인간 간 마이크로솜의 테스토스테론 대사에 대한 금 나노입자의 영향

결과 및 토론

나체 및 인간 혈장 단백질 코로나 AuNP의 물리화학적 특성화

인간 혈장 단백질 코로나(PC)가 NP 크기, 표면 전하, 형태 및 스펙트럼 특성에 미치는 영향은 DLS, TEM 및 UV-Vis 분광법을 사용하여 특성화되었습니다(그림 1). TEM 이미지는 40 및 80 nm PC BPEI-AuNP를 제외한 모든 네이키드(PC 없음) 및 PC AuNP가 일정한 크기 분포와 고유한 UV-Vis 스펙트럼 범위(520–557 nm)로 단분산임을 보여주었습니다(그림 1a, b). . PBS에서 AuNP 주변의 뚜렷한 PC도 TEM에 의해 발견되었습니다. 40 및 80nm PC 코팅된 분지형 폴리에틸렌이민(BPEI)-AuNP를 PBS에서 0분, 25°C에서 결합하면 크기 분포의 다중 피크와 네이키드 BPEI-AuNP에 대한 흡수 스펙트럼의 적색편이가 상관관계가 있습니다(그림 1b). 유체역학적 직경(D_H ) 40 및 80nm PC BPEI-AuNP는 25°C에서 0분 PBS에, 37°C에서 0분 및 45분 마이크로솜 배양 완충액에 용해된 값은 크기 분포의 다중 피크와 함께 DLS에 의해 결정되지 않았습니다. D_H 마이크로솜 배양 완충액에서 40nm 네이키드 BPEI- 및 LA-AuNP 및 PC PEG-AuNP 및 80nm 네이키드 BPEI-AuNP 값은 37°C에서 최대 45분까지 실질적으로 증가했지만 80nm PC LA에서는 값이 감소했습니다. -AuNP(표 1). 40nm 네이키드 및 PC PEG-AuNP 및 80nm PC PEG-AuNP의 다분산 지수(PDI)는 37°C에서 45분에 증가했습니다. 또한 40 및 80nm 네이키드 BPEI-AuNP 및 40nm 네이키드 PEG-AuNP의 제타(z) 전위 값은 시간이 지남에 따라 상당히 감소했습니다. 이전 연구에서는 인간 간 마이크로솜 단백질과 관련된 AuNP(7 및 70 nm)가 UV 가시 범위에서 특성 흡광도 최대값을 변경했다고 보고했습니다[21]. 이러한 결과는 PC 및 인간 혈청 알부민 코로나가 용해 배지 및 배양 시간에 관계없이 NP 크기, 최대 흡광도의 적색 편이 및 형태를 변경한다는 우리 실험실의 최근 연구에 의해 뒷받침됩니다[6, 7, 10, 26]. PC 매개 NP 물리화학적 특성 및 CYP 활성의 효소 기능의 변화에 ​​기초하여[6, 7], CYP 매개 인간 간 마이크로솜 TST 대사에 대한 40 및 80nm AuNP의 잠재적 효과가 보다 생물학적으로 조사되었습니다. 관련 PC.

(a의 투과 전자 현미경 사진 ) 탈이온수 내 40 및 80nm 네이키드 AuNP 및 b PBS의 40 및 80nm PC AuNP(25°C에서 0시간), UV 흡수 스펙트럼(상단 삽입), 동적 광산란 분포(하단 삽입). 화살표는 PC 형성을 나타냅니다. BPEI 분지형 폴리에틸렌이민, LA 리포산, PEG 폴리에틸렌 글리콜, ND 미정, PC 인간 혈장 단백질 코로나, 알몸 PC 없음

