유방암의 전이는 예후에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 놀라운 심부 침투성과 비침습적 특성 덕분에 초음파역학치료(SDT)는 암 치료에 일련의 잠재력을 보여준다. 단일 요법의 한계를 극복하기 위해 다기능 나노플랫폼이 시너지 치료 효율을 실현하기 위해 탐구되어 왔다. 본 연구에서는 클로린 e6(Ce6, SDT용), 퍼플루오로펜탄(PFP, 초음파 영상용), 도세탁셀(DTX, 화학요법용)을 잘 설계된 PLGA 코어-쉘 구조에 캡슐화한 새로운 다기능 나노시스템을 구축하였다. 시너지 효과를 가진 Ce6/PFP/DTX/PLGA 나노입자(CPDP NPs)는 우수한 생체적합성과 안정성을 갖추어 향후 적용 가능성을 높였다. 저강도 집속 초음파(LIFU) 조사 시 향상된 초음파 영상이 체외 및 체내에서 모두 확인되었다. 더 중요하게는 LIFU와 결합했을 때, 나노입자는 Ce6 유도 세포독성 활성산소종(ROS) 생성과 DTX 방출을 통해 협력적 치료 효율을 나타내며 흥미로운 항종양 능력을 보였다. 또한 이 치료 전략은 폐 전이 결절을 유의미하게 감소시키는 강력한 항전이 능력을 활성화시켰다. 결과는 SDT 지향 나노플랫폼과 화학요법의 결합이 유방암의 효과적인 시너지 치료를 증진하고 폐 전이를 억제하는 유망한 접근법이 될 수 있음을 시사한다.
유방암은 가장 위협적인 악성 종양 중 하나로 수년간 여성들을 괴롭혀 왔다. 높은 이질성과 전이 능력으로 인해 유방암의 원격 전이가 사망률의 90% 이상을 차지하며, 진행성 또는 전이성 환자의 5년 생존율은 26%에 불과해 임상 예후가 불량하다[1-3]. 유방암의 부정적 특성은 완치를 어렵게 만들며, 원발 종양과 원격 전이를 모두 제거하는 치료 전략을 더욱 어렵게 하고 있다.
수술과 화학요법 같은 전통적 치료법은 여전히 유방암 치료에 효과적인 것으로 간주된다[4]. 모든 화학요법 약물 중 도세탁셀(DTX)은 전이성 유방암(MBC)과 진행성 유방암(ABC) 치료에 중요한 역할을 한다[5]. 주목나무의 화학 물질로부터 합성된 일차 항종양 약물로서 DTX의 항종양 효과는 주로 유사분열과 세포 증식 파괴를 통해 달성된다[6]. 광범위한 항종양 효능 덕분에 DTX는 유방암 치료에 가장 효과적인 화학요법 제제 중 하나가 되고 있다[7]. 그러나 화학요법 제제는 일반적으로 바람직하지 않은 부작용과 전신 독성을 유발하여 치료 효율을 크게 제한한다[8]. 또한 다양한 임상 단계와 개별 조건은 단일 치료 접근법이 유방암 치료의 모든 기대를 충족하기에 충분하지 않을 수 있음을 시사한다. 따라서 향후 적용을 위해 DTX의 독성 부작용을 억제하고 치료 효과를 높일 긴급한 필요가 있다.
초음파는 방사선 없음, 비침습성, 비용 효율성 등의 뛰어난 장점으로 임상 진단에 처음 탐구되었다[9, 10]. 위에서 언급한 독특한 특징 외에도 나노구조 물질 기반의 치료적 전망으로 많은 주목을 받아왔다[11]. 초음파역학치료는 초음파에 의해 유발되는 캐비테이션과 '소노포레이션 효과'로 처음 실현되었다. 이 과정에서 생성된 ROS는 암세포에 대한 세포독성을 효과적으로 유도하여 빠른 DNA 손상과 종양 세포의 아폽토시스를 초래한다[9]. 광역학치료(PDT)의 표면적 활용과 달리 SDT는 저강도 집속 초음파(LIFU)를 통해 심부 종양 치료에서 더 쾌적한 치료 결과를 얻으며, 치료 중 원치 않는 열손상을 방지하는 장점이 있다[12, 13]. SDT의 필수 요소 중 하나인 소노센시타이저는 다양한 종양 치료에 탐구되어 왔다[14]. 클로린 e6(Ce6)는 원래 일반적인 광감작제로 사용되었으나, 바람직한 치료 능력과 종양 조직에 대한 우수한 친화성으로 소노센시타이저로도 적용 가능하게 되었다[15]. 2세대 클로린 계열로서 Ce6는 바람직한 ROS 생성으로 종양 치료에 광범위한 주목을 받아왔다[16]. 그러나 Ce6의 단독 적용은 지속적으로 불안정성과 바람직하지 않은 피부 독성을 야기하여 광범위한 SDT 탐구를 제한해 왔다.
