여러 종양 치료 기능을 하나의 나노 플랫폼에 통합하는 것은 최근 몇 년 동안 새로운 종양 치료 전략이었습니다. 여기서, 몰리브덴 셀레나이드 나노닷(MoSe2 NDs) 및 소 혈청 알부민(BSA) 조립 나노구(MoSe2 @BSA NSs)가 성공적으로 합성되었습니다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) "가교"를 통한 엽산(FA) 분자의 접합 후, FA-MoSe2 @BSA NS는 종양 표적화 기능을 갖추고 있습니다. BSA 및 PEG 변형은 불안정한 MoSe2를 제공했습니다. 생리학적 안정성이 우수한 ND. 최종 제품 FA-MoSe2 이후 @BSA NS는 근적외선(NIR) 및 X선 흡광도가 강하고 광열 안정성과 방사선 감작성이 우수한 우수한 광열 특성을 나타내므로 광열 방사선 요법제로 탐색되었습니다. 시험관 내 및 생체 내 실험에서 FA-MoSe2 @BSA NS는 고효율 종양 표적화 효과, 뛰어난 생체 적합성 및 시너지 광열 방사선 치료 효과를 보유하고 있습니다. 이 연구는 그러한 생체적합성 FA-MoSe2 @BSA NS는 복합 종양 치료에 사용하기 위한 유망한 다기능 이중 양식 종양 치료제가 될 수 있습니다.
<섹션 데이터-제목="배경">전 세계적으로 유방암은 여성에서 매우 높은 발병률로 발생하며 낮은 생존율과 높은 전이 및 재발률로 악명이 높습니다[1,2,3]. 외과적 절제, 방사선 요법(RT) 및 화학 요법은 이러한 치료법이 단점이 있음에도 불구하고 실제로 일반적으로 사용되는 치료 전략입니다[4]. RT는 매우 효과적인 치료법이지만 정상 조직에도 해롭습니다. RT는 해로운 효과를 줄이면서 치료 효과를 향상시키기 위해 연구되었습니다. RT는 이온화 방사선(예:γ-선, X-선)을 사용하여 물 분자를 반응성 자유 라디칼로 이온화하여 암 세포의 DNA를 국부적으로, 심지어 깊은 영역까지 손상시킵니다[5]. 종양 미세환경이 저산소 상태인 것으로 보고되었기 때문에 이것이 RT의 주요 장애물 중 하나로 간주되었습니다[6, 7]. 이러한 단점을 감안할 때 RT와 다른 치료 전략을 결합하는 것이 치료 효과를 높이는 데 효과적인 것으로 보고되었습니다. 현재까지 광열 요법(PTT)은 부작용이 적고 특이도가 높으며 정상 조직에 대한 부작용이 적기 때문에 최소 침습적 암 치료법으로 광범위하게 연구되었습니다[8,9,10,11,12,13,14,15 ]. 그러나, 특히 접근 불가능한 종양의 경우 불완전한 종양 억제로 인해 PTT만으로는 불충분하여 종종 종양 재발을 유발할 수 있습니다[16,17,18]. 흥미롭게도, PTT는 근적외선(NIR)으로 유도된 고열로 종양 내 혈액 순환을 증가시키고, 이어서 종양 미세 환경에서 산소 가용성을 증가시켜 세포가 RT에 더 민감하게 되는 것으로 보고되었습니다[19,20,21]. RT와 PTT를 결합하면 암의 치료 결과를 개선하는 데 바람직한 두 가지 장점을 결합할 수 있습니다.
최근 MoS2와 같은 2차원(2D) 층 전이 금속 디칼코게나이드(TMD) , WS2 , ReS2 등은 물리적 특성으로 인해 PTT 또는 RT의 효능을 향상시키기 위한 근적외선 흡착제 또는 방사선 증감제로 사용되어 왔다[7, 19, 21]. Shen과 공동 저자는 균일한 초박형 ReS2의 상향식 준비를 보고했습니다. 이미지 유도 고효율 PTT 및 RT용 나노시트 [21]. 이러한 TMD 외에도 몰리브덴 셀렌화물(MoSe2 ) PTT에 대한 NIR 광열 변환기로 보고되었습니다[22, 23]. PTT만으로는 단점이 있기 때문에 MoSe2를 악용할 이유가 더 많습니다. 더 나은 암 치료를 위한 방사선 감작과 같은 속성입니다.
이번 작업에서는 먼저 초소형 MoSe2를 준비했습니다. 그런 다음 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 나노스피어(NS)로 조립되고 최종적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG) "다리"를 통해 종양 표적 분자 엽산(FA)과 접합됩니다. 뛰어난 광열 효과와 더불어 얻어진 FA-MoSe2 @BSA NS는 우수한 무선 감도 특성을 갖는 것으로 밝혀졌습니다. BSA 수정은 MoSe2를 부여했습니다. 생리적 안정성과 생체적합성이 우수한 나노닷(ND) 시험관 내 및 생체 내 실험에서 FA-MoSe2 @BSA NS는 우수한 종양 표적화 효과를 나타내면서 동시에 건강 조직에 독성이 없는 상승적 광열 방사선 요법을 위한 NIR 광열제 및 방사선 증감제 역할을 했습니다.