풀링된 인간 간 마이크로솜에서 AuNP 매개 테스토스테론 대사

총 11개의 TST 대사 산물이 스크리닝되었으며 6개의 대사 산물이 10μM TST에서 풀링된 인간 간 마이크로솜(pHLM)에서 발견되었습니다. TST의 표적 LC-MS/MS 분석과 6개의 선택된 대사 산물은 그림 2에 나와 있습니다. 선택된 대사 산물의 목록에는 5개의 수산화 TST 대사 산물(2β-OH TST, 6β-OH TST, 15β-OH TST, 16α)이 포함되었습니다. -OH TST, 16β-OH TST) 및 탈알킬화된 대사산물(androstenedione, AD). 이것은 TST가 주로 6β-OH TST와 2β-OH TST, 15β-OH TST, 16α-OH TST, 16β-OH TST로 주로 수산화되었다는 인간 간세포 및 HLM을 사용한 이전 연구와 관련이 있습니다. 탈알킬화된 대사산물, AD [17, 19, 27].

테스토스테론(TST)에 대한 추출된 이온 크로마토그램(XIC), ¹³ C3 표지 TST, 안드로스테네디온, 2β-히드록시 테스토스테론(2β-OH TST), 16α-히드록시테스토스테론(16α-OH TST), 16β-히드록시테스토스테론(16β-OH TST), 6β-히드록시테스토스테론(6β-OH TST), 15β - 37°C에서 45분 동안 NADPH의 존재 하에 10μM 테스토스테론의 최종 농도로 풀링된 HLM에서 생성된 하이드록시테스토스테론(15β-OH TST). HLM 인간 간 마이크로솜, NADPH 환원 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트

