SPIO는 인터루킨-1β와 관련된 나노보조제 효과에 영향을 미치는 DC 및 음이온성 SPIO의 교차 제시 및 마이그레이션을 향상시킵니다.

방법 및 자료

SPIO 준비

SPIO를 준비하기 위해 이전에 보고된 바와 같이 손쉬운 공침법을 사용하였다[24]. 간단히 말해서, FeCl₃의 혼합 용액 및 FeSO₄ (몰비 Fe ³⁺ :Fe ²⁺ =2:1)을 질소 분위기에서 제조하고 37°C에서 30분 동안 강력하게 교반했습니다. Fe₃의 검은색 침전물 O₄ 나노 입자가 형성되고 자기 분리를 이용하여 즉시 증류수로 5회 세척하였다. Fe₃ O₄ 그런 다음 pH 3에서 3mg/mL의 농도로 증류수에 분산되었습니다. 최종적으로 현탁액은 95°C에서 (공기와 함께) 통기되었고 갈색 SPIO가 분리되었습니다.

DMSA로 코팅된 SPIO(SPIO/D ⁻ ) 및 APTS로 코팅된 SPIO(SPIO/A ⁺ ) SPIO를 meso-2,3-dimercaptosuccinic acid(DMSA) 및 3-aminopropyltrimethoxysilane(APTS)으로 각각 코팅하여 제조했습니다. SPIO/D용 ⁻ , 100mL의 SPIO 용액에 1:40 몰비의 DMSA 수용액을 첨가하였다. 지속적으로 교반하면서 4시간 동안 반응시킨 후 SPIO/D ^- 50°C에서 500rpm의 속도로 분리되었습니다. SPIO/A ⁺ 용 , APTS를 5시간 동안 격렬하게 교반하면서 0.2:1의 몰비로 SPIO 용액에 첨가했습니다. 그 후 영구자석으로 침전물을 녹이고 탈이온수로 세척한 후 초음파를 이용하여 용액을 처리하였다. 생성된 용액을 물로 반복해서 세척하고 SPIO/A ⁺ 최종적으로 진공 상태에서 37°C에서 분말로 건조되었습니다.

쥐

C57BL/6 마우스 및 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)-형질전환 C57BL/6 마우스는 난징 대학의 모델 동물 연구 센터에서 구입하고 난징 대학의 중앙 연구소에서 특정 무병원체(SPF) 조건에 수용했습니다. 모든 동물 실험은 중국 난징 대학교 의과대학 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

세포 배양

Murine DC는 이전에 설명한 대로 마우스 골수에서 생성되었습니다[25]. 간단히 말해서, 8주령 C57BL/6 마우스의 골수 단핵구를 대퇴골 및 경골에서 분리했습니다. 이어서, 세포를 RPMI-1640(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 10% 소 태아 혈청(FBS), 10ng/mL 쥐과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)와 함께 배양했습니다.; Gibco, USA) 및 1ng/mL 뮤린 인터루킨-4(IL-4, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA). 배양 배지는 2일마다 새로운 배지로 교체되었습니다. 미성숙 DC는 일반적으로 6일째에 수집되었습니다. EGFP-DC는 위에서 언급한 방법에 따라 EGFP-트랜스제닉 C57BL/6 마우스에서 파생되었습니다.

해동된 냉동 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 완전 배지, 즉 X-VIVOTM 15(Lonza Group Ltd., Basel, Switzerland) =1:1에서 밤새 쉬었다. 밀도 구배 원심분리 후 PBMC를 4시간 동안 배지에 현탁했습니다. 부착 세포의 인간 DC는 인간 GM-CSF(100ng/mL; R&D Systems, 미네소타주 미니애폴리스) 및 인간 IL-4(10ng/mL, PeproTech, Rocky Hill, 뉴저지, 미국). 2일과 4일에 배지의 절반을 교체했습니다. 5일에 미성숙 인간 DC를 수확했습니다. 사이토메갈로바이러스 Epstein-Barr 바이러스 및 인플루엔자 바이러스(CEF) 특이적 T 세포는 MHC를 포함하는 CMX 배지에서 배양된 부유 세포에서 파생되었습니다. -CEF 펩타이드(20ng/mL, Panatecs, Heilbronn, Germany, PA-CEF-002)를 약 48시간 동안 제한했습니다. CEF 특이적 T 세포는 12일 동안 CMX 배지에서 1000 U/mL 인간 IL-2(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA, 200-02)로 확장되었습니다. IL-2의 경우 배지를 3일마다 새 배지로 교체했습니다.