FA-PEG5000 -NHS 및 CH3 -PEG5000 -NHS는 Shanghai Ponsure Biotech에서 입수했습니다. Co. Ltd. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 소 혈청 알부민(BSA, 정제 ≥ 98.0%), 벌크 MoSe2 분말 및 Calcein-AM (CA)-propidium iodide (PI) 염색은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)은 Aladdin(Shanghai, China)에서 구입했습니다. 세포 배양 시약은 모두 Corning Inc.에서 제공했습니다. 세포 계수 키트-8(CCK-8)은 Dojindo Laboratories(일본)에서 제공했습니다. γ-H2AX 항체는 Millipore(Temecula, CA)에서 공급했습니다.
첫째, 일반적인 절차에서 50mg MoSe2 분말을 20분 동안 교반하면서 25mL 증류수에 첨가한 다음, 팁 초음파 처리(Scientz-IID, 950 W, 25kHz)를 사용하여 ice-bath에서 초음파 처리했습니다. 초음파 처리는 70% 진폭으로 12시간의 총 초음파 처리 시간 동안 2초 켜기 및 3초 끄기로 펄스되었습니다. 그 후, 혼합물을 6000rpm으로 25분 동안 원심분리했습니다. 상층액을 수집하고 12,000rpm에서 30분 동안 다시 원심분리하여 MoSe2를 생성했습니다. 나노도트(MoSe2 NDs) 솔루션입니다. 그 후, 25mg의 BSA 분말을 약간 교반하면서 상기 상층액에 첨가하여 25°C 및 pH =7.4에서 6시간 동안 교반한 후 경화된 코아세르베이트를 형성한 다음, 0.5% 글루타르알데히드(250μL)로 가교 처리하였다. 그 후 1일 동안 물에서 투석하여 글루타르알데히드를 제거하여 MoSe2 @BSA 나노스피어(MoSe2 @BSA NS). 다음, MoSe2 @BSA 나노스피어는 두 부분으로 나뉘었고, 하나는 FA-PEG5000와 혼합되었습니다. -NHS(8 mg), 다른 하나는 CH3와 혼합 -PEG5000 -NHS(8mg) 용액을 넣고 2시간 동안 교반합니다. 마지막으로 용액을 물에 투석하여 정제된 FA-MoSe2 @BSA NS 및 MoSe2 @BSA NS 솔루션. 준비된 용액을 4°C에서 보관했습니다. 또한 UV-VIS 분광계를 사용하여 FA-MoSe2에서 FA를 정량화했습니다. @BSA NS입니다. 구체적으로 MoSe2를 혼합한 후 @BSA 나노스피어 및 FA-PEG5000 -NHS(8mg) 및 2시간 동안 반응, 혼합물을 원심분리하여 무한한 FA를 제거했습니다. 흡수 검출을 위해 상층액을 수집하였다. FA 농도는 FA 흡수 피크 파장(280nm)에서 UV-vis 분광계로 감지했습니다. FA 캡슐화 효율(EE)은 다음 방정식에 설명된 대로 계산되었습니다.
$$ \mathrm{EE}\ \left(\%\right)=\frac{{\mathrm{FA}}_{\mathrm{총계}}-{\mathrm{FA}}_{\mathrm{무부하} }}{{\mathrm{FA}}_{\mathrm{총}}}\times 100\% $$시료의 형태는 투과전자현미경(TEM, JEOL JEM2011, Tokyo, Japan)과 주사전자현미경(SEM, Hitachi FE-SEM S-9300, Janpan)으로 관찰하였다. Zetasizer(Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., UK)는 크기와 제타 전위를 사용하였다. 자외선 가시광선(UV-Vis) 흡수 스펙트럼은 UV2550 자외선 가시광선 분광광도계(Shimadzu, Kyoto, Japan)에서 기록되었습니다. 푸리에 변환 적외선(FTIR) 스펙트럼은 FTIR 분광계(BRUKER VERTEX 70, Ettlingen, Germany)에 의해 검출되었습니다. 나노구체의 X선 분말 회절(XRD)은 X선 회절계(Seifert Jso-Debyerex-2002, Germany)로 기록하였다. 세포 및 조직의 Mo 함량은 유도 결합 플라즈마-원자 방출 분광법(ICP-AES, Hitachi P4010, Japan)으로 측정하였다. NIR 조사 동안 열전대 온도계(Fluke, USA)를 사용하여 30초마다 온도 변화를 기록했습니다.
마우스 유방 종양 4T1 세포를 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하고 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 37°C, 5% CO2에서 배양했습니다. .