pHLM에서 40 및 80 nm의 네이키드 AuNP와 TST를 공동 배양한 결과는 그림 1 및 2에 나와 있습니다. 3 및 4. 모든 40 및 80nm 네이키드 AuNP는 다양한 억제 정도에 따라 pHLM에서 2β-OH TST, 6β-OH TST 및 15β-OH TST의 생성을 변경했습니다(그림 3a-f). 최대 억제 농도의 절반(IC₅₀ ) 6β-OH TST 생성을 위한 40nm BPEI-AuNP 값은 416μg mL ⁻¹ ; 80nm BPEI-AuNP 438μg mL ⁻¹ 용; 80nm PEG-AuNP 387μg mL ⁻¹ 의 경우 (그림 3c, d). 15β-OH TST 생산의 경우 IC₅₀ 40nm BPEI-AuNP 값은 1113μgmL ⁻¹ 였습니다.; 80nm BPEI-AuNP 415μg mL ⁻¹ 용; 80nm PEG-AuNP 480μg mL ⁻¹ 의 경우 (그림 3e, f). 이러한 결과는 금속 NP, AgNP 및 다공성 실리콘 NP가 인간 상피 결장직장 선암종 Caco2 세포, 간세포 암종 HepG2 세포 및 인간 간 마이크로솜에서 6β-OH TST 생성을 방해한다는 인간 암 세포주 및 간 조직에 대한 시험관 내 연구에 의해 뒷받침되었습니다. [22, 28]. 40 및 80nm 네이키드 AuNP는 최고 농도(517μg mL ^{- 1} ) (그림 4a-d). 40 및 80nm BPEI-AuNP는 4.3 및 2.1pmol mg 단백질의 해당 대사율과 함께 최고 농도에서 안드로스텐디온(AD) 생성을 증가시켰습니다. ⁻¹ 최소 ⁻¹ , 각각 대조군과 비교(0.7 pmol mg protein ⁻¹ ) 최소 ⁻¹ ) (그림 4e, f). 그러나 80nm LA-AuNP는 IC₅₀로 AD 생성을 억제했습니다. 값 233μg mL ⁻¹ . 이러한 결과는 노출된 AuNP가 표면 코팅 및 크기 의존적 방식으로 선택된 TST 대사 산물의 생산을 매개함을 나타냅니다. 또한 모든 40 및 80nm PC AuNP는 최대 143μg mL ⁻¹ 에서 pHLM의 TST에서 선택된 6가지 대사산물의 생산을 억제하지 않았습니다. , 표면 코팅에 관계없이(그림 5 및 6). 특히 PC는 더 높은 농도(32 μg mL ^-1 )에서 6β-OH TST 및 15β-OH TST 생성의 40nm 네이키드 BPEI-AuNP 매개 억제를 완화했습니다 ~ 143μg mL ⁻¹ ) (그림 3c, e 및 5c, e). 이 결과는 40 및 80nm 네이키드 BPEI-, LA- 및 PEG-AuNP가 TST 수산화(2β-OH TST, 6β-OH TST 및 15β-OH TST)를 용량 의존적으로 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 7 ). 또한 40 및 80nm의 네이키드 BPEI-AuNP는 AD 생성을 증가시켰지만 전자는 16β-OH TST를 감소시켰습니다. 시험관 내 연구에서는 주로 CYP3A4에 의해 매개되는 6β-OH TST 생성이 단일벽 탄소 나노튜브(SWCNT)에 의해 용량 의존적으로 억제되었지만 소 혈청 알부민 코로나가 이를 완화시켰다고 보고했습니다[17, 29]. 우리 연구실은 최근에 40 및 80 nm 네이키드 및 PC BPEI-AuNP가 세포 및 전사 수준에서 CYP1A2, 2C9 및 3A4에 대한 억제제 역할을 한다고 보고했습니다[6, 7]. 생체 내 연구에 따르면 PEG-AuNP(4 및 13 nm)는 주로 수컷 BALB/c 마우스의 간에 축적되어 간 Cyp1a1 및 2b 유전자의 전사 수준을 변경했습니다[23]. i.v.가 있는 수컷 ICR 마우스 PEG-NH₂ 주입 -AuNP는 정자 형태 및 생식력 없이 NP 증가된 혈장 TST 수준을 나타냈다[30]. 기타 금속성 NP, 이산화티타늄(TiO₂ )은 CD1 수컷 마우스의 고환에 축적되어 cyp1b1 및 2e1 발현을 감소시켰습니다[31]. 역학 연구에 따르면 매사추세츠 불임 클리닉의 성인 남성은 알려진 내분비 교란 물질인 클로르피리포스(CFS)의 높은 노출에서 파생된 높은 수준의 3,5,6-트리클로로-2-피리디놀(TCP)과 대조되는 낮은 혈장 TST 수치를 보였습니다. CYP 매개 TST 대사에 대한 억제제[32]. 이전 연구에서는 알려진 내분비 교란 살충제인 CFS, CFS 옥손, 포노포스, 포레이트, 디에틸톨루아미드(DEET) 및 퍼메트린이 히드록실화 및/또는 탈알킬화된 TST 대사산물, 즉 2β-OH의 생성을 실질적으로 억제 및/또는 활성화한다고 보고했습니다. TST, 6β-OH TST, 15β-OH TST, 인간 간에서의 AD 및 4-하이드록시 AD [17]. 이를 통해 AuNP가 TST의 CYP 매개 대사에 대한 억제 및/또는 활성화 효능을 매개함으로써 잠재적인 내분비 교란 물질이 될 수 있다고 가정하는 것이 합리적입니다.

2β-OH TST(a) 생성에 대한 네이키드(PC 없음) AuNP의 억제 효과 , b ), 6β-OH TST(c , d ) 및 15β-OH TST(e , f ) pHLM에서. 데이터는 평균 ± SD를 나타냅니다. (n =3). IC ₅₀ , 절반 최대 억제 농도; pHLM , 풀링된 인간 간 마이크로솜; ND , GraphPad Prism®을 사용하여 관찰된 데이터에 가변 기울기를 갖는 Hill 방정식을 피팅하여 결정되지 않음; PC , 인간 혈장 단백질; BPEI , 분지형 폴리에틸렌이민; LA , 리포산; PEG, 폴리에틸렌 글리콜; 농도, 농도; 2β-OH TST, 2β -하이드록시테스토스테론; 6β-OH TST, 6β -하이드록시테스토스테론; 15β-OH TST, 15β -하이드록시테스토스테론