특성화

SPIO의 형태와 크기는 투과 전자 현미경(TEM, Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA)을 사용하여 결정되었습니다. X선 회절(XRD) 패턴을 사용하여 촉매의 스펙트럼을 확인했습니다. 제타 전위 분석은 또한 상이한 폴리머로 코팅된 나노입자의 표면 전하를 결정하기 위해 측정되었다. SPIO/A ⁺ 및 SPIO/D ⁻ 나노 입자는 3에서 8 범위의 pH 값으로 준비되었습니다. 제타 전위 측정은 zetasizer Nano ZS90 전위 분석기(Malvern, UK)로 이루어졌습니다. 나노입자의 자기 특성은 진동 샘플 자력계(Lakeshore 7407)를 사용하여 37°C에서 분석되었습니다.

CPRG 분석

B₃ Z T-세포주(CD8 ⁺ T 세포 하이브리도마)는 T 세포 수용체가 H-2Kb MHC-I 분자의 존재 하에 오브알부민(OVA) 258-265 에피토프와 결합할 때 LacZ 유전자를 발현할 수 있습니다. DC(2 × 10 ⁴ ) 및 OVA(100μg/mL, Sigma-Aldrich)를 SPIO, SPIO/A ⁺ 로 배양했습니다. , 또는 SPIO/D ⁻ 37°C에서 6시간 후, DC는 B₃와 공동 배양되었습니다. Z(2 × 10 ⁵ ) 밤새. 클로로페놀 레드-β-갈락토시다아제 분석(CPRG, Sigma-Aldrich, USA)은 B₃의 β-갈락토시다아제 생산을 결정하기 위해 수행되었습니다. Z 세포. 이 분석에서 595nm의 광학 밀도(OD)는 DC의 항원 교차 제시 능력을 나타냅니다.

세포 아폽토시스 분석

형광 활성화 세포 분류(FCS)를 사용하여 DC의 생존 가능성에 대한 다양한 농도의 SPIO 효과를 조사했습니다. 간단히 말해서, 미성숙 DC를 Annexin V 및 PI(Biouniquer, CHN)로 표시된 SPIO와 함께 배양하고 DC에서 Annexin V 및 PI의 발현을 FCS를 통해 조사했습니다.

생체 내 형광 강도 이미징

생체 내에서 DC의 이동을 탐색하기 위해 TNF-α(60 ng/마우스)를 양쪽 뒷다리의 발바닥에 미리 주입했습니다(n =8). 24시간 후 SPIO 라벨이 붙은 EGFP-DC(2 × 10 ⁶ ) 40μL의 인산완충식염수(PBS)를 C57BL/6 마우스의 왼쪽 발바닥에 주사하고, 동일한 수의 표지되지 않은 EGFP-DC를 오른쪽에 주사했습니다. 림프절로 이동하는 EGFP-DC의 수준을 조사하기 위해 Maestro 이미징 시스템(CRi, Woburn, MA, USA)이 사용되었습니다. 절개된 림프절은 484nm 여기 필터와 507nm 방출 필터를 사용하여 관찰되었습니다. 그런 다음 녹색 형광을 나타내는 형광 이미지를 Living Image 소프트웨어(v 2.50; Caliper Corporation, Newton, MA, USA)로 분석했습니다. 면역 조직 화학을 결정하기 위해 공초점 현미경 분석이 사용되었습니다. 동결된 림프절을 5μm 두께의 절편으로 절단한 다음 고정하고 절편을 녹색 형광 단백질(GFP) 항체(Invitrogen)와 배양하고 염소 Alexa Fluor 488nm 항체(Invitrogen)를 2차 항체로 사용했습니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Fluoview, Fv10i; Olympus)을 사용하여 샘플을 관찰했습니다.