세포 흡수를 위해 FITC를 사용하여 물리적 흡수를 통해 NS에 라벨을 붙였습니다. 6웰 플레이트의 유리 슬라이드에 4T1 세포를 부착하고 유리 FITC, MoSe2와 함께 배양했습니다. @BSA NS, FA-MoSe2 @BSA NS + FA 및 FA-MoSe2 @BSA NS는 동일한 농도의 FITC(0.05mg/mL)에서 각각 3시간 동안 사용합니다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 글루타르알데히드 0.2mL로 고정한 후 DAPI로 10분간 염색하였다. 세포의 형광 이미지는 레이저 주사 현미경을 사용하여 캡처되었습니다. 세포 흡수를 더 관찰하기 위해 4T1 세포(2 × 10 5 세포/웰)을 6웰 세포 배양 플레이트에서 24시간 동안 배양한 다음 MoSe2와 함께 배양했습니다. @BSA NS, FA-MoSe2 @BSA NS + FA 및 FA-MoSe2 추가 3시간 동안 @BSA NS 그 후, 처리된 세포를 PBS로 3회 부드럽게 세척하고, 균질화하고, 1mL 왕수 용액으로 4시간 동안 처리하였다. ICP-AES는 세포 내부의 Mo 함량을 감지하는 데 사용되었습니다. 흡수율 =\( \frac{\mathrm{Ma}}{\mathrm{Mb}} \)× 100%, 여기서 Ma는 세포 내부 Mo의 질량이고 Mb는 추가된 Mo 전체의 질량입니다.
첫째, FA-MoSe2의 체외 용혈을 감지하기 위해 건강 마우스 전혈을 수집했습니다. @BSA NS입니다. 구체적으로, 적혈구(RBC)는 원심분리에 의해 수집되었다. 상층액을 버리고 수집된 적혈구를 FA-MoSe2와 혼합했습니다. @BSA NS(PBS 내, 1:4) 사전 결정된 농도(50μg/mL, 100μg/mL, 150μg/mL, 200μg/mL 및 400μg/mL). 양성 또는 음성 대조군으로서, RBC를 탈이온수 또는 PBS와 함께 인큐베이션하였다. 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 위의 현탁액 세트를 원심분리하고(10,000rpm, 1분) 541nm에서 상청액의 흡광도를 UV-Vis 분광기로 모니터링했습니다. 용혈율은 다음 식을 이용하여 계산하였다.
$$ \mathrm{HR}\ \left(\%\right)=\frac{\ {A}_t-{A}_{nc}}{A_{pc}-{A}_{nc}}\times 100\% $$여기서 A 그 , A PC , 및 A nc 는 각각 테스트 샘플, 양성 및 음성 대조군의 541 nm에서 상등액의 흡광도입니다.
또한 MoSe2의 세포독성은 @BSA NS 및 FA-MoSe2 @BSA NS는 표준 CCK-8 분석에 의해 검출되었습니다. 4T1 셀(1 × 10 5 세포/mL, 0.5mL)를 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양했습니다. 기존 배지를 폐기한 후 0.01, 0.1, 0.15, 0.3 및 0.4mg/mL의 MoSe2를 포함하는 새 배지 @BSA NS 및 FA-MoSe2 @BSA NS는 24시간 동안 4T1 세포와 함께 배양되었습니다. PBS를 사용하여 세포를 3회 부드럽게 세척했습니다. 그런 다음 100μL CCK-8 작업 용액(10% CCK-8 + 90% DMEM)을 각 웰에 첨가한 다음 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 마이크로플레이트 리더(Labtech, Inc., Durham, North Carolina)를 사용하여 450nm의 흡광도 값을 감지했습니다.
먼저, NS의 시험관 내 광열 성능을 조사했습니다. 모스2 @BSA NS 및 FA-MoSe2 동일한 Mo 농도의 @BSA NS를 세포와 함께 3시간 동안 배양한 다음 5분 동안 NIR 조사(808nm, 1W/cm 2 ) ). 각 well의 처리된 세포의 온도는 적외선 열화상 카메라(Fluke TI25, USA)로 각각 감지하였다.
다음으로, 체외 광열 요법을 위해 부착된 4T1 세포를 MoSe2 농도를 다르게 배양했습니다. @BSA NS 및 FA-MoSe2 3시간 동안 @BSA NS 세포 외부의 NS가 제거되었습니다. 그런 다음 세포를 NIR(808 nm, 1 W/cm 2 , 5분) 및 다양한 X선 조사량(RT, 0–5 Gy, 0.084 Gy/s). 또 다른 24시간 배양 후, 표준 CCK-8 분석에 의해 세포 생존력이 검출되었다. 위의 처리된 세포를 calcein-AM/PI로 공동 염색하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 감지한 다음 공초점 레이저 주사 현미경(calcein-AM:Ex =488 nm, Em =515 nm, PI:Ex =535nm, Em =617nm). 또한, 처리된 세포를 γ-H2AX 면역형광법으로도 분석하였다. 상기 처리 후, 세포를 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고 - 20°C에서 15분 동안 메탄올로 투과화하고 PBS로 세척하였다. 그 후, 세포를 25°C에서 1시간 동안 차단 완충액(PBS 용액 중 1% BSA)과 혼합하고 4°C에서 밤새 항-포스포-히스톤 γ-H2AX 마우스 모노클로날 항체(1:500 희석)와 함께 인큐베이션했습니다. 씨. PBS 세척 후 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 세포의 형광을 관찰했습니다.