16β-OH TST(a , b ), 16β-OH TST(c , d ) 및 AD(e , f ) pHLM에서. 데이터는 평균 ± SD를 나타냅니다. (n =3). IC ₅₀ , 절반 최대 억제 농도; EC ₅₀ , 절반 최대 활성화 농도; pHLM , 풀링된 인간 간 마이크로솜; ND , GraphPad Prism®을 사용하여 관찰된 데이터에 가변 기울기를 갖는 Hill 방정식을 피팅하여 결정되지 않음; PC , 인간 혈장 단백질; BPEI , 분지형 폴리에틸렌이민; LA , 리포산; PEG , 폴리에틸렌 글리콜; 농도, 농도; 16α-OH TST, 16α -하이드록시테스토스테론; 16β-OH TST, 16β -하이드록시테스토스테론; 광고 , 안드로스테네디온.

PC AuNP가 2β-OH TST(a , b ), 6β-OH TST(c , d ) 및 15β-OH TST(e , f ) pHLM에서. 데이터는 평균 ± SD를 나타냅니다. (n =3). IC ₅₀ , 절반 최대 억제 농도; pHLM , 풀링된 인간 간 마이크로솜; ND , GraphPad Prism®을 사용하여 관찰된 데이터에 가변 기울기를 갖는 Hill 방정식을 피팅하여 결정되지 않음; PC , 인간 혈장 단백질 코로나; BPEI , 분지형 폴리에틸렌이민; LA , 리포산; PEG , 폴리에틸렌 글리콜; 농도, 농도; 2β-OH TST, 2β -하이드록시테스토스테론; 6β-OH TST, 6β -하이드록시테스토스테론; 15β-OH TST, 15β-하이드록시테스토스테론.

16α-OH TST(a , b ), 16β-OH TST(c , d ) 및 AD(e , f ) pHLM에서. 데이터는 평균 ± SD를 나타냅니다. (n =3). IC ₅₀ , 절반 최대 억제 농도; pHLM , 풀링된 인간 간 마이크로솜; ND , GraphPad Prism®을 사용하여 관찰된 데이터에 가변 기울기를 갖는 Hill 방정식을 피팅하여 결정되지 않음; PC , 인간 혈장 단백질 코로나; BPEI , 분지형 폴리에틸렌이민; LA , 리포산; PEG , 폴리에틸렌 글리콜; 농도, 농도; 16α-OH TST, 16α -하이드록시테스토스테론; 16β-OH TST, 16β -하이드록시테스토스테론; 광고 , 안드로스테네디온.

통합된 인간 간 마이크로솜 및 AuNP 매개 대사 산물 생산에서 테스토스테론 대사의 제안된 계획. AuNP 금 나노입자, BPEI 분지형 폴리에틸렌이민, LA 리포산, PEG 폴리에틸렌 글리콜, PC 인간 혈장 단백질 코로나. 빨간색 화살표, 억제 효과; 파란색 화살표, 자극 효과