체외 인간 DC 항원 교차 제시 분석

배양된 인간 DC(2 × 10 ⁴ )를 SPIO/A ⁺ 및 SPIO/D ⁻ 거대세포바이러스(CMV) pp65 단백질(1μg/mL, MACS)과 결합된 나노입자(100μg/mL)를 첨가하고 CMV pp65 단백질 및 CEF 펩티드(1μg/mL, Think 펩티드)를 대조군으로 별도로 사용했습니다. 6시간 후, CEF 특이적 T 세포(2 × 10 ⁵ )을 12시간 동안 인간 DC에 추가했습니다. Brefeldin A(10μg/ml, Sigma-Aldrich, USA)를 추가로 6시간 동안 배지에 보관했습니다. 자극 및 활성화 후, CEF-특이적 T 세포를 수집하고 CD3, CD4, CD8 및 IFN-γ(Invitrogen, USA)에 대한 인간 항체로 염색하였다. 염색 후 샘플은 맞춤형 LSR II 유세포 분석기(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)로 분석되었습니다. 수집된 데이터는 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR, USA)로 분석되었습니다.

효소 결합 면역흡착 분석

마우스 IL-1β 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) Ready SET-Go 키트(eBioscience, USA)와 인간 IL-1β ELISA 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 IL의 분비를 측정했습니다. DC에 의한 -1β. 100μL/well의 IFN-γ로 코팅된 ELISA 플레이트(Costar, USA)를 사용하여 4°C에서 밤새 항체를 포획하고 ELISA 완충액으로 차단했습니다. 그런 다음 샘플과 표준을 웰에 추가하고 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션했습니다. 비오틴화된 IFN-γ가 검출되었습니다. 샘플은 OD 설정이 450nm인 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정했습니다(BioTek, USA).

통계 분석

데이터는 Statistical Package for Social Science(SPSS 13.0, Chicago, IL, USA)를 사용하여 분석되었습니다. 결과는 평균 ± SD로 제시하였고, 대조군과 시험군 간의 차이는 일원 분산 분석, 양측 스튜던트 t로 평가하였다. 테스트 및 분산의 이중 요인 분석. *P에서의 차이 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

SPIO의 특성

합성된 SPIO의 형태와 크기는 TEM을 통해 관찰하였다. TEM 이미지는 SPIO의 평균 크기가 8.7nm이고 구형인 것으로 나타났습니다(그림 1a). XRD 분석은 표준 γ-Fe₂와 뚜렷하게 일치하는 6개의 피크를 보여주었습니다. O₃ 반사(그림 1b). 진동 자력계 결과는 얻어진 SPIO가 Fe보다 60.4emu/g의 포화 자화로 초상자성 거동을 가짐을 보여주었습니다.₃ O₄ (그림 1c). DLS 플롯은 SPIO의 크기 분포가 용액에서 22nm임을 보여줍니다(그림 1d). DC에 SPIO가 포함되어 있는지 확인하기 위해 Prussian blue 염색을 수행하여 DC에 철이 포함되어 있음을 확인했습니다(그림 1e).

SPIO의 특성화. 아 획득한 SPIO의 TEM 이미지. ㄴ 물질이 γ-Fe₂임을 나타내는 나노입자 촉매의 XRD 패턴 O₃ . ㄷ 얻어진 SPIO 및 Fe₃의 자화 곡선 O₄ 나노 입자. d SPIO의 유체역학적 직경. 이 12시간 배양 후 50μg/mL SPIO로 표시된 DC의 형태:레이블이 없는 DC 및 프러시안 블루 얼룩이 표시된 DC

