알츠하이머병은 세계 인구 중 알츠하이머병의 높은 발병률과 국가에 위생 및 사회적 측면에서 부담하는 비용을 고려할 때 질병의 조기 바이오마커를 검출할 수 있는 비침습적 진단 검사의 개발이 필요합니다. 조기 진단 방법 중 자기공명영상용 조영제의 개발이 특히 유용하다.
축적된 증거는 노인성 플라크를 둘러싼 콜레스테롤의 비정상적인 침착이 알츠하이머병 환자와 동물 형질전환 모델에서 기술되었기 때문에 콜레스테롤이 알츠하이머병의 발병기전에 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 생체 내 실험은 또한 식이 유도성 고콜레스테롤혈증이 소교세포증을 동반한 β-아밀로이드 단백질의 신경내 축적을 강화하고 뇌의 β-아밀로이드 침착을 가속화한다는 것을 보여주었습니다.
가설 제시
본 연구에서는 자기 공명 영상을 통해 알츠하이머병의 노인성 플라크에서 관찰되는 콜레스테롤의 비정상적 침착물을 검출하기 위해 항콜레스테롤 항체에 결합된 자기 나노입자로 구성된 새로운 나노접합체의 합성을 처음으로 제안합니다. 나노플랫폼은 또한 이러한 병리와 관련된 신경 세포막에서 관찰되는 콜레스테롤의 감소를 나타낼 수 있습니다.
가설 테스트
가설을 테스트하기 위한 실험 설계는 먼저 시험관 내에서 수행된 다음 두 번째 단계에서 생체 외 및 생체 내 연구에서 수행됩니다.
가설의 의미
따라서 설계된 나노플랫폼은 대뇌 수준에서 콜레스테롤 침착물을 감지할 수 있습니다. 노인성 플라크 축적과 일치하는 영역에서 이 바이오마커를 검출하면 알츠하이머병의 발병 및 진행에 대한 조기 정보를 제공할 수 있습니다.
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배경
여러 연구에 따르면 신경 세포막에 적절한 양의 콜레스테롤(CHO)이 존재하면 알츠하이머병(AD)에서 β-아밀로이드 단백질의 과도한 생산을 방해하는 독성으로부터 신경 세포를 보호하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌습니다. [1,2,3]; CHO가 풍부한 뉴런은 산화 스트레스와 β-아밀로이드 단백질의 독성에 대해 더 내성이 있습니다[4, 5].
따라서, 신경 세포막에 존재하는 CHO의 양은 혈장 수준뿐만 아니라 신경 퇴행성 질환의 발병 기전에 역할을 할 수 있다고 가정할 수 있습니다[6]. 사실, 실험 데이터는 독성 물질에 대한 보호 장벽을 만들기 위해 세포막에서 최적의 CHO의 양이 필요하다는 아이디어를 뒷받침합니다. 원형질막에서 감소된 세포성 CHO는 이 보호 장벽을 변경하여 β-아밀로이드 단백질을 포함한 독성 물질에 대한 보호를 감소시킵니다[7]. 흥미롭게도 유전자 변형 알츠하이머병 쥐의 대뇌 피질에 있는 뉴런은 야생형 쥐에 비해 원형질막에 CHO가 적게 함유되어 있습니다[8].
