HIV-p24 항원 나노센싱을 위한 수산화칼륨 처리 폴리스티렌 ELISA 표면에 대한 아민-알데하이드 화학 접합

결과 및 토론

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 연구자들이 적절한 항체를 사용하여 다양한 생체분자를 식별하는 데 도움이 되는 효과적인 면역분석법입니다. 분석물(단백질, 펩타이드, 항체 및 앱타머)[21,22,23]의 높은 고정화와 분자(단클론 항체, 다클론 항체 및 항체의 Fc 영역)[24, 25]를 포획하는 능력은 극적으로 개선될 수 있습니다. 탐지의 한계와 분석의 특이성을 지원하는 데 도움이 됩니다. 이를 염두에 두고 여러 유형의 연구에서 ELISA 표면을 화학적으로 수정하여 적절하게 방향이 지정된 프로브 또는 분석물을 더 많은 양으로 포획하는 데 중점을 두고 있습니다. 일반적으로, 항체 또는 단백질은 PS 상의 카르복실기와 단백질 또는 항체 상의 아민기 사이의 정전기적 상호작용을 통해 ELISA PS 표면에 고정화된다. 그러나 이 방법은 결합 제한으로 인해 더 높은 감도와 특이성을 달성하기에 충분히 효율적이지 않습니다. 이 근본적인 문제를 극복하기 위해 현재 조사 중에 효율적인 단백질 고정을 위해 3-(아미노프로필) 트리에톡시실란(APTES) 및 글루타르알데히드(GLU)를 사용하여 화학적으로 기능화된 ELISA 표면을 준비했습니다. 그림 1a에서 볼 수 있듯이 수산화칼륨으로 활성화된 PS 표면은 APTES를 사용하여 아민으로 변형된 다음 GLU로 가교되어 단백질이 부착됩니다. 수산화칼륨 처리가 없는 경우 초기 흡착을 향상시키고 APTES의 더 높은 결합을 유발하는 극성 수소 결합 수용체가 없기 때문에 PS 표면에 부착된 APTES의 최적 수준은 상당히 낮습니다. 그림 1b는 파트너 항체와 함께 화학적으로 변형된 ELISA 표면에서 고정된 단백질의 제안된 검출을 보여줍니다.

화학적으로 변형된 ELISA의 개략도(a ). ELISA 표면은 수산화칼륨 처리 후 APTES와 GLU를 사용하여 화학적으로 개질되었습니다. 항원은 GLU-변형된 표면에 고정화되었다. ㄴ 고정된 항원이 파트너 항체에 의해 감지되었습니다.

이 탐지 전략에 대한 증거를 수집하기 위해 우리는 p24라는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)의 중요한 단백질을 사용하기를 원했습니다. HIV-p24 항원은 HIV 감염 초기에 발현될 수 있는 단백질 중 하나로 다른 바이러스 시스템에서와 같이 숙주 시스템에서 증식한다(그림 2). 온전한 HIV는 캡시드를 덮는 외피에 당단백질이 있으며 HIV-p24 항원은 캡시드 영역에 있습니다(그림 3a). HIV-p24 항원을 검출하기 전에, 우리는 처음에 ELISA 표면에서 HIV-p24 항원을 포획하기 위해 화학적 링커의 농도를 최적화했습니다. 우리는 ELISA 표면에서 APTES와 GLU의 다양한 농도와 조합을 조사하고 일정한 농도의 250 nM HIV-p24 항원을 사용하여 결과를 평가했습니다. 도 3b 및 c에 도시된 바와 같이, 1%의 APTES 및 GLU 적용은 포화된 수준의 HIV-p24 항원 결합을 나타내었다. APTES가 1% 미만으로 존재하는 경우, 2% APTES와 동일한 시간 수준에서 결합 흡광도(OD)가 낮았는데, 이는 비특이성(대조 실험 참고)의 증가 때문이다. GLU의 경우 2% 수준은 0.25의 흡광도에서 HIV-p24 항원의 우수한 검출을 나타내며 동시에 대조군 실험(HIV-p24 제외)은 가장 높은 흡광도(0.16)를 나타냅니다. 최적의 1% APTES 및 GLU는 대조군 실험에서 가장 낮은 흡광도(0.08)를 나타내고 HIV-p24 항원의 특이적 검출 동안 가장 높은 흡광도(0.22)를 나타냅니다. 이 결과는 APTES 및 GLU의 증가에 따라 남아 있는 유리 아민 표면(APTES에서 유래) 및 알데히드 표면(GLU에서 유래)에서 항체를 포획할 수 있기 때문에 발생했습니다. 이 결과는 위의 경우 자유 표면 영역이 BSA로 차단된 경우에도 동일합니다. 방법을 추가로 미세 조정하기 위해 배경 신호를 최소화하기 위해 BSA 농도를 증가시키려는 시도도 했습니다. 그러나 더 높은 APTES 및 GLU 농도에서도 생물학적 오염이 있었습니다. 이러한 결과를 바탕으로 최적화된 조건은 실험에 사용된 1% APTES와 GLU입니다.