SPIO 활성화 DC 교차 프레젠테이션

쥐 시스템에서 T 세포 활성화에 대한 SPIO 표지 DC의 효과를 추가로 연구하기 위해 B₃ 수준 Z T-세포 활성화는 CPRG 분석에 의해 β-갈락토시다제의 생성을 조사함으로써 결정되었다. 이 연구에서는 100μg/mL OVA의 고정 농도와 SPIO의 5가지 용량 비율(6시간 후 1, 5, 10, 25, 50μg/mL)을 채택했습니다. SPIO의 농도가 증가함에 따라 B₃의 활성화 정도 Z 세포는 점차 증가하여 25μg/mL에서 안정성에 도달했습니다(그림 2a). 다양한 농도의 SPIO로 표지된 DC의 생존 가능성이 영향을 받는지 여부를 조사하기 위해 DC 및 SPIO로 표지된 DC를 Annexin V 및 PI 염색 후 FCS를 통해 분석했습니다. 결과는 10, 25, 50μg/mL의 SPIO 농도에서 Annexin V/PI DC의 총 백분율이 크게 다르지 않은 반면 100μg/mL SPIO로 로딩한 후 세포자멸 세포의 백분율이 증가했음을 나타냅니다(그림 2b). ). 다양한 농도의 SPIO로 표지된 DC의 표면 공동자극 분자는 FCS에 의해 관찰되었습니다. CD80 및 CD86의 발현은 SPIO 표지가 없는 것과 비교하여 25μg/mL에서 감지 가능한 증가를 보였습니다(그림 2c). 25μg/mL SPIO로 표시된 DC는 다른 시점에서 세포 사멸의 변화를 나타내지 않았습니다(그림 2d). 다음 실험에서는 25μg/mL를 사용했습니다.

SPIO로 라벨링한 후 DC 교차 표시 및 생체 적합성의 영향. 아 다양한 SPIO 농도에서 강화된 DC의 교차 표시. ㄴ 다양한 농도(10, 25, 50, 100μg/mL)에서 FCS에 의해 조사된 세포자멸 DC 및 SPIO 표지 DC. ㄷ CD11c ⁺ 를 포함한 DC의 표현형 CD80 ⁺ 및 CD11c ⁺ CD86 ⁺ SPIO(10, 25, 50μg/mL)로 라벨링한 후 LPS(1μg/mL)로 자극된 DC를 양성 대조군으로 사용했습니다. d 서로 다른 시점(6, 12, 18, 24시간)에 FCS에서 검사한 25μg/mL SPIO로 로드된 세포자멸 DC

이차 림프절에서 SPIO 향상된 EGFP 신호로 EGFP-DC에 라벨 지정

EGFP-DC는 시험관 내 EGFP 형질전환 마우스에서 성공적으로 파생되었으며 공초점 형광 현미경 이미지는 거의 모든 EGFP-DC가 녹색 형광을 나타내는 것으로 나타났습니다(그림 3a). EGFP-DC의 녹색 형광이 SPIO의 영향을 받을 수 있는지 여부를 조사하기 위해 FCS를 수행했습니다. 결과는 SPIO 라벨링 후 EGFP 형광의 발현이 약화되지 않았음을 보여주었다(그림 3b, c). 그런 다음, 25μg/mL SPIO로 표지된 EGFP-DC를 C57BL/6 마우스의 오른쪽 뒷발바닥에 주사하고 표지되지 않은 EGFP-DC를 반대쪽에 주사했습니다. EGFP 신호는 각각 감시 림프절과 이차 림프절인 슬와 림프절(PLN)과 서혜부 림프절(ILN)에서 측정되었습니다. 결과는 감시 림프절에서 SPIO 표지된 EGFP-DC 및 표지되지 않은 EGFP-DC의 이동이 7일째에 피크에 도달함을 보여주었습니다. EGFP 신호의 유의한 차이는 두 그룹 간에 관찰되지 않은 반면 상당한 감소가 감지되었습니다 14일에 PLN 그룹에서. ILN 그룹에서 검출된 EGFP 신호는 4일 및 7일에 SPIO 표지 EGFP-DC 그룹의 신호와 일치하여 SPIO 표지 DC가 2차 림프로 이동했음을 나타냅니다. 노드(그림 3d–f).