Balb/c 누드 마우스(5-8주령)는 Charles River Laboratories(중국 베이징)에서 제공되었습니다. 동물 4T1 종양 모델을 설정하려면 10 6 중 150μL 현탁 세포를 마우스의 등에 피하 주사하였다. 마우스는 동물실에서 먹이를 주고 2일마다 관찰했습니다. 이 연구의 모든 복지 및 실험 절차는 국가 보건부의 정책에 따라 수행되었으며 Shangqiu City First People's Hospital의 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 종양 부피가 100mm 3 에 도달한 경우 , 마우스를 생체 내 실험에 적용했습니다.
NS의 전신 생체 분포는 4T1 종양 보유 마우스에서 조사되었습니다. MoSe2 정맥 주사 후 1시간, 1일, 7일, 24일 @BSA NS 및 FA-MoSe2 @BSA(10mg/kg), 종양 및 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐 및 신장)의 무게를 측정하고 왕수 용액으로 12시간 소화했습니다. 이 조직의 Mo 및 Se 함량은 ICP-AES로 분석되었습니다. 또한 건강한 Balb/c 마우스에 FA-MoSe2를 정맥 주사했습니다. @BSA(10mg/kg). 생쥐 꼬리에서 약 10μL의 혈액을 채취하여 ICP-AES로 혈액 순환을 분석했습니다.
생체 내 광열 방사선 요법의 경우, 종양 보유 마우스(n =5/그룹) PBS + NIR, PBS + RT, MoSe2로 처리 @BSA NSs + NIR + RT, FA-MoSe2 @BSA NSs + RT, FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR 및 FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT(5mg/kg의 MoSe2 포함) ). 방사선 치료 선량은 5Gy였습니다. 주사 후 24시간에 종양 부위에 5분 NIR 조사(808 nm, 1 W/cm 2 ). 조사하는 동안 마우스의 열화상은 적외선 열화상 카메라로 기록되었습니다. 다음 30일 동안 종양의 길이와 너비를 4일마다 모니터링했습니다. 상대적 종양 부피는 V로 계산되었습니다. /V 0 , 여기서 V 0 치료가 시작되었을 때의 종양 부피를 나타냅니다. 한편, 각 마우스의 체중도 4일마다 모니터링했습니다.
생체 내 생체 적합성을 위해 150μL의 FA-MoSe2 @BSA NS(15mg/kg)를 건강한 Balb/c 누드 마우스에 정맥 주사했습니다. 주사 전과 30일 후에 혈액을 채취하여 백혈구(WBC), 적혈구(RBC), 헤모글로빈(HGB), 평균 혈소판 부피(MPV), 평균 미립자 헤모글로빈(MCH), 헤마토크릿(HCT), 평균 미립자 헤모글로빈 농도(MCHC), 평균 미립자 용적(MCV) 및 혈소판(PLT). 동시에, 마우스를 희생시키고 심장, 간, 비장, 폐 및 신장을 수집하였다. 얻어진 장기를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 5μm 슬라이스로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색했습니다. 염색된 부분을 디지털 현미경으로 이미지화했습니다.
데이터는 평균 ± SD로 표시되었습니다. 양측 학생의 t 테스트는 두 그룹의 통계적 유의성을 분석하는 데 사용되었습니다. 차이는 *P에 대해 유의미한 것으로 간주되었습니다. <0.05 및 **P에 대해 매우 중요 <0.01.