단일 기증자 인간 간 마이크로솜의 TST 대사 및 AuNP에 의한 조절

6개의 선택된 대사산물의 생산은 40 및 80 nm의 pHLM 기반 비억제 농도 및 PC AuNP(10 μg mL ^-1 ). TST 대사의 개별적인 변화는 3개의 다른 단일 기증자 HLM에서 관찰되었습니다(추가 파일 1:그림 S1). 각 CYP 효소의 촉매 활성과 TST 유래 대사 산물의 생산 사이의 관계는 낮은 CYP 촉매 활성, 중간 및 높은 CYP 촉매 활성을 포함하는 세 가지 단일 공여자 HLM 내에서 특성화되었습니다(추가 파일 1:표 S1). 6β-OH TST의 생산은 CYP2C19(r =0.99 및 p =0.01) 및 CYP3A4(r =0.99 및 p =0.03) 개인 내(추가 파일 1:그림 S2). AD 생산은 CYP4A11(r =− 0.98 및 p =0.04) (추가 파일 1:그림 S3). 이러한 결과는 CYP3A4와 CYP2D6이 각각 주요 TST 대사산물인 6β-OH TST와 AD의 생산에 핵심적인 역할을 한다고 보고한 이전 연구와 일치합니다[17]. 이 연구는 또한 TST의 CYP 의존성 대사의 개별적 변이가 CYP 효소의 유전자형과 표현형 활성에 달려 있음을 시사했습니다. 이전 연구에 따르면 CYP 다형성과 표현형은 CYP 기능의 주요 특징이며 약물 이상 반응 및/또는 약물 효능 및 용량 제안에 대한 개별 감수성에 기여하는 불량, 중간, 광범위 및 초고속 대사자와 같은 범주형 약물 유전학 표현형을 초래한다고 보고했습니다. CYP 효소의 열악한 대사자, 즉 CYP3A4는 CYP 억제제인 ​​AuNP에 노출되어 TST 대사에 민감할 수 있습니다[33].

그림과 같이 도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 비억제 농도에서 AuNP와 TST의 동시 배양은 크기 및 표면 변화 변형의 함수로서 단일 공여자 HLM 사이에서 TST의 CYP 매개 대사의 증가 및/또는 감소를 야기하였다. ANOVA는 AuNP 크기(p <0.0001), 표면 코팅(p <0.0001) 및 PC 형성(p <0.0001) 단일 공여자 HLM(HDA1, HDB2 및 HDC3)에서 TST의 6가지 선택된 대사산물 생산에 대해 관찰되었습니다.

Effects of 40 nm naked and PC AuNP on the production of 2β-OH TST (A1–A3), 6β-OH TST (B1–B3), 15β-OH TST (C1–C3), 16α-OH TST (D1–D3), 16β-OH TST (E1–E3), and AD (F1–F3); in three different single donor HLM (HDA1, HDB2, and HDC3). Means followed by the same letter were not significantly different for each nanoparticle (Tukey’s honest significant difference =5%). Naked no PC, PC human plasma protein corona, HLM human liver microsomes, BPEI 분지형 폴리에틸렌이민, LA 리포산, PEG polyethylene glycol, 2β -OH TST 2β-hydroxytestosterone, 6β -OH TST 6β-hydroxytestosterone, 15β -OH TST 15β-hydroxytestosterone, 16α -OH TST 16α-hydroxytestosterone, 16β -OH TST 16β-hydroxytestosterone, AD androstenedione

Effects of 80 nm naked and PC AuNP on the production of 2β-OH TST (A1–A3), 6β-OH TST (B1–B3), 15β-OH TST (C1–C3), 16α-OH TST (D1–D3), 16β-OH TST (E1–E3), and AD (F1–F3); in three different single donor HLM (HDA1, HDB2, and HDC3). Means followed by the same letter were not significantly different for each nanoparticle (Tukey’s honest significant difference =5%). Naked no PC, PC human plasma protein corona, HLM human liver microsomes, BPEI 분지형 폴리에틸렌이민, LA 리포산, PEG polyethylene glycol, 2β -OH TST 2β-hydroxytestosterone, 6β -OH TST 6β-hydroxytestosterone, 15β -OH TST 15β-hydroxytestosterone, 16α -OH TST 16α-hydroxytestosterone, 16β -OH TST 16β-hydroxytestosterone, AD androstenedione

