스마트 폰 기반 판독기로 질병 바이오마커를 민감하게 감지하기 위한 플라즈몬 ELISA

결과 및 토론

근종 검출을 위한 AuNR 기반 면역분석 원리

플라즈몬 면역분석은 샌드위치 면역분석과 AuNR의 플라즈몬 특성을 결합합니다. Ab1과 Ab2는 포도당 산화효소(GOx-Ab2)와 결합되었습니다(그림 1). 결합 시 GOx로 표지된 Ab2는 기질 포도당을 촉매하여 글루콘산과 과산화수소(H₂ O₂ ). H₂ O₂ 특정 농도의 HRP 및 Br ^- 에서 AuNR을 에칭하는 산화제 역할을 합니다. , 이는 AuNR의 SPR 스펙트럼에서 실질적인 청색 이동을 초래하고 850nm에서 AuNR의 흡광도를 감소시킵니다. plasmonic immunoassay에서 GOx의 양은 목표 농도에 비례합니다. AuNR의 SPR 스펙트럼에서 청색 이동 정도와 850nm에서 AuNR의 흡광도 감소는 목표 농도와 양의 상관관계가 있었습니다. 플라즈몬 면역분석 결과는 AuNR SPR 스펙트럼의 청색 이동을 측정하기 위해 마이크로플레이트 판독기를 사용하거나 850nm에서 AuNR의 흡광도 변화를 측정하기 위해 스마트폰 판독기를 사용하여 검증할 수 있습니다.

Myo 검출을 위한 AuNR 기반 플라즈몬 면역분석의 개략도

근종 검출을 위한 플라즈몬 면역분석 최적화

HRP 및 CTAB 농도는 검출된 결과에 직접적인 영향을 미칩니다. 이 작업에서 AuNR은 100μM의 H₂를 포함하는 용액으로 에칭되었습니다. O₂ AuNR의 LSPR 이동이 기록된 시트레이트 완충액(40mM, pH 4.0)에서 HRP 및 CTAB의 다양한 농도. 이 연구에서는 이러한 농도에서 관찰된 AuNR의 최대 LSPR 이동으로 인해 1.5μM HRP 및 6.25μM CTAB가 선택되었습니다(그림 2a). 최적화된 HRP 및 CTAB 농도에서 AuNP는 100μM H₂로 에칭되었습니다. O₂ 구연산염 완충액(20mM, pH 4.0) AuNR의 LSPR 스펙트럼은 파란색으로 이동되었으며 850nm에서 AuNR의 흡광도는 시간이 지남에 따라 감소했습니다(그림 2b). 30분 후 AuNR의 LSPR이 안정적입니다. 따라서 H₂의 시간으로 30분을 선택했습니다. O₂ AuNR의 에칭. AuNP는 다른 농도의 H₂에 의해 에칭되었습니다. O₂ . AuNRs LSPR 스펙트럼은 H₂가 감소함에 따라 파란색으로 이동했습니다. O₂ 농도(그림 2c). AuNR의 TEM 이미지는 H₂가 증가함에 따라 O₂ 농도, AuNR의 모양은 직사각형에서 타원으로 변경되었습니다(그림 2d-f). 이 결과는 AuNRs LSPR 스펙트럼이 H₂의 농도에 의존한다는 것을 보여주었습니다. O_2.

Myo 검출을 위한 플라즈몬 면역분석을 기반으로 하는 AuNR의 최적화 및 특성화. 아 플라즈몬 면역 분석을 기반으로 한 AuNR에서 HRP 및 CTAB 농도의 최적화. 다른 색상 선은 다양한 농도의 CTAB를 나타내며 그 중 6.25mM CTAB 및 1.5μM HRP가 선호되었습니다. ㄴ H₂ 시간 최적화 O₂ 1.5μM HRP, 6.25mM CTAB 및 100μM H₂인 AuNR 에칭 O₂ citrate buffer(20mM, pH 4.0)에 30분 동안 담가두는 것이 좋습니다. ㄷ 다양한 농도의 H₂ 50μL를 추가한 AuNR의 LSPR 스펙트럼 O₂ . d –f 다른 농도의 H₂에 의해 에칭된 AuNR의 TEM 이미지 O₂ (0μM, 10μM, 100μM) 30분 지 다양한 농도의 GOx에서 AuNR의 LSPR 이동. 아 다양한 희석 비율에서 GOx-Ab2가 존재할 때 AuNR의 LSPR 스펙트럼. 나 다양한 농도의 Myo로 코팅된 직접 플라즈몬 면역분석에서 AuNR의 LSPR 스펙트럼 이동. 각 값은 3회 반복의 평균을 나타냅니다.