FA-MoSe2의 준비 절차 @BSA NS는 그림 1a에 나와 있습니다. 간단히 말해서 불안정한 MoSe2 나노도트는 벌크 MoSe2에서 준비되었습니다. 초음파 처리 후 BSA 단백질에 의해 안정화 및 조립되고 PEG "다리"를 통해 표적 분자 FA에 동시에 접합됩니다. 준비된 MoSe2 ND는 TEM에서 관찰된 바와 같이 초소형 나노점이었습니다(그림 1b). MoSe2의 XRD 패턴 ND는 추가 파일 1:그림 S1에 표시되었습니다. 13.1°에서의 회절 피크는 (002) 평면에 속하며, 벌크 MoSe2의 피크 위치와 일치합니다. . 뚜렷한 (002) 피크는 MoSe2의 c축에 몇 개의 레이어가 있음을 나타냅니다. NDs. MoSe2에 대한 (100) 평면의 회절 피크 ND는 벌크 MoSe2와 비교하여 크게 확장됩니다. , 이는 MoSe2의 크기 감소로 인해 발생할 수 있습니다. ND[23]. BSA 단백질 및 FA와의 조립 및 접합 후 나노복합체는 구형 입자를 형성했습니다(그림 1c). FTIR 스펙트럼은 FA-MoSe2에서 –CONH- 결합의 존재를 보여주었습니다. @BSA NS, FA가 MoSe2에 접합되었을 가능성이 있음을 나타냅니다. 에스테르 결합을 통해(추가 파일 1:그림 S2). 또한 FA-MoSe2에서 FA를 정량화했습니다. @BSA 나노스피어는 10.5 ± 0.11%였습니다. DLS 분석 결과 MoSe2의 평균 직경 ND 및 FA-MoSe2 @BSA NS는 각각 약 3.8nm 및 139.8nm였습니다(그림 1d). 7일 보관 후 MoSe2 크기 ND는 3.8nm에서 63.2nm로 증가했으며 FA-MoSe2 @BSA NS는 MoSe2의 응집 및 낮은 안정성을 나타내는 크기의 명백한 변화를 나타내지 않았습니다(그림 1e). 장기 보관의 ND. 또한, 물, PBS, 세포배지와 같은 다른 매질에 분산시 FA-MoSe2 @BSA NS는 유사한 크기 분포를 나타냅니다(그림 1f). 이 결과는 FA-MoSe2 @BSA NS는 생리학적 조건에서 안정적이며 이로 인해 MoSe2의 안정성이 향상되었습니다. ND는 BSA 어셈블리 및 PEG 코팅에 기인한 것 같습니다[24, 25]. 그림 1g와 같이 MoSe2의 자외선 가시광선(UV-Vis) 스펙트럼 ND 및 FA-MoSe2 @BSA NS는 유사하게 높은 NIR 흡광도 특성을 나타내어 BSA 및 FA 수정이 MoSe2의 흡광도에 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다. .
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아 FA-MoSe2의 개략도 @BSA NS 합성. ㄴ MoSe2의 TEM 이미지 NDs. 삽입된 이미지는 고해상도 TEM 이미지입니다. ㄷ FA-MoSe2의 TEM 및 SEM 이미지 @BSA NS입니다. d MoSe2의 크기 분포 ND 및 FA-MoSe2 @BSA NS입니다. 이 MoSe2의 크기 변경 ND 및 FA-MoSe2 @BSA NS를 7일 동안 물에 담가둡니다. 에 FA-MoSe2의 크기 분포 @BSA NS는 각각 물, PBS 및 배지에 있습니다. 지 MoSe2의 흡광도 스펙트럼 ND 및 FA-MoSe2 @BSA NS
그림 2a는 FA-MoSe2의 온도를 보여줍니다. @BSA NSs 용액은 농도가 증가함에 따라 증가했습니다(0–200μg/mL). NIR 조사 후(808nm, 1W/cm 2 ) 5분 동안 FA-MoSe2의 온도 변화 200μg/mL의 @BSA NSs 용액은 약 41°C에 도달한 반면 순수한 물의 온도는 동일한 조건에서 약 1.5°C만 증가했습니다. 또한, FA-MoSe2의 온도 변화 다른 전력 강도(0.5–2.0 W/cm 2 )에서 조사된 @BSA NS )도 5분 동안 녹음되었습니다. 그림 2b에서 볼 수 있듯이 레이저 출력 강도가 증가함에 따라 온도가 최대 40.6°C까지 증가했습니다. 그림 2c는 FA-MoSe2의 광안정성을 보여줍니다. @BSA NS, FA-MoSe2 @BSA NS는 NIR 조사의 3주기 후에 온도 상승의 감쇠 없이 탁월한 광열 효과를 유지했습니다. 이 결과는 FA-MoSe2 @BSA NS는 상당한 광안정성과 우수한 광열 특성을 가졌습니다. 그림 2d와 같이 FA-MoSe2의 Hounsfield unit(HU) 값 컴퓨터 단층 촬영(CT)으로 얻은 @BSA NSs 이미지는 농도와 양의 상관 관계가 있어 NS가 잠재적으로 방사선 과민제로 사용될 수 있음을 나타냅니다.
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아 FA-MoSe2의 광열 가열 곡선 1W/cm 2 의 출력 밀도에서 808nm 레이저 조사에서 다양한 농도(0, 50, 100, 200μg/mL)의 @BSA NSs 솔루션 . ㄴ FA-MoSe2의 광열 가열 곡선 다양한 출력 밀도(0.5, 1, 1.5, 2W/cm 2 )에서 808nm 레이저 조사, 100μg/mL의 @BSA NSs 솔루션 ). ㄷ FA-MoSe2의 온도 변화 1W/cm 2 의 전력 밀도에서 808nm 레이저 조사의 3주기에서 @BSA NS . d FA-MoSe2의 CT 이미지(삽입) 및 HU 값 농도가 다른 @BSA NS
세포 흡수를 평가하기 위해 MoSe2 @BSA NS 및 FA-MoSe2 @BSA NS는 FITC에서 레이블을 지정했습니다. 그림 3a와 같이 FA-MoSe2에서 세포질 내부에서 훨씬 더 강한 FITC 형광이 관찰되었습니다. @BSA NSs 처리된 세포, MoSe2의 세포와 비교 @BSA NSs 및 무료 FITC 처리된 세포. ICP-AES 정량 분석은 FA-MoSe2의 더 높은 세포 흡수를 보여주었습니다. @BSA NS는 MoSe2보다 @BSA NS(그림 3b). 이러한 결과는 FA가 FA-MoSe2의 세포 흡수를 향상시켰음을 보여줍니다. @BSA NS입니다. 흥미롭게도 FA 차단 후 FA-MoSe2 @BSA NSs 처리된 세포는 FA 차단이 없는 세포와 비교하여 세포질 내부에서 더 약한 녹색 FITC 형광을 보였다. 해당하는 FA-MoSe2의 세포 흡수율 @BSA NSs + FA 처리된 세포는 FA-MoSe보다 적습니다2 @BSA NS 처리된 세포. 이는 세포막의 FA 수용체가 (유리 FA에 의해) 방해를 받아 FA-MoSe2의 표적화 능력과 접근성을 감소시킨다는 것을 나타냅니다. @BSA NS입니다. 또한 FA 수용체가 4T1 세포에서 과발현되고 FA-MoSe2@BSA NS가 수용체 매개 엔도사이토시스 경로를 통해 세포로 들어간다는 것을 보여줍니다[26, 27].