최근 나노기술의 발전은 바이오센싱, 환경 오염, 오염 물질 분해 등 많은 분야에서 매우 중요한 역할을 해왔다[17-23]. 나노기술 기반 나노입자는 더 작은 직경, 더 큰 외부 표면적, 더 낮은 내부 확산 저항 등의 많은 장점을 가진다[24]. 이전에 나노입자는 MOF[25], 이산화 티타늄[26], 그래핀[21] 등 다양한 물질의 응용에 관여해왔다. 나노기술과 암 치료의 급속한 성장 추세도 광범위하게 탐구되어 결합 치료 전략을 촉진하는 실행 가능한 길을 열었다[27]. 효과적인 종양 치료 응용을 실현하기 위해 정교하게 설계된 나노입자는 주로 향상된 투과성 및 잔류 효과(EPR 효과)를 통해 독성 화학요법 제제의 수송 효율을 개선하여 종양 부위에서의 축적을 증가시키도록 설정된다[28, 29]. 또한 화학요법의 캡슐화를 통해 원치 않는 부작용도 감소시킬 수 있다. 퍼플루오로펜탄(PFP)은 조사 하에 액상에서 기상으로 변환하는 뛰어난 능력을 가지고 있어 초음파 분자 프로브로 적용될 수 있음이 보고되었다, 특히 초음파 영상 및 치료에[30]. 더 중요하게는 초기 액상이 PFP를 다양한 물질에 쉽게 캡슐화할 수 있게 한다[31]. 게다가 PFP의 캡슐화는 위에서 언급한 EPR 효과에 따라 종양 부위에서 초음파 영상 능력을 크게 향상시키고 더 큰 미크론 크기 마이크로버블로 인한 크기 제한을 회피할 수 있다. 종양 영상 외에도 다중 치료 접근법의 결합은 나노시스템 지향 암 치료에서 엄청난 가치를 지닌다. 구체적으로 초음파역학치료와 화학요법의 통합을 포함한 관행은 전통적 치료 효율을 혁신하는 데 중점을 두었다. Xu 등[32]은 SDT로 인해 화학요법 약물과 함께 향상된 치료 결과가 나타날 수 있으며 미토콘드리아 표적 종양 세포 아폽토시스를 활성화함을 입증하였다. 이 패턴은 향후 활용에서 매우 주목받는 시너지 치료를 드러낸다.
위에서 언급한 영감들을 바탕으로, 우리는 올인원 나노입자(CPDP NPs)를 진단 및 치료 시스템 구축에 활용하고자 한다. 이는 SDT 지향 시너지 치료와 화학요법의 결합, 그리고 향상된 초음파 영상에 의해 실현된다. 우수한 안전성과 이상적인 대사 안정성을 가진 바람직한 나노캐리어로서 PLGA는 다양한 항종양 능력 탐구에 유리하게 만들었다[33, 34]. 따라서 이 전략에서 PLGA를 외부 층 재료로 사용하여, PFP는 LIFU에 의해 유발된 상전이 능력을 통해 초음파 영상을 크게 향상시킬 수 있고, 바람직한 2세대 소노센시타이저인 Ce6도 LIFU에 노출되어 ROS 생성을 유도할 수 있다. 또한 DTX 방출과 함께 화학요법과 SDT가 모두 실현되어 궁극적으로 시너지 치료를 달성한다. 중요하게는 CPDP NPs의 코어-쉘 구조는 정상 조직이나 세포를 손상시키지 않고 안정적으로 투여할 수 있게 하며, 상대적으로 높은 캡슐화 효율을 가능하게 한다[35]. 게다가 내용물은 이 코어-쉘 구조에서 잘 보호될 수 있다[36-38], 특히 PFP는 구조 존재로 인해 액체에서 기체로 효과적으로 변환될 수 있다. 이 코어-쉘 구조를 사용하여 시너지 전략을 더 안정적인 방식으로 동시에 입증할 수 있다. 첫째, 시너지 전략은 DTX의 부작용을 효과적인 캡슐화를 통해 유의미하게 감소시키며, 이는 악성 및 공격성 종양 치료의 고통을 완화하는 데 매우 중요하다. 둘째, 단일 화학요법에 비해 SDT와 화학요법의 결합이 치료 효율을 강화하는 유망한 전략임이 검증되었다. 셋째, PFP에 의해 실현된 향상된 초음파 영상은 진단 전략을 최적화하고 항종양 효과 검증에도 도움을 주었다. 마지막으로 전체 시스템은 우수한 생체적합성으로 안전하고 안정적이다. 이 전략에서 폐 전이와 종양 성장이 체외 및 체내에서 모두 현저히 억제되었음이 강조된다. 결론적으로 시너지 전략은 유방 악성 종양과 그 원격 전이에 대한 생산적인 치료 효능을 입증했으며, 초음파 영상 능력과 결합하여 향후 임상 적용에서 유망한 치료 전략이 될 수 있다.
PLGA-COOH (Mw 12,000 Da)는 Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd (중국 진안)에서 구입하였다. 퍼플루오로펜탄(PFP)과 아가로오스는 Sigma-Aldrich Co., Ltd. (미국 미주리주 세인트루이스)에서 입수하였다. 클로린 e6(Ce6)는 Melone Pharmaceutical Co., Ltd. (중국 다롄)에서 구입하였다. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 세포독성 분석 키트는 Dojindo Molecular Technologies (일본 도쿄)에서 입수하였다. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA)는 MedChemExpress Co., Ltd. (미국 뉴저지)에서 구입하였다. 요오화 프로피디움(PI)은 Solarbio Science and Technology Co. Ltd. (중국 베이징)에서 입수하였다. Annexin V-FITC/PI는 BD Biosciences (미국)에서 입수하였다. 도세탁셀(DTX)은 MedChemExpress Co., Ltd. (미국 뉴저지)에서 구입하였다. 기타 모든 시약은 추가 정제 없이 분석용 순수 제품을 사용하였다. Roswell Park Memorial Institute 1640 배지(DMEM), 태아 소 혈청, 트립신은 Gibco (ThermoFisher Scientific, 미국)와 UV 분광광도계(UV-Vis, Hitachi, 일본)에서 구입하였다.