SPIO로 라벨링한 후 EGFP-DC의 마이그레이션 및 위치. 아 12시간 배양 후 25μg/mL SPIO 나노입자로 표지된 EGFP-DC의 레이저 스캐닝 공초점 현미경. ㄴ , ㄷ 12시간 후 SPIO 표지 EGFP-DC의 형광 강도. 다른 날에 SPIO로 표지된 EGFP-DC의 역수혈 후 배수 림프절의 시험관 내 광학 이미징. TNF-α는 먼저 EGFP-DC의 이동을 촉진하기 위해 미리 마우스 발 패드에 주입되었습니다. d –이 SPIO가 있거나 없는 EGFP-DC를 주입한 후 여러 날에 림프절의 시험관 내 광학 이미징 및 신호 강도 분석. 에 배액 림프절의 EGFP 양성 세포가 레이저 공초점 현미경으로 검출되었습니다.

다르게 청구된 수정 SPIO 영향을 받는 Murine DC 교차 프레젠테이션

SPIO는 APTS 또는 DMSA로 코팅되었습니다. SPIO의 표면 전하를 확인하기 위해 제타 전위 특성을 측정했습니다. SPIO/A ⁺ 의 제타 전위 및 SPIO는 양수인 반면 SPIO/D ^- 의 제타 전위는 pH 값이 7일 때 용액에서 음전하를 보였다(그림 4a). 다르게 하전된 폴리머로 코팅된 SPIO로 표지된 DC의 미세구조는 TEM을 통해 관찰되었습니다. SPIO로 처리된 DC는 처리되지 않은 세포에 비해 전자 밀도가 높은 것으로 나타났고 수많은 SPIO가 세포질에 함께 클러스터링되었습니다. SPIO/A ⁺ 더 많은 양의 SPIO/D ^- DC의 세포질에서 발견되었으며 거의 ​​모든 이러한 나노 입자는 리소좀과 유사한 여러 층의 막 구조로 둘러싸여 있습니다 (그림 4b). 반대로 충전된 SPIO가 다른 수준의 IL-1β를 유발할 수 있는지 여부를 조사했습니다. 우리의 결과에 따르면 SPIO/A ⁺ 가 로드된 DC는 및 SPIO/D ⁻ IL-1β의 용량 의존적 분비를 유도했습니다. 농도에 관계없이 SPIO/D ⁻ SPIO/A ⁺ 보다 훨씬 더 높은 수준의 IL-1β 유도 (그림 4c). IL-1β와 TLR3 경로 사이의 명백한 상관 관계로 인해 T 세포 활성화에 대한 IL-1β의 효과를 추가로 연구하기 위해 TLR3 녹아웃 마우스에서 DC를 유도하고 SPIO/A ⁺ 와 공동 배양했습니다. , SPIO/D ⁻ , OVA. SPIO/A ⁺ 가 로드된 DC + OVA는 B₃를 효과적으로 활성화할 수 있습니다. Z T 세포, 이는 DC의 TLR3 분자가 교차 제시에 확실히 필요했음을 의미합니다(그림 4d).

서로 다른 전하로 코팅된 SPIO는 DC 교차 제시 및 IL-1β 분비에 영향을 미쳤습니다. 아 다르게 하전된 분자로 코팅된 SPIO의 pH 의존적 제타 전위. ㄴ TEM 하에서 DC에서 전하가 다른 나노 입자의 위치. ㄷ 다르게 하전된 분자로 코팅된 SPIO에 의해 유도된 IL-1β. d SPIO/A ⁺ 의 교차 프레젠테이션 +OVA 및 SPIO/D ⁻ + TLR3 경로를 통한 DC의 OVA

반전하 코팅으로 수정된 SPIO는 인간 DC에 의한 항원 교차 제시를 촉진하고 IL-1β의 영향을 받았습니다.