Mori et al. [9]는 인간과 형질전환 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 마우스 모두에서 CHO가 성숙한 아밀로이드 플라크에 비정상적으로 축적되지만 미만성 플라크 또는 미성숙 플라크에는 축적되지 않는다는 것을 보여주었으며, 이는 CHO가 노인성 플라크의 형성 및 진행에 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 다른 후속 연구에서는 CHO 및 아포지단백 E가 원섬유 플라크의 코어에 존재하지만 초기 단계의 미만성 플라크에는 존재하지 않는다는 것을 발견했습니다. 질병의 더 진행된 단계에서 콜레스테롤 산화효소에 대한 면역양성인 원섬유 플라크의 수가 더 많이 기술되었습니다[10]. 질량 분석에 의해 결정된 노인성 플라크당 유리 CHO의 양은 β-아밀로이드 단백질 부하와 유사했습니다[8]. 알츠하이머병에서 CHO 및 노인성 플라크 농도의 상호 증가는 이 질병의 새로운 병원성 기전을 시사할 수 있습니다[11]. 또한, 알츠하이머병 환자의 뇌 조직에서 Thioflavin-S 염색 샘플에서 anti-Stokes Raman 산란 및 2광자 형광 현미경을 사용하여 원섬유형 노인성 플라크와 함께 위치하는 지질 침착이 설명되었습니다[10]. 두 가지 지질 형태가 관찰될 수 있습니다:라멜라 구조 및 서브마이크론 크기의 거대 응집체 합체. 지질 구성/조직이 플라크 전체에 걸쳐 다르기 때문에 섬유소 노인성 플라크에서 가까운 아밀로이드-지질 상호작용의 명백한 증거가 있어 이전에 생각했던 것보다 더 역동적인 구성이 됩니다[12].
또한, 질병의 초기 단계에서 알츠하이머병의 바이오마커를 검출하기 위해 여러 연구에서 기능화된 자기 산화철 나노입자(MNP)를 노인성 플라크에 대한 자기공명영상(MRI)용 특이 조영제로 사용하는 것이 제안되었습니다[13,14, 15] 및 페리틴 단백질 [16] 검출. T2 및 T2* 강조 시퀀스에서 이러한 입자가 나타내는 저강도 효과는 MRI 이미지에서 더 큰 대비를 제공합니다. 따라서 MRI의 조영제로 MNP를 사용하는 것은 알츠하이머병의 조기 진단을 위한 유망한 방법입니다.
현재 연구는 AD의 잠재적 바이오마커로 사용될 수 있는 노인성 플라크에서 CHO의 비정상적 축적을 MRI로 검출하기 위해 생체 기능화된 MNP에 기반한 새로운 조영제를 사용한다는 가설을 제시합니다.
본 연구는 우리가 아는 한 처음으로 노인성 플라크에서 CHO의 비정상적 축적을 MRI로 감지하기 위한 생체 기능화된 MNP를 기반으로 하는 새로운 조영제의 설계를 제시하며, 이는 AD의 잠재적 바이오마커로 사용될 수 있습니다. .
가설
수년 동안 전 세계 인구에서 알츠하이머병의 높은 발병률[17]과 국가의 건강 및 사회적 측면에서 병리학 관련 비용[17]으로 인해 조기 바이오마커를 탐지할 수 있는 비침습적 도구를 개발하는 것이 시급합니다. 질병의 진단 및 발전.
조기 진단 방법 내에서 분자 영상(MI)을 위한 조영제의 개발이 특히 유용합니다. MI는 질병 진행 및 치료 반응의 기초가 되는 생화학 및 세포 생물학의 측면을 감지하도록 설계된 분자 프로브와 기존의 영상 기술을 결합합니다[18,19,20].
우리는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 코팅되고 스트렙타비딘으로 기능화된 MNP를 기반으로 하는 조영제의 합성을 제안하여(그림 1a) 노인성 플라크(NANOCHOAD)에 존재하는 CHO를 특이적으로 인식하는 비오틴화된 항체의 방향 연결을 허용합니다( 그림 1b). 항체는 또한 세포 원형질막에 존재하는 CHO를 인식하여 뉴런 원형질막에서 CHO의 감소를 감지합니다. MNP는 PEG 사슬로 코팅되어 나노플랫폼의 콜로이드 안정성을 개선하여 혈류 내 분산과 혈액뇌장벽(BBB) 통과를 촉진합니다[21].