Ce6-PFP-DTX/PLGA 나노입자(CPDP NPs)는 이전 보고서[39, 40]에 따라 W/O/W 이중 에멀전 법으로 제조하였다. 간단히 말해, 2mg Ce6를 500μL 메탄올에 먼저 용해시켰다. 다음으로 50mg PLGA-COOH와 도세탁셀(2mg)을 4mL 디클로로메탄에 용해시키고, 앞서 제조한 용액을 동시에 첨가하였다. 이어서 200μL PFP를 상기 용액에 첨가하였다. 결과적으로 혼합물을 초음파 프로브(Sonics & Materials Inc., 미국)로 처리하여 1차 에멀전을 얻었다(5초 켬/5초 끔, 3분). 2차 에멀전을 얻기 위해 8mL 폴리비닐알코올(PVA) 용액(w/v = 4%)을 상기 에멀전에 첨가하고 동일한 초음파 프로브로 2분간 처리하였다. 최종 에멀전에 10mL 2% 이소프로필알코올을 첨가한 후, 디클로로메탄이 완전히 휘발될 때까지 실온에서 기계적으로 최소 4시간 교반하였다. 마지막으로 CPDP NPs를 3회 원심분리(12,000rpm, 5분)하여 수집하고 4°C에서 보관하여 향후 사용하였다. PDP NPs는 Ce6를 제외하고 동일한 방식으로 제조하였다. 모든 실험 과정은 얼음 위에서 수행되었으며 엄격하게 암실 조건에서 진행되었다.
CPDP NPs와 PDP NPs의 입자 크기와 제타 전위는 Malvern Zetasizer Nano 기기(Malvern, 영국)로 측정하였다. 형태는 투과전자현미경(TEM)과 광학현미경으로 분석하였다. 안정성 평가를 위해 CPDP NPs를 인산염 완충 용액(PBS)에 분산시키고 7일간 크기를 각각 측정하였다. 각 시료는 3회 반복 측정하였다. CPDP NPs의 캡슐화 효율은 다음 공식으로 계산하였다:
캡슐화 효율(%) = (로딩된 DTX 또는 Ce6의 중량 / 전체 DTX 또는 Ce6의 중량) × 100%. 다양한 물질의 캡슐화 검증을 위해 다양한 시료의 UV-Vis 스펙트럼을 조사하였다(UH5300, Hitachi). 효과적인 캡슐화는 TEM으로도 분석하였다.
CPDP NPs 내 Ce6와 DTX의 약물 방출 능력을 평가하기 위해 서로 다른 pH의 두 용액(인산염 완충 용액, PBS: 7.4, 아세테이트 완충 용액, ABS: 5.6)을 이용하여 누적 방출 효율을 테스트하였다. 간단히 말해, CPDP NPs를 1mL PBS 또는 ABS에 분산시킨 후 투석백(Mw: 10,000)에 밀봉하였고, 전체 용액을 149mL PBS 또는 ABS가 첨가되어 총 용액 부피가 150mL가 되도록 유리병(총 부피: 150mL)에 옮겼다. 유리병을 37°C 항온 쉐이커에 넣고, 서로 다른 시점(0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72시간)에 용액을 채취하고 즉시 동일한 부피의 배지로 보충하였다. 각 군은 3회 반복하였다. 마지막으로 Ce6와 DTX의 농도를 Synergy Hybrid Multi-Mode Read(BioTek, 미국)에서 각각 403nm와 229nm에서 측정하고, 각 시점의 약물 방출 속도를 계산하였다.
CPDP NPs의 초음파 능력을 조사하기 위해 에멀전(1mg/mL)을 저강도 집속 초음파(LIFU) 트랜스듀서 장비(중국 충칭 Ronghai 초음파 의료 공학 연구 센터)로 처리하였으며, 전도 패턴은 50% 듀티 사이클, 1초 펄스 지속시간으로 다양한 강도(1-2 W/cm2)와 지속시간으로 설정하였다. 초음파 영상을 위해 조사된 CPDP NPs를 미리 준비한 아가로오스 모델에 각각 첨가하고, Philips EPIQ5 초음파 진단 기기(프로브 주파수: 12MHz, MI: 0.06)를 사용하여 CPDP NPs의 2D 및 CEUS 영상을 관찰하였다. 한편 ImageJ 소프트웨어를 적용하여 각 군의 그레이스케일 값을 분석하였다.
마우스 유방암 세포주 4T1은 중국과학원 상하이 세포은행(중국 상하이)에서 입수하여 37°C, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 10% FBS와 1% 스트렙토마이신/페니실린이 첨가된 RPMI 1640 배양액으로 배양하였다.
4T1 세포를 앞서 조건으로 접시당 1 × 104 세포 밀도로 먼저 배양하여 CLSM으로 서로 다른 시간 간격(1시간, 2시간, 4시간, 8시간)에 세포 섭취를 테스트하였다. ROS 생성을 검증하기 위해 세포를 다음 5개 군으로 나누었다: 대조군, CPDP NPs, LIFU, Ce6 + LIFU, CPDP NPs + LIFU. 24시간 통상 배양 후 배지를 CPDP NPs(200μL, 0.8mg/mL) 또는 Ce6 용액(200μL)으로 각각 교체하고 3시간 추가 공동 배양하였다. 이후 각 군에 따라 LIFU 조사(2W/cm2, 120초)를 실시하였다. 공동 배양과 LIFU 처리 후 100μL 희석된 DCFH-DA 용액을 첨가하고 각 군을 앞서 인큐베이터에서 15분간 배양하였다. 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 사용하여 활성산소종 생성 결과를 확인하고, 해당 형광 강도를 ImageJ 소프트웨어로 측정하였다.
CCK-8 분석법을 적용하여 CPDP NPs의 체외 세포독성을 평가하였다. 간단히 말해, 4T1 마우스 유방암 세포를 96웰 플레이트에 웰당 1 × 104 밀도로 24시간 배양하였다. 이후 CPDP NPs를 무혈청 RPMI 1640 배양액으로 다양한 농도(0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8mg/mL, n = 3)로 희석하고, LIFU 조사(2W/cm2, 120초) 유무에 따라 처리하였다. 추가 24시간 공동 배양 후 4T1 세포의 생존율을 측정하였다.