All 40 nm naked and PC AuNP decreased both 2β-OH TST and 6β-OH TST production in HDA1 and HDC3 except for PC PEG-AuNP in the former and naked LC-AuNP in the latter, whereas in HDB2, only PC AuNP potentiated inhibition of their productions, irrespective of surface coatings (Fig. 8(A1–B3)). The 40 nm naked LA-AuNP was an inhibitor for 15β-OH TST production in HDA1; for HDB2 PC PEG-AuNP; and for HDC3 naked BPEI- and PEG-AuNP and PC LA- and PC PEG-AuNP (Fig. 8(C1–C3)). All 40 nm naked AuNP were an activator for 16α-OH TST production in HDA1 but PC attenuated it except for PC BPEI-AuNP which potentiated its inhibition (Fig. 8(D1)). All 40 nm naked and PC AuNP did not influence the production of 16β-OH production within individuals (Fig. 8(E1–E3)). AD production was modulated by the 40 nm naked and PC AuNP with varying degrees of inhibition except for PC PEG-AuNP which served an activator in HDC3 (Fig. 8(F1–F3)).

The 80 nm naked and PC AuNP-mediated inhibition for 2β-OH TST production was observed within individuals except for 80 nm naked and PC PEG-AuNP which served as the activators in HDB2 and HDC3, respectively (Fig. 9(A1–A3)). These results were not consistent with all naked and PC 40 nm AuNP-mediated inhibition for 2β-OH TST, irrespective of surface coatings (Fig. 8(A1–A3)). For 6β-OH TST, the 80 nm naked AuNP were the activators except for LA-AuNP but PC potentiated its inhibition in HDB2 (Fig. 9(B2)), which was similar to the 40 nm naked and PC AuNP-mediated inhibition and/or activation, respectively (Fig. 8(B2)). For 15β-OH TST, 80 nm naked BPEI- and PEG-AuNP and PC PEG-AuNP were the activators in HDB2 and in HDC3, respectively (Fig. 9(C2 and C3)). The 80 nm naked AuNP increased 16α-OH TST production in HDA1, irrespective of surface coatings but PC attenuated it except for PC LA-AuNP which was an inhibitor (Fig. 9(D1)). This is similar to the 40 nm naked and PC AuNP-mediated activation and attenuation for 16α-OH TST production in HDA1 (Fig. 8(D1)). All 80 nm naked and PC were not inhibitory to 16β-OH TST production within all individuals, irrespective of surface coatings (Fig. 9(E1–E3)). These results were consistent with the 40 nm naked and PC-mediated its production within individuals (Fig. 8(E1–E3)). For AD production, the 80 nm naked BPEI- and PEG-AuNP were the inhibitors but PC attenuated and vice versa with naked and PC LA-AuNP in HDA1 (Fig. 9(F1)). The 80 nm naked and PC AuNP decreased its production in HDC3 except for PC PEG-AuNP, which was an activator (Fig. 9(F3)). This study strongly suggests that AuNP interaction with CYP enzymes in HLM cause a decrease and/or increase in TST conversion to hydroxylated and dealkylated metabolites within individuals and the presence of PC played the inhibitive or protective role. In vivo study reported that the male CD-1 mice orally administrated with ketoconazole, a noncompetitive CYP3A4 inhibitor showed that a decrease in serum TST level, gonadal TST secretion, and hepatic TST hydroxylation activity that included 6β-OH TST, 15α-OH TST, 15β-OH TST, and 16β-OH TST [34]. In vitro studies with human hepatocyte, C3A cell line, HepG2 cell line, HLM, and recombinant CYP enzymes suggested that AuNP modulated the activity of various CYP enzymes that included CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, and 3A4 [6, 7, 20, 21]. PC and human serum albumin corona mitigated an inhibitory effect of BPEI- and LA-AuNP on CYP1A2, 2C9, and 3A4 enzyme activity in human hepatocytes and C3A cell line [6, 7]. That being said, it may be rational to propose that AuNP interference with CYP enzymes relates individual susceptibility to unexpected toxicological effects that may result in an altered circulating TST level tied to endocrine disrupting substance and/or drug-drug interaction sharing the same CYP enzymes [35].