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설계된 나노플랫폼과 그 작용 메커니즘의 개략도. 아 MNP의 구조 및 항-CHO 항체(NANOCHOAD)로 기능화, b BBB를 통한 나노플랫폼 침투 전략, c NANOCHOAD의 BBB를 통한 교차 메커니즘. d 아밀로이드 플라크 상의 CHO 침착물을 표적으로 하는 나노접합체 항-CHO-MNP
BBB는 신경계 질환의 치료 및 진단에서 마주하게 되는 가장 배타적인 생물학적 장벽 중 하나로서 대부분의 진단 및 치료제가 전신 경로를 통해 뇌에 접근하는 것을 제한합니다[22, 23]. 따라서, 많은 수의 뇌 장애의 진단 및 치료의 도전은 BBB를 통해 뇌의 구체적인 영역을 표적으로 하는 치료제 및 조영제를 전달하는 어려움을 극복하는 것입니다. 다행히도, 뇌 모세혈관 내피 세포는 특정 수용체 매개 수송 메커니즘을 보여줍니다. 많은 수의 트랜스페린 수용체가 BBB를 통한 수용체 매개 트랜스사이토시스에 관여하는 뇌 모세혈관 내피 세포에 의해 발현된다는 것이 문서화되었습니다[24].
따라서 BBB를 통해 조영제를 통과시키는 문제를 해결하기 위해 우리는 세 가지 대안 전략을 제안합니다. (ii) 항-CHO-MNP 접합체의 비강내 투여. 비침습적이고 BBB를 우회하는 비강 경로는 나노접합체를 뇌에 전달하기 위한 대체 경로입니다[26, 27]. 및 (iii) BBB를 가로지르는 나노접합체를 촉진하기 위한 외부 자기장의 적용(그림 2c). 이 새로운 전달 기술은 BBB[28,29,30](그림 1c)를 통해 뇌(후각 영역, 피질, 해마…)에 임상적으로 적절한 용량을 전달할 수 있습니다. 또한, BBB를 통한 나노접합체의 통과는 PEG 코팅된 MNP의 사용과 병리학 자체로 인한 BBB의 악화 모두에 의해 선호될 것입니다. 나노 접합체는 항원-항체 친화도에 의해 노인성 플라크에서 CHO의 비정상적인 침착을 특이적으로 인식합니다(그림 1c, d). 노인성 플라크로서 뇌 실질의 병리학적 구조에서 나노입자의 축적은 AD 뇌 실질에서 CHO 국소화의 변화를 나타낼 것이다. 따라서 노인성 반점과 관련된 항-CHO-MNP의 존재는 T2* 강조 MRI에서 저강도 신호를 보여 노인성 반점과 같은 알츠하이머병의 다른 확립된 특징과 관련된 CHO의 검출을 허용하고 따라서 MR 영상화 뇌의 CHO는 질병의 새로운 바이오마커가 될 수 있습니다. 또한 CHO 원형질막의 감소로 인한 MRI의 변화도 예상됩니다.
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가설을 테스트하기 위한 실험적 설계. 첫째, 시험관 내(a ):합성된 나노접합체의 생체적합성의 결정. 생체 외 테스트(b ):5XFAD 형질전환 마우스로부터의 고정된 뇌 슬라이스 상의 나노플랫폼의 인큐베이션에 의한 항-CHO-MNPs 나노접합체의 특이성을 테스트. 생체 내 연구(c ):나노플랫폼은 비강내 전달/외부 자기장 적용과 같이 정맥내 또는 대체 경로로 주입되며 그 효과(타겟팅)는 MRI로 평가됩니다.
뇌 실질에서 조영제의 제거는 이전 연구에서 입증된 바와 같이 미세아교세포에 의한 MNP의 내재화 및 후속 리소좀 처리에 의해 달성될 수 있다[16, 31, 32]. MNP는 내인성 철의 대사에 사용되는 일반적인 경로에 의해 제거됩니다. 그럼에도 불구하고, 조영제의 크기와 표면 전하 및 잠재적 독성을 기반으로 한 조영제의 제거 경로는 아래에 자세히 설명된 대로 제안된 가설을 개발하는 동안 결정됩니다.
가설 테스트
자성 나노입자의 합성 및 특성화
산화철 나노입자의 합성은 Predescu et al. [33]. MNP는 Liu et al.에 의해 이전에 설정된 프로토콜에 따라 PEG 쉘로 코팅됩니다. [34].