협력 치료의 세포 아폽토시스 효율을 평가하기 위해 4T1 세포를 앞서 조건으로 24시간 공동 배양한 후 다음 5개 군으로 나누었다: (1) 대조군(치료 없음), (2) LIFU(2W/cm2 LIFU만 조사), (3) CPDP NPs(0.8mg/mL CPDP NPs 용액만), (4) PDP NPs + LIFU, (5) CPDP NPs + LIFU. 다양한 나노입자 공동 배양(200μL)과 LIFU 조사 후, 각 군을 annexin V(5μL)와 요오화 프로피디움(5μL) 이중 염색으로 20분간 처리하고 유세포분석 프로토콜로 분석하였다.
세포 전이 능력 억제를 조사하기 위해 상처 치유 분석과 트랜스웰 분석을 설계하였다. 상처 치유 분석을 위해 4T1 세포를 앞서 조건으로 6웰 플레이트에서 통상 배양하였다. 세포가 80% 융합도에 도달한 후 피펫 팁(10μL)으로 6웰 플레이트 중앙을 따라 인위적 스크래치를 만들었다. 이후 세포를 앞서 언급한 동일 군으로 처리하였다. 24시간 지속적 공동 배양 후 PBS로 3회 세척하고 광학현미경(Olympus, 일본)으로 관찰하였다.
트랜스웰 분석을 위해 트랜스웰 챔버(Corning, 미국 샌디에이고)의 상부 구획을 주로 체내 세포외 기질을 모방하는 데 사용하였다. 4T1 세포를 웰당 1 × 105 세포 밀도로 무혈청 RPMI 1640 배양액에 상부 챔버에 파종하였고, 하부 구획에는 10% FBS가 첨가된 완전 배양액을 채웠다. 이후 세포를 위와 동일한 군으로 나누고 24시간 각각 처리하였다. 이후 하부 표면의 세포를 파라포름알데히드로 고정하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 결과를 광학현미경(Olympus, 일본)으로 관찰하였다.
건강한 암컷 BALB/c 마우스(4주령)와 Kunming 마우스(4주령)는 닝샤 의과대학 실험동물센터에서 입수하였다. 모든 동물 실험은 닝샤 의과대학 동물복지윤리심의위원회 승인 지침 하에 수행되었다. 마우스 종양 모델을 구축하기 위해 BALB/c 마우스 우측 측면에 4T1 유방암 세포(1 × 107/mL)를 접종하였다. 종양 크기가 60-80mm3로 자란 후, BALB/c 마우스에 CPDP NPs(200μL, 1mg/mL)를 꼬리정맥으로 정맥 주사하였다. 24시간 후 마우스의 종양 부위에 LIFU(2W/cm2, 120초)를 조사하고, 앞서 언급한 Philips EPIQ5 초음파 진단 기기로 2D 및 CEUS 영상을 획득하였다. 그레이스케일 분석은 ImageJ 소프트웨어로 측정하였다.
4T1 암세포 접종 후 종양 크기를 이틀마다 기록하고, 종양 부피는 공식(부피 = 1/2 × 길이 × 너비2)으로 계산하였다. 종양 크기와 마우스 체중을 이틀마다 기록하고, 종양 성장 사진을 사흘마다 기록하였다. 종양 부피가 60-80mm3에 도달하면 유사한 종양 크기의 마우스를 무작위로 앞서 동일한 5개 군으로 나누었다: 대조군, LIFU, CPDP NPs, PDP + LIFU, CPDP NPs + LIFU (n = 3). 각 군은 대조군(200μL PBS 대신)을 제외하고 다양한 NPs(200μL)를 꼬리정맥으로 정맥 주사하였다. 24시간 후 종양 부위에 LIFU 조사(2W/cm2)를 120초간 실시하였다. 전체 SDT 투여를 3일마다 반복하여 18일간 지속하였다. 마우스의 체중과 종양 부피를 측정하고 계산하였다. 치료 후 마우스를 안락사시키고 종양 조직을 H&E, TUNEL, PCNA 염색으로 추가 조직학적 분석을 위해 보냈다.
CPDP 나노입자의 체내 생체안전성을 조사하기 위해 건강한 암컷 Kunming 마우스(n = 3)를 다음 4개 군으로 나누었다: 대조군, 5mg/mL, 10mg/mL, 20mg/mL. CPDP NPs(200μL)를 마우스 꼬리정맥으로 주사하고, 추가 투여 없이 먹이와 물을 자유롭게 섭취하게 하였다. 마우스 체중을 이틀마다 측정하였다. 30일 후 마우스를 안락사시키고 혈액 샘플을 채취하여 혈구 및 생화학 분석을 수행하였다. 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐, 신장)를 수집하여 각각 H&E 염색으로 조사하였다.
각 군의 폐 전이 억제 효율을 평가하기 위해 폐의 전이 결절 수 관찰과 H&E 염색 조직학적 평가를 통해 전체 과정을 수행하였다. 모든 마우스를 안락사시킨 후 폐 조직을 적출하고 고정하였으며, 암 결절 사진을 촬영하고 폐 조직을 H&E 염색으로 추가 분석하였다.