HIV와 숙주 세포 상호 작용. HIV 증식의 일반적인 전략이 표시됩니다.

아 온전한 HIV 구조. p24 항원이 표시됩니다. ㄴ APTES 및 GLU의 최적화. APTES(0.5, 1, 2%) 및 GLU(1 및 2%)는 HIV-p24 항원의 일정한 농도(250 nM)를 검출하기 위해 다른 조합과 함께 사용되었습니다.

APTES 및 GLU 최적화 후 GLU를 APTES 수정 표면에 연결하기 위한 배양 시간도 조정했습니다. 그림 4a에서 볼 수 있듯이 GLU를 밤새 배양하면 짧은 배양 시간(3 h)에 비해 흡광도가 가장 높습니다. 이 결과는 GLU가 APTES-변형된 표면에 연결하기 위한 불충분한 배양 시간 때문에 발생합니다. 궁극적으로 항체는 나머지 APTES 표면에 결합할 수 있습니다. GLU의 배양 시간이 증가함에 따라 이 화합물은 APTES 표면을 완전히 덮을 수 있습니다. 이 포화는 GLU 표면의 단백질 고정을 증가시키고 분석 감도를 향상시킵니다. 250nM HIV-p24 농도에서 GLU를 밤새 배양하면 거의 2배 더 높은 흡광도가 있습니다(그림 4a).

GLU의 잠복기 최적화. 아 3 h의 인큐베이션 기간과 1% APTES-modified 표면에서 1% GLU를 사용하여 밤새 인큐베이션하도록 최적화되었습니다. ㄴ 기존 APTES-GLU-p24(방법 1) 및 APTES-GLU 사전 혼합 p24(방법 2)의 세 가지 다른 접근 방식으로 125 nM p24 검출

증가된 흡광도 및 p24의 특이적 검출과 함께 GLU의 밤새 인큐베이션 후 더 높은 진짜 신호로 인해 우리는 추가 실험을 위해 유사한 조건을 사용했습니다. 이 경우 APTES로 변형된 표면에 GLU를 고정화한 다음 단백질을 부착했습니다(방법 1). 우리는 또한 다른 접근 방식을 시도했습니다. 먼저 1% GLU와 125 nM HIV-p24 항원을 혼합한 다음 이 혼합물을 아민 변형 PS 표면에 추가했습니다(방법 2). 놀랍게도, 방법 2에서 사용된 농도와 동일한 농도의 HIV-p24 항원(OD 0.161에서 0.23)으로 증가된 흡광도가 있었습니다. 단백질이 프리믹스로 GLU에 결합하도록 했을 때 거의 모든 단백질이 GLU에 결합할 수 있으며, 이 혼합물은 아민-변형된 표면에 쉽게 흡착됩니다. 그러나, 단백질이 미리 고정된 GLU 표면에 결합되도록 했을 때, GLU의 알데히드 그룹의 대부분은 이용가능하지 않았다. 그림 4b는 혼합 방법이 흡광도가 더 높은 유사한 농도(125 nM)의 HIV-p24 항원의 검출을 보여줍니다. 또한 방법 1과 방법 2는 동일한 농도의 HIV-p24 항원에서 기존 방법에 비해 더 높은 흡광도를 나타냈습니다.