PEG로 코팅된 철 나노 입자의 구조, 형태 및 자성은 X선 회절(XRD), 주사 전자 현미경(SEM), 투과 전자 현미경(TEM), 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 및 초전도 양자 간섭 장치(SQUID) 자기계측.
합성된 자성 나노물질의 특성화 후 NHS/EDC 방법에 의해 (1) streptavidin 단백질로 기능화됩니다. 그 후, 그것은 비오틴화된 항-CHO 항체 및 (2) 트랜스페린 단백질에 결합될 것입니다. 트랜스페린 접합은 리간드 표면에 존재하는 카르복실기와 PEG 코팅에 존재하는 히드록실기를 결합하여 수행됩니다[35].
체외 테스트
첫 번째 단계에서는 나노플랫폼의 생체 적합성이 시험관 내에서 테스트됩니다(그림 2a). 나노접합체는 뉴런과 성상세포의 공동 배양 및 내피 세포 배양[36]에 추가되어 나노 접합체와 전형적인 뇌 세포의 호환성을 결정합니다. 기능화된 MNP의 세포 적합성이 정확하면 시스템의 효과가 질병의 생체 외 모델에서 테스트됩니다(그림 2b). 선택된 모델은 5개의 가족성 AD 돌연변이(5XFAD)를 공동 발현하고 AD에서 발견되는 것과 유사한 아밀로이드 플라크 병리를 나타내는 APP/(presenilin-1) PS1 이중 형질전환 마우스입니다[37].
5XFAD 형질전환 모델에서 노인성 플라크 주변의 CHO 축적은 면역조직화학으로 평가됩니다.
모델이 유효하면 노인성 플라크에서 CHO의 축적이 입증되면 합성된 나노접합체의 특이성을 테스트하는 것이 제안됩니다. 이를 위해 먼저 5XFAD 유전자 변형 마우스에서 고정 뇌 조각을 얻은 다음 5XFAD 마우스의 고정 뇌 섹션에서 항 CHO-MNP를 배양하여 나노 접합체의 결합을 시도합니다. 적절한 대조군을 수행하여 5XFAD 뇌 섹션에 존재하는 노인성 플라크 및 CHO 침착물과 항-CHO-MNP의 공동 국소화를 평가함으로써 나노접합체의 특이성이 결정될 것이다. 5XFAD에서 명백한 콜레스테롤 축적이 감지되지 않은 경우, 아밀로이드 전구체 단백질 마우스 모델(APPsw ), 알츠하이머병의 마우스 모델이 사용됩니다. 이 모델에서는 아밀로이드 플라크와 분명히 관련된 CHO 축적이 해마에 설명되어 있기 때문입니다[9].
체내 테스트
접합체의 특이성이 입증되면 생체 내 나노 접합체의 생체 적합성 분석이 수행됩니다. 나노플랫폼은 다양한 용량(25 ~ 100 mg/kg[38])으로 정맥 주사하고(그림 2c) 연구 과정 중 아급성 독성은 사망, 위축의 증거를 관찰하여 분석합니다. , 혼잡, 염증 또는 생쥐의 심한 행동 변화. 신체에 대한 각 장기의 무게 계수가 계산됩니다. 신장 독성은 혈액 내 요소 질소와 크레아티닌 수치에 의해 결정됩니다. 혈액 내 총 빌리루빈 및 알칼리성 인산분해효소 수치는 간 및 담도 기능의 척도로 테스트할 수 있습니다. 또한 요산 수치와 적혈구, 백혈구 및 헤모글로빈 수치의 변화를 평가하기 위한 혈액학적 연구도 결정됩니다. 마지막으로 가능한 독성 영향에 대해 더 자세히 조사하기 위해 다양한 조직(신장, 간, 비장, 뇌 또는 폐)에 대한 조직학적 검사가 수행됩니다[39]. 혈액, 소변 및 다른 기관에서 기능화된 MNP의 위치는 항-CHO-MNP 주사 후 24시간, 72시간, 1주, 2주 및 1달에 분석됩니다.