IL-1β와 교차 제시 사이의 관계를 조사하기 위해 우리는 카스파제-1 억제제 YVAD를 선택했으며 3시간 동안 50μM 지질다당류(LPS)로 전처리한 후 인간 DC의 IL-1β 분비를 유의하게 억제할 수 있음을 발견했습니다(그림 1a). . 5a). 또한 YVAD가 SPIO/A ⁺ 에 의해 유발된 인간 DC에서 IL-1β의 분비를 억제할 수 있음을 발견했습니다. 및 SPIO/D ⁻ (그림 5b). 그런 다음 우리는 인간 DC가 효과적인 APC로 사용될 수 있고 CEF 특이적 T 세포에 CMV pp65를 교차 제시할 수 있는지 조사했습니다. 항원 교차 제시를 측정하기 위해 세포내 염색(ICS)을 도입하여 항원 특이적 CD3 ⁺ 의 백분율을 결정했습니다. CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ 및 CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ FCS에 의한 T 세포. SPIO/A ⁺ 가 로드된 DC CMV pp65 단백질과 결합하여 더 많은 CD3 ⁺ 유도 CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ 및 CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ SPIO/D가 로드된 DC보다 T 세포 ⁻ . 우리의 데이터는 카스파제-1 억제제 YVAD가 SPIO/D에 의해 유도된 T 세포 반응을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났습니다 ^- + CMV pp65 단백질, SPIO/A ⁺ 에 의해 유도된 T 세포 반응을 부분적으로 억제 + CMV pp65 단백질(그림 5c, d). 이러한 결과는 효율적인 교차 제시를 위해 적당한 수준의 IL-1β 활성화가 필요하고 높은 수준의 IL-1β 활성화가 DC에서 교차 제시를 억제한다는 것을 나타냅니다.

반대 전하로 코팅된 SPIO는 IL-1β 경로를 통해 인간 DC의 기능에 영향을 미칩니다. 아 3시간 동안 LPS로 전처리한 후 인간 DC를 증가하는 농도의 YVAD(1, 10, 25, 50μM)와 함께 배양한 다음 IL-1β의 ELISA를 위해 상층액을 수집했습니다. ㄴ YVAD는 SPIO/D를 통해 인간 DC에서 IL-1β의 분비를 억제할 수 있습니다. ^- . SPIO/A ⁺ 및 SPIO/D ⁻ IL-1β의 영향을 받는 DC 교차 표현에 영향을 줍니다. ㄷ CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ 그리고 d CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ T 세포는 FCS를 사용한 세포내 염색으로 분석되었습니다.

토론

면역 요법은 생명 공학의 발달 이후 임상 및 실험 연구의 연구 초점이었습니다. 그러나 면역을 유도하도록 설계된 기존 DC 백신의 이전 임상 시험은 충분한 면역 반응을 유도하지 못했습니다[26]. 나노입자는 보조제의 한 유형을 나타내며 DC의 기능을 촉진하여 T 세포를 활성화할 수 있습니다[27]. 당사 SPIO의 가장 특징적인 특징은 생체 적합성과 면역 보조제로 DC 라벨링 적용을 포함합니다. TEM 이미지는 SPIO가 건조 상태에서 평균 크기가 8.7nm이고 구형임을 보여줍니다(그림 1a). 프러시안 블루 염색은 SPIO가 DC에 의해 식균되기 쉽다는 것을 보여주었으며(그림 1e), 이는 섭취 효율을 나타냅니다.

SPIO는 생체 적합성을 요구하는 모든 응용 분야인 세포 라벨링, 약물 전달, MRI 및 자기 온열 요법[28]과 같은 광범위한 생체의학 응용 프로그램이 있는 것으로 보고되었습니다. 따라서 SPIO로 표지된 DC가 DC 세포 사멸에 영향을 미치는지 여부를 조사해야 합니다. 우리의 데이터는 DC가 50μg/mL SPIO 미만으로 라벨링되었을 때 DC 세포자멸사에 유의한 차이가 없음을 시사했습니다(그림 2b). 다음 연구에서 우리는 OVA 단백질을 모델 단백질로 선택하고 B₃ Z T 세포는 SPIO가 DC의 교차 제시에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 관찰하는 효과적인 T 세포입니다. 우리의 결과는 SPIO 라벨이 붙은 DC가 OVA의 교차 표현과 B₃의 활성화를 현저하게 촉진할 수 있음을 나타냅니다. Z T 세포. 성숙한 DC의 마커인 표면 분자 CD80 및 CD86은 T 세포 활성화에 필요한 두 가지 중요한 공동자극 인자입니다. 25μg/mL에서 활성화된 B₃ Z T 세포는 나노 입자 투여량에 따라 증가하고 결국 안정화되었습니다(그림 2a). 또한 DC 표면에서 CD80 및 CD86의 발현이 최대에 도달했습니다(그림 2c). 따라서 우리는 25μg/mL의 농도를 채택했고 DC의 apoptosis가 시간에 의존하지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 2d). 이는 SPIO의 우수한 nanoadjuvant 기능과 생체 적합성을 입증했습니다.