측정 데이터는 모두 3회 수행하여 평균 ± 표준편차(SD)로 표현하고, SPSS 소프트웨어(버전 19.0)를 통해 일원배치 분산분석(ANOVA) 또는 표준 Student의 t 검정으로 분석하였으며, p 값 < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
이중 에멀전 법을 적용하여 상전이 물질 PFP, 소노센시타이저 Ce6, 화학요법 약물 DTX를 동시에 캡슐화한 CPDP NPs를 제조하였다. PBS 또는 탈염수에 분산시켰을 때 용액은 연한 회색을 띠었다. CPDP NPs는 광학현미경이나 투과전자현미경으로 관찰했을 때 균일한 구형과 뚜렷한 코어-쉘 구조를 나타냈다(Fig. 1a, b). CPDP NPs와 PDP NPs의 평균 직경은 각각 249.5 ± 77.46nm와 246.6 ± 81.01nm였고, 평균 표면 제타 전위는 각각 -18.47 ± 0.55mV와 -3.987 ± 0.66mV였다(Fig. 1c, d). CPDP NPs의 크기는 EPR 효과[40]를 통해 종양 부위로 수동적으로 축적될 수 있음을 보장한다. CPDP NPs와 PDP NPs의 서로 다른 전하는 주로 음전하를 띤 Ce6[41] 때문이다. 또한 CPDP NPs의 음의 제타 전위는 낮은 혈장 단백질 흡착을 나타내어 나노입자의 상대적 안정성을 검증한다. 입자 크기 분포는 7일간 249.5-385.1nm 범위로 유지되었다(Fig. 1e), 이는 CPDP NPs의 상대적 안정성을 입증한다. 표준 곡선에 따르면 DTX와 Ce6의 캡슐화 효율은 각각 83.84 ± 1.39%와 60.54 ± 3.79%였다.
a TEM (스케일바: 500nm) 및 b CPDP NPs 광학현미경 이미지 (스케일바: 20μm). c PDP NPs와 CPDP NPs의 크기 분포 및 d 제타 전위. e 7일간 CPDP NPs의 크기 분포. f Ce6 방출 속도 및 g 서로 다른 조건에서 DTX 방출 속도 (pH 7.4 및 pH 5.6, n = 3). h Ce6, DTX, PFP/PLGA 및 CPDP NPs의 UV-Vis 스펙트럼. CPDP NPs의 화살표는 Ce6와 DTX의 특성 피크를 보여주며 두 물질의 효과적인 캡슐화를 나타냄. i 두 나노입자의 TEM 결과. PFP/PLGA 나노입자는 얇은 쉘과 둥근 코어를 보임(왼쪽). DTX와 Ce6를 모두 캡슐화한 CPDP 나노입자는 훨씬 두꺼운 쉘과 타원형 코어를 보임(오른쪽)
Fig. 1f, g에 나타난 CPDP NPs로부터의 Ce6와 DTX 약물 방출 효율에 따르면, pH 5.5에서 DTX 방출 지수가 pH 7.4에서 용해된 나노입자에 비해 거의 2배 증가하였음이 기록되었다. 이는 산성 종양 미세환경에서 DTX의 합리적인 약물 방출 속도가 효과적으로 달성될 수 있음을 시사한다. 위 결과들은 정교하게 설계된 CPDP NPs가 산성 종양 환경에서 안정적이고 적시의 화학요법 약물 방출을 발휘할 수 있으며, SDT를 위해 근본적으로 바람직하게 준비될 수 있음을 모두 보여준다.
UV-Vis에서 보인 바와 같이 DTX와 Ce6는 각각 229nm와 403nm에서 고유한 흡수 피크를 나타냈고, 반대로 PFP/PLGA는 어떤 피크도 보이지 않았다. 주목할 점은 CPDP NPs의 스펙트럼이 상기 두 파장 근처에서 유사한 피크를 보인 반면 나머지는 PFP/PLGA 스펙트럼과 동일한 경향을 보여 다양한 물질의 성공적인 캡슐화를 나타낸다(Fig. 1h). 효과적인 캡슐화를 추가로 검증하기 위해 Fig. 1i는 PFP/PLGA 나노입자가 훨씬 얇은 쉘과 둥근 코어를 가지는 반면, CPDP 나노입자는 DTX와 Ce6 캡슐화로 인해 상대적으로 두꺼운 쉘과 타원형 코어를 나타냄을 보여준다.
PFP가 우수한 상전이 능력을 가짐이 강조된다. 액체-기체 변환은 나노입자가 종양 부위 내에 집적되는 것을 도울 뿐만 아니라 초음파 영상 효율을 향상시키는 능력을 부여한다[42]. 이를 입증하기 위해 LIFU 조사를 트리거로 적용하여 PFP의 상전이를 유도하였다. 즉, 음향 방울 기화(ADV) 효과[43]이다. 결과는 LIFU 조사 전 그레이스케일 강도가 상대적으로 낮은 수준으로 유지되었으나, LIFU 강도와 조사 시간이 증가함에 따라 2D와 CEUS 모두에서 향상된 초음파 영상 경향이 나타났음을 보여준다(Fig. 2a). ImageJ의 음향 분석은 상승된 그레이스케일 값으로 결과를 추가로 확신시켰다(Fig. 2b, c), 이는 영상 소견과 일치하였다. 가장 유의미한 2D와 CEUS 결과는 LIFU 강도가 2W/cm2에 도달하고 120초 지속되었을 때 얻어졌다. 위 결과들은 PFP가 CPDP NPs에 성공적으로 캡슐화되었으며, 더 높은 강도와 더 긴 시간의 LIFU 투여 하에서 초음파 영상 능력이 유의미하게 향상되었음을 입증한다.
a 다양한 LIFU 강도와 지속시간에서의 2D 및 CEUS 초음파 영상. b 2D 영상에서 다양한 강도와 시간의 해당 그레이스케일 강도 및 c CEUS 영상 (**p < 0.01, n = 3)
Fig. 3에 나타난 CLSM 결과에서 CPDP NPs의 세포 섭취는 서로 다른 시간 간격에서 증가 추세를 보이며, 8시간 공동 배양에서 가장 유의미한 집적을 보였다.