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아 유리 FITC 및 FITC 표지 MoSe2와 함께 배양 후 4T1 세포의 공초점 형광 이미지 @BSA NS, FA-MoSe2 @BSA NS + FA 차단 및 FA-MoSe2 @BSA NS입니다. 빨간색과 파란색은 각각 FITC 형광 및 DAPI 염색 세포 핵을 나타냅니다. ㄴ MoSe2에 대한 4T1 세포의 ICP-AES 정량 분석 @BSA NS, FA-MoSe2 @BSA NS + FA 차단 및 FA-MoSe2 @BSA NS
NS의 시험관 내 생체 적합성은 용혈 및 세포 독성 분석에 의해 평가되었습니다. 그림 4a는 FA-MoSe2에 대해 명백한 용혈을 보여주지 않았습니다. @BSA NS 처리 적혈구(RBC) 또는 PBS 처리 RBC. 또한 MoSe2 농도가 최대 0.4mg/mL인 경우 @BSA NS 및 FA-MoSe2 @BSA NS는 24시간 동안 세포와 함께 배양되었으며 10% 미만의 생존 억제가 있었습니다. 이 결과는 FA-MoSe2 @BSA NS는 시험관 내 생체 적합성이 뛰어납니다.
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아 FA-MoSe2와 함께 1시간 배양 후 적혈구의 용혈 비율 다른 농도의 @BSA NS. 삽입된 사진은 증류수, PBS 및 FA-MoSe2에 노출된 적혈구의 사진을 보여줍니다. 농도가 다른 @BSA NS에 이어 원심분리. ㄴ MoSe2에 대한 처리 후 4T1 세포의 세포 생존율 @BSA NS 및 FA-MoSe2 24시간 동안 다양한 농도의 @BSA NS
그림 5a, b와 같이 FA-MoSe2로 처리된 세포 @BSA NS는 5분의 NIR 조사(808 nm, 1 W/cm 2 ) 후 가장 높은 온도 증가(ΔT =23.6 °C)를 보였습니다. ) MoSe2와 비교 @BSA NS 및 PBS 처리된 세포. 그림 5c는 FA-MoSe2를 추가하여 RT 효능이 향상되었음을 보여줍니다. @BSA NS입니다. X선 선량이 증가함에 따라 FA-MoSe2의 RT 효능 @BSA NS는 MoSe2보다 훨씬 더 향상되었습니다. @BSA NS입니다. FA-MoSe2 @BSA NS는 종양 세포 내부에 X선 방사선 에너지를 집중시키고 2차 오제 전자를 생성하여 DNA 손상 및 세포 성장 억제를 초래할 수 있는 X선 감쇠 능력으로 인해 방사선 치료 효과를 향상시킬 수 있습니다[28, 29].
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아 PBS, MoSe2의 열화상 @BSA NS 및 FA-MoSe2 @BSA NS 처리된 세포 및 b 808nm 레이저(1 W/cm 2 )를 지속적으로 조사했을 때의 해당 온도 변화 곡선 ). ㄷ PBS, MoSe2로 처리된 4 T1 세포의 세포 생존율 @BSA NS 및 FA-MoSe2 @BSA NS는 서로 다른 선량의 X선 조사(0–5 Gy)와 결합됩니다. d 808nm NIR 레이저(5분, 1W/cm 2 )에서 다양한 샘플로 처리된 4T1 세포의 세포 생존율 ) 및 X선(5Gy) 조사
결합된 RT 및 PTT 치료 효과의 추가 평가를 위해 4T1 세포를 NIR 또는 RT, FA-MoSe2로만 처리했습니다. @BSA NSs + RT, FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR 또는 FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT. 그림 5d와 같이 FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT 처리군은 92.8%의 억제율로 가장 유의한 농도 의존적 세포 사멸을 나타냈다. FA-MoSe2의 우수한 치료 효과 @BSA NS는 (1) FA-MoSe2의 RT에 의한 PTT의 광열 절제 및 DNA 손상으로 인한 것 같습니다. @BSA NS 및 (2) FA 타겟팅은 FA-MoSe2의 세포 내재화를 향상시켰습니다. @BSA NS는 세포를 죽이기 위해 더 많은 열과 X선을 발생시킵니다.