DC 마이그레이션에 대한 SPIO의 영향을 조사하기 위해 공초점 형광 현미경에서 녹색 형광을 나타내는 EGFP-DC를 사용하여 12시간 동안 25μg/mL SPIO와 공동 배양했습니다. 우리는 SPIO 라벨링 후 EGFP 형광의 발현이 약화되지 않는 것을 관찰했습니다. 궁극적으로 DC의 이차 림프 ​​기관으로의 이동은 DC 기반 백신의 효과를 평가하기 위한 핵심 매개변수입니다. 이전 연구에서 처음 24시간 동안 SPIO로 표지된 DC는 이차 림프절에서 상당한 양으로 검출되지 않았습니다[29]. 이 현상이 시간에 따라 변하는지 여부를 추가로 확인하기 위해 레이블이 지정된 EGFP-DC와 레이블이 지정되지 않은 EGFP-DC를 모두 수집하고 마우스의 발바닥에 주입하여 DC 이동에서 SPIO의 잠재력을 평가했습니다. 우리의 결과는 4일과 7일에 ILN에 녹색 형광이 나타났으며(그림 3d–f) SPIO가 EGFP-DC를 이차 림프절로 쉽게 이동할 수 있음을 보여줍니다. 이 속성은 종양의 전이를 제한하고 더 많은 림프절에서 더 많은 양의 CTL 세포를 활성화하는 데 적용될 수 있습니다.

우리의 연구에서 우리는 반대로 하전된 SPIO의 보조 특성과 DC 기능의 변화를 뒷받침하는 가능한 메커니즘을 탐구했습니다. 산화철 나노입자의 표면 전하는 세포 흡수 효율에 영향을 미치는 것으로 나타났다[30, 31]. 우리의 이전 연구에서 우리는 양이온성 SPIO가 항원 교차 제시를 향상시키고 이에 따라 T 세포 활성화를 향상시킬 수 있는 반면 음이온성 SPIO는 자가포식과 관련이 있다고 보고했습니다. [16] 여러 금속 나노입자가 염증 반응을 유발할 수 있습니다[32, 33]. 산화철 나노입자는 NLRP3를 활성화시키고, 리소좀의 막을 파열시키며, 카텝신 B를 방출하고, IL-1β 분비를 유도하는 것으로 보고되었다[34]. 따라서, 우리는 반대로 하전된 SPIO 나노입자가 쥐와 인간 DC 모두에서 IL-1β 생성을 자극하는 데 다른 기능을 할 수 있다고 가정했습니다. 그림 4a에서 제타 전위 분석은 APTS 코팅된 SPIO가 양전하를 띠는 반면 DMSA로 코팅된 SPIO는 음전하를 띠는 것으로 나타났습니다. TEM에서 우리는 다르게 하전된 SPIO가 세포질의 다른 위치에 모여 있음을 발견했습니다(그림 4b). SPIO/A ⁺ 의 교차 표현의 차이점을 조사하기 위해 및 SPIO/D ⁻ , 우리는 다르게 하전된 나노 입자에 의해 유도된 쥐 DC에서 IL-1β 분비를 조사했습니다. SPIO/A ⁺ 로 치료한 후 쥐 DC의 반응을 평가했습니다. 및 SPIO/D ⁻ . SPIO/D에 노출 ⁻ SPIO/A ⁺ 에 대한 노출과 비교하여 IL-1β 분비의 명백한 활성화 유도 (그림 4c). 이 현상은 SPIO/D ^- 에 의해 유도된 항원 교차 제시가 부분적으로 드러났습니다. SPIO/A ⁺ 에 의해 유도된 것만큼 효율적이지 않습니다. . B₃ 증가의 CPRG 분석 외에도 SPIO/A ⁺ 와 쥐 DC의 공동 배양 후 Z T 세포 활성화 +OVA는 양전하를 띤 나노입자가 면역 보조제로 사용될 때 더 나은 성능을 발휘할 수 있음을 입증했습니다. Toll-like receptors (TLRs) are of importance for triggering immune responses, such as TLR3, and they can ultimately result in the production of inflammasomes, the activation of caspase-1 protein, and secretion of cytokine IL-1β [35]. To demonstrate whether TLR3 is related to the antigen cross-presentation influenced by our nanoadjuvant, TLR3 knockout DCs were employed in our study. TLR3 ^−/− DCs loaded with SPIO/A ⁺ +OVA and SPIO + OVA effectively stimulated the B₃ Z T cell activation (Fig. 4d), which indicates that the TLR3 molecule in DCs was necessary for cross-presentation. Collectively, these results elucidated that differently charged polymers on the surface of nanoparticles should be considered when investigating their synergistic effects on activated immune responses.