서로 다른 시간 간격(1시간, 2시간, 4시간, 8시간)에서 4T1 세포의 CPDP NPs 세포 섭취 (파란색: DAPI 염색 4T1 세포. 빨간색: DiR 표지 CPDP NPs, 스케일바 50μm)
초음파역학치료(SDT)의 주요 전략은 ROS(일련의 단일 전자 환원 생성물) 생성을 유도하여 암세포 아폽토시스를 유발하고 세포 증식을 억제하는 것이다[44]. 초음파에 노출되면 소노센시타이저가 ROS 생성을 유발하기 쉬우며, 동시에 전체 과정에서 상당한 양의 에너지가 방출됨이 강조된다[45]. 초음파와 소노센시타이저 모두 SDT 촉진에 필수적인 요소이므로, 세포 내 ROS 생성을 설계하고 분석하여 나눈 군 간의 차이를 조사하였다. Fig. 4a에 따르면 자유 Ce6와 LIFU 조사 군에서 생성된 ROS 양은 무시할 만했는데, 이는 자유 Ce6의 빠른 대사로 인해 불만족스러운 ROS 생성이 초래되었기 때문일 수 있다. 반대로 가장 강한 형광 강도는 CPDP NPs + LIFU 군에서 나타났다. 캡슐화된 Ce6가 잘 보호되어 대사되지 않고 보존되었다고 가정된다. 결과적으로 LIFU 자극 후 Ce6가 방출되어 풍부한 ROS를 생성하였다. 비교적으로 다른 군에서는 유의미한 형광 신호가 발견되지 않았다(Fig. 4b).
a 다양한 처리에 따른 ROS 생성 CLSM 이미지 및 b 해당 형광 강도 분석 (****p < 0.0001, n = 3). 스케일바 50μm
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 분석법을 도입하여 CPDP NPs의 체외 세포독성을 테스트하였다. 이 측면에서 LIFU 조사 유무와 다양한 농도로 다른 군을 설계하였다. 결과는 LIFU 노출 없이 24시간 공동 배양 후 최고 농도(0.8mg/mL)에서도 CPDP NPs의 생존율에 뚜렷한 영향이 없었음을 나타내며, CPDP NPs의 바람직한 생체안전성을 입증하였다(Fig. 5a). 대조적으로 LIFU 조사 후 세포 생존율이 현저히 감소함을 보였으며, CPDP NPs와 LIFU의 결합이 4T1 세포 사멸을 현저히 유발함을 보여주어 체외 ROS 생성 결과와 일치하였다.
a LIFU 조사 유무에 따른 다양한 CPDP NPs 농도에서의 상대적 세포 생존율. b 유세포분석으로 측정한 4T1 종양 세포 아폽토시스와 괴사 및 c 해당 괴사 및 아폽토시스율 분석 데이터 (****p < 0.0001, ***p < 0.001, n = 3)
SDT 효능을 추가로 평가하기 위해 유세포분석 분석법을 도입하였다. Fig. 5b, c 결과에서 보인 바와 같이 세포 괴사와 아폽토시스 지수는 CPDP NPs + LIFU 군에서 가장 높게 관찰되었으며, 다른 군에서는 뚜렷한 괴사와 아폽토시스가 보이지 않았다. 주목할 점은 CPDP NPs + LIFU 군의 괴사 및 아폽토시스율이 CPDP NPs 단독 군보다 3배 높았으며, 이는 SDT의 유의미한 종양 세포 사멸 효율을 또 다른 측면에서 보장한다. 흥미롭게도 PDP NPs + LIFU 군과 비교했을 때 CPDP NPs + LIFU 군에서 세포 괴사와 아폽토시스율이 유의미하게 증가하여 SDT와 화학요법의 시너지 치료 효율을 입증하였다.
종양 세포의 침습 및 이동 능력은 종양 진행에 필수적이다[46, 47]. Fig. 6a에 보인 바와 같이 CPDP NPs + LIFU 군에서 물리적 간격의 폐합이 다른 군보다 유의미하게 넓어 상대적으로 느린 이동 효율을 나타냈다. ImageJ 소프트웨어 분석(Fig. 6c)에 따르면 CPDP NPs + LIFU 군의 이동률도 다른 군에 비해 현저히 감소하였다.
a 상처 치유 분석 및 b 트랜스웰 분석(다양한 처리 후). c 상처 치유 분석의 해당 이동률. d 트랜스웰 분석의 해당 이동 세포 수 (****p < 0.0001, n = 3)
마찬가지로 트랜스웰 분석에서 다른 군의 신속한 이동 속도와 비교하여 CPDP NPs + LIFU 군은 세포 수의 유의미한 감소를 보였으며(Fig. 6b), 이는 시너지 치료의 우수한 항이동 능력을 입증하였다. 구체적으로 SDT 부재 시(CPDP NPs 단독 및 LIFU 단독 군) 종양 세포 수는 약간 감소하였다(Fig. 6d). 전반적으로 SDT와 화학요법의 결합으로 인해 4T1 세포의 전이가 체외에서 현저히 억제되었다.