검출 단계를 완전히 최적화한 후 검출 한계를 찾기 위해 HIV-p24 항원을 피코몰에서 나노몰 범위(500pM ~ 500 nM)로 적정했습니다. 우리는 세 가지 다른 방법, 즉 기존의 APTES-GLU-p24(방법 1:APTES에 고정된 p24 후 GLU 수정) 및 APTES-GLU-premixed HIV-p24(방법 2:p24와 GLU의 사전 혼합 후 동일한 농도의 p24로 APTES에 고정화). 그림 5에서 볼 수 있듯이 p24의 검출한계는 기존 ELISA의 경우 30 nM로 나타났다. 방법 1에서는 기존 ELISA에 비해 검출한계를 8배(4 nM) 향상시켰다. 이러한 결과는 화학적으로 개질된 PS 표면을 사용했을 때 균일한 배열 하에서 단백질 고정화가 안정적이었고, 고정화율도 기존의 ELISA 표면에 단백질 흡착에 비해 상당히 높았기 때문이다. Vashist et al. [12]는 이미 APTES로 변형된 ELISA 표면에 항체의 더 높은 고정화가 기존 ELISA에 비해 극적으로 향상된 검출 수준과 관련이 있음을 보여주었다[12]. 그들의 작업에서 APTES의 아민은 항체의 카르복실기에 결합할 수 있으며, 이러한 방식으로 그들은 항체를 ELISA 표면에 화학적으로 고정화했습니다. 이 방법을 사용하면 카르복실기를 통해 ELISA 표면에 항체를 고정할 수만 있지만 APTES에서는 단백질 기반 항원 고정이 불가능합니다. 이를 위해 우리는 ELISA PS 표면에 단백질을 고정시키기 위해 GLU 링커를 도입했습니다. 이러한 화학적 링커는 글루타르알데하이드의 알데하이드에 아민 커플링을 통해 단백질뿐만 아니라 항체도 화학적으로 연결하였다. 대조 실험을 사용하여 ELISA 기질에 대한 생체 분자의 비특이적 부착을 모니터링했습니다. 대조군 실험은 표적 분자(HIV-p24) 없이 수행하였다. 표적이 없으면 p24에 대한 특이적 항체가 표면에 결합할 수 없어 효소가 결합된 2차 항체도 ELISA 표면에 고정되지 않는다. 이 경우 기질(TMB)을 추가했을 때 흡광도의 변화를 찾을 수 없습니다.

HIV-p24 항원에 대한 검출 한계. p24는 0.5에서 500 nM으로 적정되었습니다. 세 가지 다른 접근 방식, 즉 기존 방식과 방법 1 및 2를 따랐습니다.

검출 한계를 개선하기 위해 APTES로 변형된 표면에 고정화 단계 전에 GLU와 HIV-p24 항원을 미리 혼합하려고 했습니다. GLU와 HIV-p24 항원의 사전혼합은 ELISA 표면에 단백질이 더 많이 고정되면 개선될 것으로 예상되었습니다. GLU와 HIV-p24 항원을 미리 혼합하면 aldehyde와 GLU의 결합 비율이 높습니다. 이 혼합물을 ELISA 표면에 추가하면 고정화 속도가 향상됩니다. Dixit et al. 그들은 ELISA 플레이트에 고정화하기 전에 항체와 APTES를 미리 혼합할 때 접근 방식이 ELISA 표면에 항체의 고정성을 향상시키고 검출 한계가 증가한다는 것을 발견했습니다[12]. 본 연구에서는 예상대로 고정화 전에 GLU와 HIV-p24 항원을 미리 혼합했을 때 검출한계가 1 nM로 향상되었으며 검출한계가 30회였던 기존 ELISA보다 30배 이상 높았다. NM. 우리의 전략은 검출 한계를 개선했을 뿐만 아니라 모든 농도의 HIV-p24 항원에 대한 흡광도를 개선했습니다. 250 nM p24에서 흡광도는 0.35로 동일한 농도의 HIV-p24 항원을 사용하는 기존 ELISA의 거의 두 배인 것을 관찰했습니다. 모든 HIV-p24 항원 농도에서 기존 ELISA와 비교하여 흡광도에서 큰 차이가 나타났습니다(그림 5). 이는 HIV-p24 항원의 신뢰할 수 있는 검출에서 분명합니다.

분석 특이성을 평가하기 위해 두 가지 다른 대조 실험으로 테스트를 수행했습니다. 인간 혈청과 HIV-TAT를 선택하고 HIV-p24 항원 대신 GLU와 혼합하여 사용하고 특이성을 평가했습니다. 도 6에 나타난 바와 같이, 인간 혈청 및 HIV-TAT의 경우에는 유의한 흡광도가 없고; 그러나, 250 nM HIV-p24 항원은 흡광도에서 분명한 증가를 나타냈다. 이 결과는 화학적으로 변형된 ELISA 표면에서 HIV-p24 항원이 더 높은 감도로 특이적으로 검출되었음을 확인시켜줍니다.

HIV-p24 항원의 특정 검출. HIV-p24 대신 인간 혈청과 HIV-TAT 단백질을 사용하여 특이성 확인