Our data show that the oppositely charged nanoparticles could induce the production of IL-1β, whereas SPIO/D ⁻ could hyperactivate the secretion of IL-1β. However, compared with SPIO/A ⁺ , SPIO/D ⁻ induced a lower level of B₃ Z T cell activation. Therefore, we speculate that aberrant IL-1β production may contribute to cellular dysfunction in DCs. Most studies on nanomaterial adjuvants exploit DCs from mice, whereas few have used DCs from humans [36, 37]. To further verify our hypothesis, we used YVAD, which has been proven to be an effective caspase-1 inhibitor (Fig. 5a, b), to suppress IL-1β secretion from human DCs. CMV pp65 protein was selected as the model antigen, and CEF-specific T cells expanded in vitro were used as responder cells. The CMV pp65 protein is an immunological dominant protein that readily activates CD8 ⁺ and CD4 ⁺ T cells to produce cytokines, particularly IFN-γ [38]. CEF peptide was used as a positive control to verify that the addition of YVAD would not affect the activation of T cells because it can be presented to the T cells directly. Intriguingly, with the use of YVAD, the T cell responses in the SPIO/A ⁺ group were slightly restrained, while the responses in the SPIO/D ⁻ group increased (Fig. 5c, d). The influence of IL-1β on DC cross-presentation provided conclusive evidence that a low level of IL-1β induced by SPIO/A ⁺ is needed for antigen cross-presentation, and a high level of IL-1β in the cytosol will inhibit the function of DCs.

결론

As shown in the graphical abstract in Fig. 6, SPIO can promote the maturation, migration, and cross-presentation of DCs. Moderate IL-1β activity is partly related to the antigen cross-presentation of DCs. In addition, negatively charged nanoparticles can activate excessive IL-1β and subsequently inhibit the functions of DCs. In summary, our results indicate that SPIO exhibit many biological properties and have promising adjuvant potential. These findings will help identify the optimal choice of nanoadjuvants for the development of DC vaccines in the future.

Graphical abstract of SPIO as a nano-adjuvant for DCs. SPIO enhances the function of DCs by promoting the loading of DCs; thus, SPIO-labeled DCs can migrate to the ILNs active in an immune organ and may offer a new approach in cancer immunotherapy. Anionic-charged SPIOs activate protective IL-1β responses by triggering caspase-1 in DCs, thereby impairing antigen presentation to active T cells

약어

APCs:

Antigen-presenting cells

APTS:

3-Aminopropyltrimethoxysilane

ATP:

Adenosine triphosphate

CPRG:

Chlorophenol red-β-d-galactopyranoside

CTL:

Cytotoxic T cell

DAMPs:

Damage-associated molecular patterns

DC:

Dendritic cell

DMSA:

Meso-2, 3-dimercaptosuccinic acid

EGFP:

Enhanced green fluorescent protein

IL-1β:

Interleukin-1β

MHC-I:

Major histocompatibility complex class I

NLRP3:

NACHT, LRR, and PYD domains-containing protein 3

OVA:

Ovalbumin

PAMPs:

Pathogen-associated molecular patterns

SPIO:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

SPIO/A ⁺ :

SPIO coated with APTS

SPIO/D ⁻ :

SPIO coated with DMSA

TLRs:

Toll-like receptors

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