PFP가 CPDP NPs에 캡슐화되었으므로 체내에서의 특성 초음파 영상 능력 평가도 필요하다. 꼬리정맥으로 CPDP NPs 주사 후 LIFU를 종양 부위에 적용하여 2D 및 CEUS 영상을 획득하였다(Fig. 7a). 두 군 간의 뚜렷한 그래픽 차이는 LIFU 조사 후 CPDP NPs의 해당 강도가 조사 전 군에 비해 현저히 상승했음을 나타낸다. 평균 에코 강도의 추가 데이터도 이 결과를 확인시켜 주었으며, 앞서 체외 영상 결과와도 일치하였다(Fig. 7b, c).
a LIFU 조사 유무에 따른 2D 및 CEUS 영상. b, c ImageJ로 측정한 해당 그레이스케일 강도 분석 (**p < 0.01, *p < 0.05, n = 3)
Fig. 8a, b에서 보듯이 CPDP NPs + LIFU 군의 종양 부피는 18일 치료 후 다른 군보다 유의미하게 작았으며, 이는 SDT 치료에서 유래한 ROS의 효과와 화학요법이 유효한 시너지 치료 효율을 발휘한 데 기인할 수 있다. 마찬가지로 종양 보유 마우스 사진(Fig. 8a)도 동일한 경향을 보여 LIFU 조사로 유발된 CPDP NPs의 협력적 치료 효능을 검증하였다. 또한 서로 다른 군 간의 마우스 체중 감소는 뚜렷하지 않았다(Fig. 8c). 위 결과들은 모두 CPDP NPs + LIFU 군의 훨씬 높은 억제율을 나타내며, 시너지 치료가 종양 성장을 유의미하게 예방할 수 있음을 보여준다.
a 특정 18일간 다양한 치료 하 종양 보유 마우스 이미지 (n = 3). b 다양한 치료에 따른 종양 부피 분석 (**p < 0.01). c 다양한 치료 하 종양 보유 마우스 체중 (ns 유의미하지 않음, n = 3). d 다양한 치료 하 H&E, PCNA, TUNEL 결과 (스케일바: 200μm). e 다양한 치료 하 종양의 PCNA 증식 지수 분석. f 다양한 치료 하 종양의 TUNEL 아폽토시스 지수 분석 (****p < 0.0001, n = 3)
모든 군의 치료 결과를 추가로 입증하기 위해 H&E, PCNA, TUNEL 염색을 모두 활용하였다(Fig. 8d). CPDP NPs + LIFU 군의 PCNA 증식률은 20.50%로 대조군보다 4배, LIFU 및 CPDP NPs 단독 군보다 3배, PDP + LIFU 군보다 2배 낮아 유의미한 항종양 증식률을 입증하였다(Fig. 8e). Fig. 8d, f에 보인 바와 같이 TUNEL 결과는 CPDP NPs + LIFU 군이 72.86%의 뚜렷한 아폽토시스 지수를 보였으며, 이는 대조군(9.66%), LIFU(12.86%), CPDP NPs(19.59%), PDP NPs + LIFU(37.06%) 군보다 훨씬 높았다. 위 결과들은 모두 시너지 치료의 체내 유효성을 입증하였으며, 앞서 체외 결과와도 일치함을 증명하였다.
효과적인 치료 결과에도 불구하고, 새롭게 구축된 나노입자의 생체안전성을 탐구하는 것은 매우 중요하다. 체내 CPDP NPs의 안전한 분포를 대변하여 대사 안전성을 수행하였다. 결과는 명백한 체중 감소 대신 모든 마우스 군에서 체중이 점차 증가함을 보여주어(Fig. 9a), CPDP NPs의 무시할 만한 부정적 영향을 시사하였다. 또한 다양한 장기와 혈액 샘플이 Fig. 9b에 보인 바와 같이 혈구, 생화학 분석 지수, H&E 염색(Fig. 9c)에서 서로 다른 처리 군 간에 유의미한 변화가 관찰되지 않았으며, 이는 CPDP NPs의 우수한 체내 생체안전성을 나타낸다.
a 다양한 CPDP NPs 농도 하 건강한 Kunming 마우스의 체중 (n = 3). b 30일간 다양한 CPDP NPs 농도 하 혈액 생화학 및 혈구 검사 (n = 3). c 동일 처리 하 마우스의 다양한 장기(심장, 간, 비장, 폐, 신장) H&E 결과 (스케일바: 50μm)
폐가 유방암 원격 전이의 주요 표적 장기임은 잘 알려져 있다[48]. 전이 억제 효율을 평가하기 위해 마우스의 폐 조직을 항전이 조사에 활용하였다. Fig. 10a, b에서 보듯이 대조군, LIFU, CPDP NPs, PDP + LIFU 군과 비교하여 CPDP NPs + LIFU 군이 폐 결절의 가장 현저한 감소를 보였으며, 이는 바람직한 폐 전이 억제 효율을 시사한다. H&E 염색(Fig. 10c)으로도 유사한 감소 경향이 추가로 나타났으며, 이는 이 시너지 치료 전략이 마우스에서 폐 전이 제거에 효과적인 노력을 기울일 수 있음을 종합적으로 입증한다.
a 폐 조직의 일반 모습 이미지. b 다양한 치료 간 전이성 폐 결절 분석 (**p < 0.01, n = 3). c 해당 폐 전이 H&E 염색 결과 이미지 (스케일바: 50μm)
유방암의 전이가 예후를 광범위하게 악화시킨다는 점은 널리 인정받고 있다[3, 49]. 바람직한 치료 접근법으로서 SDT는 높은 효율과 심부 침투 능력으로 광범위하게 입증되어 왔다[11, 50]. 인정하건대 소노센시타이저의 단독 적용에는 특정 한계가 존재하므로, SDT 단독 사용만으로는 추가적인 암 탐구에 여전히 덜 충분할 수 있다. 나노기술과 임상의학의 발전이 최근 수년간 무시할 만한 독성, 비침습성, 우수한 생체적합성이라는 고무적인 장점들로 인해 크게 촉진되어 왔다. 이 새로운 접근법을 사용하여 연구자들은 항종양 효율을 향상시키기 위해 다기능 치료 전략을 탐구하는 데 많은 노력을 기울여왔다.
