도 우리는 CGA가 LDH 농도를 감소시키지 않는다는 것을 관찰했으며, 이는 CGA가 Aβ 응집체에 의해 유도된 세포막 손상으로부터 PC12 세포를 막을 수 없음을 시사합니다.
Aβ 응집체는 AD에서 산화 스트레스를 유발할 수 있는 ROS를 생성할 수 있습니다[29]. CGA@SeNPs의 항산화 및 항응집 특성으로 인해 우리는 이것이 PC12 세포에서 Aβ40에 의해 유도된 ROS 생성을 감소시킬 수 있다고 가정했습니다. 따라서 Aβ40 응집체 유도 ROS 생성에 대한 NP의 효과는 DCFH-DA에 의해 측정되었습니다. DCF는 비형광 DCFH-DA와 ROS의 반응에서 파생된 형광 마커로, Aβ40 응집체에 의해 유도된 ROS의 생성을 나타낼 수 있습니다. 추가 파일 1:그림 S5에서 볼 수 있듯이 Aβ40 응집체로 처리하면 처리되지 않은 세포에 비해 ROS 함량이 1.5배 이상 증가했습니다. CGA@SeNP 처리는 PC12 세포에서 DCF 형광 강도를 감소시켰으며, 이는 CGA@SeNPs가 Aβ 섬유소 유도 ROS를 정상 수준으로 감소시켰음을 나타냅니다. 흥미롭게도 CGA는 PC12 세포에서 ROS 생성을 감소시켰지만 CGA@SeNP만큼 분명하지는 않았습니다.
Aβ 원섬유에 의한 신경 세포의 사멸은 알츠하이머병 병리에서 중요한 사건이라고 보고되었습니다[30]. Aβ40 원섬유의 세포독성을 추가로 연구하기 위해 TUNEL-DAPI 공동 염색을 수행하여 Aβ40에 의해 유도된 세포 사멸에서 NP 또는 CGA의 효과를 결정했습니다. DNA 단편화는 세포 사멸의 특징이며 TUNEL을 사용하여 세포 사멸의 초기 단계에서 감지할 수 있습니다[31]. 그림 6에서 볼 수 있듯이 TUNEL에 의해 apoptotic nuclei가 밝은 형광 녹색으로 염색되었습니다. Aβ40은 TUNEL 염색 핵의 수를 극적으로 증가시킨 반면, CGA@SeNP 처리는 TUNEL 양성 핵의 감소를 일으켜 CGA@SeNP가 Aβ40에 의해 유도된 PC12 세포 사멸로부터 뉴런을 보호할 수 있음을 입증했습니다. 그렇지 않으면 세포의 높은 수준의 ROS도 apoptosis에 참여합니다[32]. 따라서 이러한 결과는 Aβ40에 의해 유발된 세포자멸사가 ROS 생성에 기인할 수 있음을 암시합니다. CGA가 Aβ40에 의해 유도된 세포 사멸을 감소시킬 수도 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. MTT 및 LDH 분석에서 CGA는 세포의 생존을 향상시키지 않았고 Aβ 응집체로 인한 세포막 손상을 감소시키지 않았습니다. TEM 및 ThT 분석 결과를 결합한 결과, CGA는 Aβ 응집 과정에서 활성 산소를 제거할 수 있는 항산화 특성을 가지고 있지만 Aβ 응집을 완전히 억제할 수는 없음을 발견했습니다. 따라서 CGA는 인큐베이션 용액 및 PC12 세포에서 ROS 생성을 감소시켜 ROS 유도 세포 사멸을 보호할 수 있지만 Aβ 응집체 유도 세포막 손상을 감소시킬 수는 없습니다. 세포막이 손상되면 세포 내 내용물이 주변 조직으로 누출되어 조직 손상과 염증을 유발할 수 있습니다[33]. 따라서 억제된 Aβ 응집과 활성산소 형성의 조합은 새로운 치료 방법으로 간주될 수 있습니다.
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CGA@SeNPs는 PC12 세포에서 Aβ40에 의한 세포 사멸을 방지합니다. 세포 사멸은 TUNEL-DAPI 동시 염색 분석에 의해 검출되었습니다. 정상 세포핵은 파란색으로 염색되었고, DNA 단편은 녹색으로 염색되었습니다. Aβ40 =35μM, CGA@SeNPs/CGA =60μg/mL
요약하면, CGA는 항산화 약리학적 성질을 갖지만 Aβ 세동을 억제하는 효과는 없다. SeNP에 대한 CGA의 표면 수정은 새로운 응집 방지 특성을 제공합니다. Aβ40은 CGA@SeNPs의 표면에 결합할 수 있으며, 이는 단량체 간의 직접 접촉을 차단하여 핵 생성 및 원섬유 성장에 불리한 조건을 초래할 수 있습니다. 이 경우, CGA@SeNPs는 Aβ40 응집을 억제하고, ROS를 제거하고, Aβ40 응집체에 의해 유도된 세포막 파괴 및 ROS 매개 세포자멸사로부터 PC12 세포를 보호했습니다. 그러나 CGA군에서는 Aβ 응집체가 세포 표면에 고정되어 세포막 손상을 일으키며, 이는 세포사를 초래하기도 한다. 전반적으로 CGA@SeNPs는 장기간 사용 시 Aβ40 독성을 줄이는 데 CGA보다 더 효율적입니다.
2,29-아지노비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)
알츠하이머병
아밀로이드-β
클로로겐산
2',7'-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트
Dulbecco의 수정된 Eagle 배지
에너지 분산 X선 분광기
태아 소 혈청
푸리에 변환 적외선 분광기
양 고추 냉이 과산화 효소
젖산 탈수소효소
티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드
활성 산소 종
공명 광산란 측정
셀레늄 나노입자
투과 전자 현미경
티오플라빈 T
터미널 트랜스퍼라제 dUTP 닉 엔드 라벨링
Vitamin c
나노물질
초록 헤민은 강력한 철분 보충제입니다. 헤민의 적용 가능성의 주요 제한 사항은 매우 낮은 수용해도와 생체 이용률입니다. 이 연구의 목적은 용해도가 향상된 헤민 나노 입자를 제조하는 것입니다. 전달 전자 현미경 이미지는 초기 농도가 다른 헤민 나노 입자를 보여줍니다. hemin의 (0.1 및 0.5 mg/mL)는 각각 올챙이 모양(약 200 nm의 머리와 100 nm의 꼬리)과 구 모양(50–100 nm)이었습니다. 더욱이, 헤민 나노입자는 유리 헤민보다 더 높은 용해도를 나타내었다. 구형 나노입자의 용해도는 25 °C에서 순수한
초록 종양 특이적 억제제의 전달은 암 치료의 도전입니다. 항체로 변형된 나노입자는 로딩된 약물을 특정 종양 관련 항원을 과발현하는 종양 세포에 전달할 수 있습니다. 여기에서 우리는 간세포 암종에서 과발현되는 막 단백질인 글리피칸-3(GPC3 +)에 대한 항체 hGC33으로 변형된 소라페닙이 로딩된 폴리에틸렌 글리콜-b-PLGA 고분자 나노입자를 구성했습니다. 우리는 hGC33 변형 NP(hGC33-SFB-NP)가 GPC3+를 표적으로 한다는 것을 발견했습니다. 간세포암종(HCC) 세포는 HCC 세포 표면의 GPC3에 특이적으로 결