GOx는 포도당을 촉매하여 H₂를 생성할 수 있습니다. O₂ , AuNR을 에칭할 수 있습니다. 이 작업에서 0.5mM의 포도당은 다양한 농도의 GOx에 의해 촉매되고 생성된 H₂ O₂ AuNR을 에칭하는 데 사용되었습니다(그림 2g). GOx의 농도가 100pg mL일 때 ⁻¹ (6.66 × 10 ⁻¹¹ 몰 L ⁻¹ ), AuNR의 LSPR 스펙트럼은 명백한 청색 이동을 보여 AuNR 기반 플라즈몬 면역 분석의 높은 감도를 시사합니다. GOx는 Ab2와 접합된 다음 다른 농도로 희석되었습니다. GOx-Ab2의 촉매 활성은 분해된 GOx 및 에칭된 AuNR에 의해 검증되었습니다. AuNR의 LSPR 스펙트럼은 GOx-Ab2 농도가 증가함에 따라 청색으로 이동되었으며(그림 2h), 이는 GOx-Ab2가 우수한 촉매 활성을 유지함을 나타냅니다. 또한 Myo를 마이크로플레이트에 코팅하고 GOx-Ab2와 함께 인큐베이션했습니다. 30분 후 GOx-Ab2를 PBST 완충액으로 3회 세척했습니다. 그런 다음 포도당을 마이크로웰에 첨가한 다음 30분 후에 포도당 용액에 AuNR을 첨가했습니다. AuNR의 LSPR 스펙트럼의 청색 이동은 GOx-Ab2 농도가 증가함에 따라 증가하여(그림 2i), Ab2는 면역 활성을 유지하는 반면 GOx는 촉매 활성을 유지함을 보여줍니다.

현장 근종 감지를 위한 스마트폰 기반 플라즈몬 면역분석 판독기

일반적으로 보고되는 플라즈몬 면역분석은 상용 마이크로플레이트 판독기 또는 분광계에 의해 정량적으로 해석되며, 이는 자원이 제한된 지역에서 그 유용성을 제한합니다. 플라즈몬 면역 분석의 접근성을 향상시키기 위해 AuNR의 투과광 강도를 측정하기 위해 스마트 폰의 주변 광 센서(ALS)에 의존하는 스마트 폰 기반 플라즈몬 면역 분석 리더를 준비했습니다. 대부분의 스마트폰에서 ALS는 다양한 상황에 따라 화면의 밝기를 자동으로 조절하는 기본 설정이다. 우리는 이전에 비색 분석 판독기에서 ALS를 사용하여 보고했습니다[26,27,28]. 플라즈몬 면역분석 판독기에 대한 원리 및 지침은 이전 간행물[29]에 문서화되어 있습니다. 3D 인쇄된 플라즈몬 면역분석 판독기는 두 부분으로 구성됩니다. 파트 1(100 mm × 40 mm × 40 mm)은 2개의 배터리(1.5 V)로 구동되는 안정적인 광원을 공급하기 위해 스마트폰에 고정될 수 있고, 파트 2( 76mm × 13mm × 12mm)는 마이크로웰을 호스팅하는 데 사용할 수 있습니다. Plasmonic immunoassay가 완료되면 그림 3a와 같이 microwell을 part 2에 조립한 다음 part 2를 part 1에 고정하고, part 1을 스마트폰의 ALS에 부착하였다. 이 디자인에서 LED는 스마트 폰의 ALS와 정렬되었습니다. 스위치가 켜지면 LED의 빛이 AuNR을 통해 전송되고 ALS로 측정됩니다. 슬라이드 파트 2를 통해 각 마이크로웰의 투과광 강도를 읽을 수 있습니다. Android 애플리케이션 Light Meter를 통해 측정된 결과를 스마트폰 화면에 표시할 수 있습니다. 플라즈몬 면역분석에서 AuNR의 최대 흡수 스펙트럼은 850nm였으며 H₂가 증가함에 따라 O₂ 농도에 따라 850nm에서 AuNR의 흡광도가 점차 감소했습니다. 따라서 플라즈몬 면역분석 판독기에서 LED의 여기광 파장으로 850nm가 선택되었습니다. 스마트폰 기반 플라즈몬 면역분석 리더기의 총 비용은 약 2달러였다. 스마트폰 기반 plasmonic immunoassay 판독기와 상용 microplate 판독기의 측정 결과를 비교하기 위해 마이크로웰에서 AuNR의 투과광 강도와 흡광도를 측정했습니다. 이러한 장치에서 얻은 결과를 장착하고 99.1%의 상관관계를 보여주었으며(그림 3b), 이는 스마트폰 기반 플라즈몬 면역분석 판독기가 정확도 측면에서 유사한 도구임을 나타냅니다.