생체안전성은 나노 제제의 최우선 과제이다. 식품의약국(FDA) 승인을 받은 널리 인정받는 물질로서 PLGA가 응용에서 바람직한 캐리어로 수행될 수 있음이 강조된다[51, 52]. 이 장점들을 기반으로 우리는 소노센시타이저 Ce6, 상전이 물질 PFP, 화학요법 제제 DTX를 캡슐화하기 위해 PLGA를 외부 구조로 활용하는 나노시스템을 구축하여 다기능 치료 효율을 실현하였다. CPDP 나노입자(CPDP NPs)는 주로 코어-쉘 구조와 적절한 크기로 관찰되어 EPR 효과를 통한 바람직한 집적이 달성될 수 있었다. CPDP NPs의 세포 생존율은 24시간 공동 배양 후 80% 이상으로 입증되어 이 나노플랫폼의 우수한 안전성을 나타냈다. 게다가 캡슐화된 PFP의 상전이는 LIFU에 의해 활성화될 때 CPDP NPs를 조영 증강제로 보장한다. 향상된 초음파 영상 능력은 이상적인 치료 창을 보장할 뿐만 아니라 정확한 진단과 정밀 치료의 통합을 실현하기 위한 CPDP NPs의 유망한 미래를 촉진한다.
SDT의 핵심 전략은 ROS 생성이다. 단일 Ce6 사용과 비교하여 PLGA에 캡슐화된 Ce6는 바람직한 보호를 발휘하였으며, 이는 ROS 결과로 검증될 수 있다. 본 연구에서 단일 Ce6 사용으로는 무시할 만한 양의 ROS만 생성되었으나, 나노입자 캡슐화 Ce6는 상당한 양의 ROS를 생성하였으며, 이는 SDT 효율로 추가 입증되었다. 결과는 CPDP NPs 내 캡슐화된 Ce6에 의해 ROS 생성이 보존되었음을 나타내며, 이는 후속 종양 억제를 위한 확고한 기초를 마련할 수 있다. 게다가 약물 방출 속도는 pH 5.5에서도 나노입자로부터 거의 Ce6가 방출되지 않음을 보여주어 PLGA에 의한 소노센시타이저의 우수한 보호를 입증하였으며, 이는 고효율의 ROS 생성과 SDT 결과로 추가 입증되었다. 흥미롭게도 결과에 따르면 pH 5.5에서 DTX와 Ce6의 약물 방출 효율은 상당히 달랐다(각각 40% 이상과 약 20%), 이는 두 약물의 다양한 캡슐화 효율 때문일 수 있다. Ce6의 낮은 방출률은 PLGA에서 효과적으로 보호되어 LIFU 자극을 통한 상당한 ROS 생성이 더 확신을 가지고 SDT 효율에 도달할 수 있음을 보여준다. 이 차이의 또 다른 이유는 제조 과정에서 두 약물의 서로 다른 용매 때문일 수 있다. 구체적으로 DTX와 PLGA는 디클로로메탄에 직접 용해되었으나, Ce6는 후자에서의 용해도가 낮아 메탄올에 먼저 용해시킨 후 디클로로메탄에 방울방울 첨가해야 했다[53]. 나노입자 내 약물 방출이 후속 결합 치료의 효과와 직접 관련되므로, 약물 방출 속도 평가와 ROS 생성 결과가 이 점을 상호 입증하였다. 현재 연구들은 단독 화학요법 사용만으로는 종양 진행을 유의미하게 역전시키기 어려울 수 있음을 시사한다[41]. 본 연구에서 우리가 설계한 나노플랫폼은 단일 화학요법 고용에 비해 시너지 치료가 체외 및 체내에서 치료 효율을 현저히 높였음을 강력하게 입증하였다. LIFU 자극이 치료 전략을 최적화함에 따라 세포 아폽토시스율이 현저히 상승하였다. 주목할 점은 이 시너지 전략으로 인해 폐 전이가 종양 세포 수준과 접종 마우스 모델 모두에서 유의미하게 억제될 수 있었으며, 이는 선행 보고들과 일치한다[16, 52].
결론적으로, 우리가 설계하고 제조한 안전하고 안정적인 CPDP NPs와 LIFU 조사는 유방 종양 진행과 그 폐 전이를 현저히 제거할 수 있다. 향상된 영상 능력으로 이 나노플랫폼은 임상에서 유망한 조영 증강제로도 고려된다. 따라서 LIFU와 결합된 새로운 시너지 전략은 전이성 유방암의 불량한 예후를 역전시키는 효과적인 치료 응용으로 고려될 수 있다.
나노물질
초록 빠르고 통제 불가능한 세포 성장이 합병증과 조직 기능 장애를 유발하는 질병인 암의 유병률 증가는 과학자와 의사들에게 심각하고 긴급한 관심사 중 하나입니다. 요즘 암 진단과 특히 효과적인 치료는 지난 세기 보건의료 분야에서 가장 큰 도전 과제 중 하나로 여겨지고 있습니다. 약물 발견과 전달에서 상당한 발전에도 불구하고, 많은 부작용과 불충분한 특이성 및 민감성은 보통 건강한 조직과 장기에 손상을 주어 약물 사용에 큰 장벽이 되어왔습니다. 이러한 치료제의 투여 기간과 양의 제한도 도전적입니다. 반면, 화학요법과 방사선요법 같은 전
초록 전통적인 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 비판받아 왔습니다. 나노입자의 돌파구는 전통적 치료와 진단을 업그레이드하는 새로운 접근법을 제공합니다. 실제로 나노입자는 전통적 암 진단과 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단과 치료를 위한 완전히 새로운 관점과 최첨단 장치를 창출합니다. 그러나 대부분의 나노입자 연구는 생체 내외 실험 단계에 머물러 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극소수만 보고되었습니다. 본 리뷰에서는 먼저 나노입자의 암 진단 및 치료 분야 현재 응용을 요약합니다. 이후 나