그림 6a에서 볼 수 있듯이 PBS + NIR 및 PBS + RT 대조군에서는 죽은 세포가 거의 관찰되지 않았습니다. FA-MoSe2에서 죽은 세포가 발견되었지만 @BSA NSs + RT 또는 FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR 그룹, 하지만 살아있는 세포는 여전히 존재했습니다. 반대로 FA-MoSe2에서는 @BSA NSs + NIR + RT 그룹, 95% 이상의 세포가 손상되어 적색 형광을 나타내어 FA-MoSe2의 결합된 RT 및 PTT를 나타냅니다. @BSA NS는 치료 효율성을 높일 수 있습니다.
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아 살아있는 데드 및 b PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe2로 처리된 4T1 세포의 γ-H2AX 염색 이미지 @BSA NS, FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR, FA-MoSe2 @BSA NSs + RT 및 FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT, 각각
FA-MoSe2 이후 @BSA NS는 X선 흡광도가 높기 때문에 RT를 향상시킬 수 있는 가능성이 있습니다. 그림 6b에서 볼 수 있듯이 PBS 처리군인 FA-MoSe2에서 매우 낮은 수준의 γ-H2AX 신호가 관찰되었습니다. @BSA NS 전용 및 FA-MoSe2 @BSA NS + NIR 처리 그룹. 한편, FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT 처리 그룹은 더 높은 수준의 γ-H2AX 신호를 보여 세포 핵 내부의 더 심각한 DNA 손상을 나타냅니다. 이 결과는 FA-MoSe2 @BSA NS는 종양 세포 내부에 X선 방사선 에너지를 집중시키고 2차 전자 및 오제 전자를 생성하여 DNA 손상 및 세포 성장 억제를 일으키는 X선 감쇠 능력으로 인해 RT 효과를 향상시킬 수 있습니다[30-32].
그림 7a, b에서 볼 수 있듯이 주입 후 24시간에 간과 신장을 제외한 종양에 Mo 및 Se 원소가 축적되었습니다. MoSe2 주입 후 종양 조직의 Mo 요소 함량 @BSA NS 및 FA-MoSe2 @BSA NS도 평가되었습니다. 그림 7c에서 볼 수 있듯이 FA-MoSe2에 대한 종양 조직의 Mo 수준 @BSA NSs 처리군은 시간이 지남에 따라 증가하여 주사 후 24시간에 최고점에 도달했으며 이는 MoSe2보다 높았습니다. @BSA NSs 처리 그룹. Figure 7d shows the blood circulation curve of Mo at different time point post-injection of FA-MoSe2 @BSA NSs. The Mo t 1/2 α (blood distribution half-life) and t 1/2 β (blood terminal elimination half-life) of the FA-MoSe2 @BSA NSs group are 0.91 ± 0.06 h and 16.96 ± 1.3 h, respectively. These results were likely due to (1) prolonged blood circulation promoted by PEG and BSA modifications [24, 33], (2) decreased macrophage clearance of nanoparticles by the reticuloendothelial system [34, 35], and (3) facilitated tumor targeting effect by the FA modification and subsequent accumulation in tumor tissues. The tumor optimum accumulation time of FA-MoSe2 @BSA NSs could guide the in vivo photothermal radiotherapy.
아 Mo and b Se elements content of tumor and major organs including heart, liver, spleen, lung, and kidney in MoSe2 @BSA NSs and FA-MoSe2 @BSA NSs-treated mice. ㄷ Quantitative in vivo analysis of the Mo elements content of the tumor regions in MoSe2 @BSA NSs and FA-MoSe2 @BSA NSs-treated mice as a function of injection time. d Blood circulation curve of Mo at different time points post-injection of FA-MoSe2 @BSA NSs
As shown in Fig. 8a, b, the temperature of the tumor region under NIR irradiation (5 min, 1 W/cm 2 ) showed about 22.1 °C increase at 24-h post-injection of FA-MoSe2 @BSA NSs, compared with that of PBS- or MoSe2 @BSA NSs-treated groups. This indicated that FA-MoSe2 @BSA NSs have excellent photothermal effect in vivo. As shown in Fig. 8c, no distinct weight changes were observed in the control or any of the treated Balb/c mice during the 30-day treatment duration, demonstrating that the treatments did not affect the health of these mice. Next, 4T1-tumor-bearing mice were randomly divided into six groups. Group 1:NIR; group 2:RT; group 3:FA-MoSe2 @BSA NSs + RT; group 4:FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR; group 5:MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT; and group 6:FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT. Then, 5 mg/kg of MoSe2 was used in all groups. The radiotherapy dose was 5 Gy, and the dose rate is 0.084 Gy/s. At 24-h intravenous post injection, tumor region was irradiated by 5 min NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm 2 ). The tumor sizes were closely monitored afterward (Fig. 8d). Compared to other groups, the most remarkable tumor growth inhibition was observed in group 6 after the combined photothermal-radiotherapy with FA-MoSe2 @BSA NSs, achieving an obvious synergistic therapeutic outcome in comparison to PTT alone or RT alone delivered by FA-MoSe2 @BSA NSs (Fig. 8d).