스마트폰 기반 플라즈몬 면역분석기의 메커니즘. 아 스마트폰 기반 플라즈몬 면역분석 리더기의 3D 프린팅 액세서리 개략도. AuNR의 투과광 강도를 스마트폰의 ALS로 측정하여 그 값을 화면에 표시하였다. ㄴ 스마트폰 기반 플라즈몬 면역분석 판독기의 결과와 상업용 마이크로플레이트 판독기의 결과 간의 상관관계. 각 값은 3회 반복의 평균을 나타냅니다.

근검을 위한 Plasmonic Immunoassay의 분석 성능

AuNR 기반 플라즈몬 면역분석의 성능을 위해 다양한 농도의 Myo를 분석했습니다. AuNR의 LSPR 스펙트럼은 상용 분광계로 기록하였고, AuNR의 LSPR 스펙트럼의 투과광 강도는 스마트폰 기반 플라즈몬 면역분석기(plasmonic immunoassay reader)로 측정하였다. Myo 농도가 증가함에 따라 AuNR의 LSPR 스펙트럼은 파란색으로 이동하고 AuNR의 LSPR 스펙트럼의 흡광도는 감소했습니다(그림 4a). AuNR의 LSPR 청색 이동은 Myo 농도의 정량적 분석에 사용되었습니다. Myo 농도가 0 pg mL ⁻¹ 일 때 , AuNR의 LSPR 청색 편이는 0nm였습니다. Myo 농도가 증가함에 따라 AuNR의 LSPR 피크가 파란색으로 이동했습니다(추가 파일 1:그림 S1). 측정된 투과광 강도를 사용하여 Myo의 농도를 정량화했습니다. LSPR 스펙트럼 청색 이동으로 정량화된 플라즈몬 면역분석을 기반으로 한 AuNR의 선형 검출 범위는 0.1–1000ng mL ⁻¹ 였습니다. (추가 파일 1:그림 S2-S3) 57.81pg mL의 검출 한계 ⁻¹ . AuNR의 측정된 투과광 강도는 Myo 농도가 증가함에 따라 감소했습니다(그림 4b). 측정된 투과광 강도를 사용하여 Myo의 농도를 정량화했습니다. AuNR의 투과광 강도로 정량화된 플라즈몬 면역분석의 선형 검출 범위는 0.1–1000ng mL ⁻¹ 였습니다. (그림 4c) 64.13pg mL ⁻¹ 에서 검출 한계 . AMI는 90ng mL ⁻¹ 보다 높은 Myo의 혈청 농도로 정의되었습니다. . 임상 샘플에서 Myo 검출을 위해 측정 결과의 일관성을 향상시키기 위해 분석 전에 혈청을 10배 희석했습니다.

Myo 검출을 위한 플라즈몬 면역분석. 아 다양한 농도의 Myo에서 AuNR의 LSPR 피크 이동. ㄴ 다양한 농도의 Myo 검출을 위한 AuNR의 흡광도. ㄷ 스마트폰 기반 판독기로 판독한 Myo 검출을 위한 플라즈몬 면역분석의 교정 라인. 각 값은 3회 반복의 평균을 나타냅니다.

플라즈몬 면역분석과 ELISA의 비교

ELISA는 임상 진단에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 이 작업에서 우리는 Myo 분석을 위한 ELISA와 플라즈몬 면역분석의 검출 성능을 비교했습니다. 두 방법 모두 동일한 항체와 항원을 사용했습니다. ELISA의 선형 검출 범위는 25–1000ng mL ⁻¹ 입니다. LOD는 22.7ng mL ⁻¹ 였습니다. (그림 5a, 추가 파일 1:그림 S4). ELISA와 비교하여 plasmonic immunoassay는 더 민감하고 더 넓은 검출 범위를 나타냈다. 또한, 임상 적용을 위한 플라즈몬 면역 측정의 가능성을 입증하기 위해 임상 혈청 샘플의 Myo를 플라즈몬 면역 측정 및 ELISA로 측정했습니다. 플라즈몬 면역분석 결과는 각각 상용 마이크로플레이트 리더와 스마트폰 기반 플라즈몬 면역분석 리더로 판독하였다. 이 두 방법의 결과는 상관관계가 높았으며(그림 5b), AuNR 기반 플라즈몬 면역분석이 임상 AMI 진단에 사용될 수 있음을 나타냅니다.

Myo 검출을 위한 플라즈몬 면역분석과 기존 ELISA의 비교. 아 Myo 검출을 위한 ELISA의 보정 라인. ㄴ 혈청 샘플 테스트에서 플라즈몬 면역분석과 기존 ELISA의 비교. 가로축은 ELISA 결과를 나타내고 세로축은 플라즈몬 면역분석 결과를 나타냅니다. 각 값은 3회 반복의 평균을 나타냅니다.