MNP의 적절한 농도가 결정되면 나노플랫폼이 대조군과 5XFAD 마우스에 주입되고 그 효과는 MRI로 평가됩니다(그림 2c). 나노플랫폼의 항체가 생체 내 시스템에서 항원을 인식하지 못한다면 MNP는 페닐-디인 콜레스테롤로 기능화될 수 있습니다. . 이 나노접합체의 생체적합성은 MNP-CHO 나노접합체에 대해 위에서 설명한 바와 같이 평가될 것이다. 정맥 투여 경로가 BBB를 통과하여 효과적이지 않은 경우 비강 투여 또는 외부 자기장의 적용과 같은 대체 투여 경로를 제안합니다(그림 2c).
가설의 의미
생체 내에서 MRI로 알츠하이머병을 검출하기 위한 생체 기능화된 MNP의 사용은 MNP를 Aβ 1-40 [41], Aβ1-30 [42], Aβ1-42 [15]와 같은 다른 펩티드에 접합함으로써 수많은 이전 연구에서 널리 입증되었습니다. 및 항-Aβ-1-42 항체[43]. 알츠하이머병 동물 모델에서 정맥내 투여한 후, 노인성 플라크와 혈관성 아밀로이드 침착물(congophilic angiopathy)이 MRI에 의해 검출되었습니다. 그러나 이러한 나노접합체는 사용된 아밀로이드 펩타이드의 단편이 신경독성(Aβ1-40, Aβ1-42)이기 때문에 그 자체로 독성이 있습니다. 또한, 크기 때문에 BBB를 통한 통과를 촉진하는 화합물의 공동 투여가 필요합니다.
NANOCHOAD는 두 가지 AD 특이적 바이오마커, 즉 아밀로이드 플라크와 뇌의 백질에서 CHO 소실[44]의 동시 국소화를 허용하는 조영제로 작동하여 독성을 피할 수 있습니다. 구조에 PEG가 존재하기 때문에 BBB를 통한 나노플랫폼의 통과도 촉진할 것입니다[43].
알 수 있는 바와 같이, 이러한 특성에 대한 대부분의 연구는 AD의 주요 바이오마커 중 하나이지만 유일한 것은 아닌 노인성 플라크의 검출을 지향합니다. 최근에 페리틴과 이에 따른 철 침전물이 MNP 기반 나노접합체에 의해 검출되었다는 논문이 발표되었다[16]. 그러나 이 페리틴 검출용 조영제는 MRI로 검출되지 않고 뇌의 특정 위치에 대한 정량화로만 검출되기 때문에 감도가 낮다. 뇌에서 백질의 손실은 국지적이지 않은 대규모 현상입니다[44]. 따라서 제안된 조영제는 알츠하이머병 바이오마커의 조기 발견에 더 민감할 수 있다고 생각된다. 질병의 초기 단계에서 알츠하이머병과 관련된 다른 바이오마커를 효율적으로 검출할 수 있는 새로운 조영제의 개발을 촉진하는 것이 필요합니다.
반면에 제안된 나노접합체의 구성은 정맥 주사되는 조영제의 효능을 극복하는 데 있어 두 가지 주요 장애물인 혈류의 콜로이드 안정성과 BBB를 성공적으로 통과하여 표적에 도달하는 능력을 해결할 수 있습니다. PEG 사슬이 있는 나노플랫폼의 기능화는 혈류에서 나노접합체의 콜로이드 안정성을 보장할 것입니다[15, 21]. 다른 한편으로, BBB를 가로지르는 전략으로서, MNP와 펩타이드 트랜스페린의 접합[25]은 BBB에 위치한 특정 수용체에 의한 트랜스페린의 인식을 촉진하여 나노컨쥬게이트가 BBB를 가로질러 최종 표적에 결합할 수 있도록 합니다. . 이러한 사실은 나노시스템의 감소된 크기와 알츠하이머병 환자의 BBB 변경과 결합되어 BBB를 통한 나노접합체의 통과를 촉진할 것입니다.
기술된 나노접합체 디자인의 참신함 때문에, 특히 유기체의 조영제 제거 경로를 결정하기 위해 나노플랫폼의 생체적합성 및 투여 용량을 심층적으로 연구할 필요가 있을 것입니다.