아 In vivo thermal images of mouse after intravenous injection of saline, MoSe2 @BSA NSs and FA-MoSe2 @BSA NSs and durations NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm 2 ). ㄴ The corresponding temperature change curves of tumor regions in mice. ㄷ The weight and d relative tumor volume profile of 4T1 xenografted tumors after intravenous injection of PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR, FA-MoSe2 @BSA NSs + RT, MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT, and FA-MoSe2 @BSA NSs + NIR + RT, respectively. **피 < 0.01 vs control group and other groups
As a kind of nanoagent for in vivo biomedical applications, their potential toxic side effect is something that always requires particular attention. In addition to the body weight data of mice in different groups post various treatments in Fig. 8c, the H&E staining images of major organs and complete blood panel assays were provided to evaluate the safety of the FA-MoSe2 @BSA NSs. As shown using H&E staining in Fig. 9a, no apparent pathological tissue damage or abnormality in major organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) was observed in FA-MoSe2 @BSA NSs-treated mice. Moreover, as illustrated in Fig. 9b, the parameters of WBC, RBC, HGB, MCH, HCT, MCHC, MCV, and PLT for FA-MoSe2 @BSA NSs-treated mice were within the normal range. These results demonstrated that FA-MoSe2 @BSA NSs exhibited low toxicity and excellent in vivo biocompatibility.
아 H&E-stained tissue sections of major organs, including the heart, liver, spleen, lung, and kidney from mice treated with FA-MoSe2 @BSA NSs at day 0 and day 30 (scale bar = 100 μm). ㄴ Blood biochemistry of mice at days 0 and 30 post-treatment with FA-MoSe2 @BSA NSs
In summary, MoSe2 NDs was first prepared by ultrasonication, and MoSe2 @BSA nanospheres was then successfully synthesized via a simple BSA self-assembly method. The BSA surface provided a rich modifiable functional group that readily conjugated FA molecules, enabling the synthesis of versatile FA-MoSe2 @BSA NSs which showed outstanding physiological stability and excellent tumor targeting effect. Due to the strong radio-sensitization ability and high NIR absorption of MoSe2 NDs, FA-MoSe2 @BSA NSs could be used as a photothermal agent for NIR-induced tumor ablation, and act as a radio-sensitizer to enhance the efficacy of RT. In vitro and in vivo experiments verified that FA-MoSe2 @BSA NSs exhibited high cytotoxicity under NIR and X-ray irradiation, contributing to remarkably enhanced therapeutic effect in the tumor-targeted combined photothermal-radiotherapy. Most importantly, it was demonstrated that FA-MoSe2 @BSA NSs have great biocompability in vitro and in vivo, encouraging further biomedical or clinic applications. Therefore, considering all the above desirable characteristics, the FA-MoSe2 @BSA NSs with highly integrated functionalities is promising for applications in cancer therapy.
Bovine serum albumin
Folic acid
Molybdenum selenide
Nanodots
Near infrared
Nanospheres
Polyethylene glycol
광열 요법
Radiotherapy
나노물질
초록 유방암의 전이는 예후에 부정적인 영향을 미치는 것으로 여겨집니다. 현저한 깊숙이 침투하고 비침습적인 특성의 이점을 누리는 소노다이나믹 요법(SDT)은 암 치료로 이어지는 전체 시리즈의 잠재력을 보여줍니다. 단독요법의 한계를 극복하기 위해 복합적인 나노플랫폼을 탐색하여 시너지 치료 효율을 실현하고 있습니다. 여기에서 우리는 잘 설계된 PLGA 코어-쉘 구조에서 chlorin e6(Ce6, SDT용), 퍼플루오로펜탄(PFP, 초음파 영상용) 및 도세탁셀(DTX, 화학요법용)을 캡슐화하는 새로운 다기능 나노 시스템을 설정합니다.
초록 비소세포폐암(NSCLC)은 전 세계적으로 두 번째로 많이 진단되는 악성 종양이 되었습니다. 암 치료 전략을 개발하기 위해 나노물질을 찾는 데 대한 장기적인 관심으로 여기에서 새로운 CoFe2를 구성했습니다. O4 - 명백한 독성 없이 NSCLC를 효율적으로 억제하는 탁월한 시너지적 광열/광역학적 특성을 가진 양자점(QD). 우리는 CoFe2의 조합이 O4 -QDs + NIR 처리는 NSCLC 세포의 세포자멸사를 유도합니다. 또한 CoFe2 O4 -QDs + NIR 처리는 또한 PI3K/AKT 경로 조절을 통해 세포 사멸을 유
