금 나노입자(AuNP)-단백질 코로나 복합체는 사이토크롬 P450(CYP) 매개 테스토스테론(TST) 대사를 물리화학적 특성 변화를 통해 변화시킬 수 있습니다. 본 연구에서는 나노입자 크기, 표면 화학, 인간 혈장 단백질 코로나(PC)가 혼합 인간 간 미세소체(pHLM)에서 TST 대사에 미치는 영향을 조사했습니다. 가지형 폴리에틸렌이민(BPEI), 리포산(LA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)으로 기능화된 40nm 및 80nm AuNP를 나노입자 단독 상태와 단백질 코로나 형성 후 상태 모두에서 연구했습니다. pHLM에서 40nm 나노입자는 5가지 하이드록실화된 TST 대사산물 생성을 억제한 반면, 80nm 입자는 더 약한 효과를 보였습니다. 단백질 코로나는 이러한 억제 효과를 크게 완화시켰습니다. 흥미롭게도 나노입자 단독 상태에서는 안드로스테니디온 생성이 증가했습니다. 단일 공여자 HLM에서는 개인차이 관찰되었으며, 대부분의 AuNP가 비억제 농도에서 TST 대사를 억제하는 반면, PC-PEG-AuNP는 안드로스테니디온 생성을 자극했습니다. 이러한 발견은 AuNP가 TST 대사를 조절하여 잠재적 내분비 교란 물질로 작용할 수 있음을 시사하며, 다른 나노물질 스크리닝을 위한 프레임워크를 제공합니다.
AuNP는 독특한 광학적, 물리적 특성으로 인해 약물 전달, 진단, 소비자 제품에 널리 사용됩니다(참고문헌 1-3). 생체액에 노출되면 AuNP는 빠르게 단백질을 흡착하여 코로나를 형성하며, 이는 표면 화학, 단백질 구조, 세포독성, 세포 흡수, CYP 효소 활성 등 하위 생물학적 반응을 변화시킵니다(참고문헌 4-7). 체외 연구에서 AuNP가 인간 간세포, C3A 간종양 세포주, 정자 세포에 독성을 나타낼 수 있으나(참고문헌 6-8), 단백질 코로나 존재 시 표면 화학에 따라 이러한 효과가 약화되거나 증폭될 수 있습니다(참고문헌 6-7). 단백질 코로나 형성은 나노입자 크기나 전하와 관계없이 다양한 세포 유형에서 세포 흡수를 방해합니다(참고문헌 6-12).
간에서 CYP 효소는 내인성 및 외인성 화합물을 대사합니다. 약물, 살충제, 나노입자 등 여러 물질이 스테로이드 호르몬 합성과 대사를 교란하여 생리적 기능을 변화시킬 수 있습니다(참고문헌 13-17). 테스토스테론(TST)은 주요 안드로겐이자 CYP3A4의 기질로, 6β-OH-TST로 하이드록실화됩니다. CYP3A4에 의한 추가 하이드록실화로 2β-OH-TST, 15β-OH-TST, 16α-OH-TST, 16β-OH-TST가 생성되며, CYP2D6는 TST를 탈알킬화하여 안드로스테니디온(AD)을 생성합니다(참고문헌 17, 19, 27). 선행 연구에 따르면 나노입자 단독 및 단백질 코로나 코팅 AuNP가 CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4 등 광범위한 CYP 효소를 조절합니다(참고문헌 6, 7, 20-21). AgNP도 HLM에서 CYP3A4 활성을 억제합니다(참고문헌 22). BPEI- 및 LA-기능화 AuNP는 C3A 세포에서 CYP3A4 활성을 감소시키지만, 단백질 코로나는 이 효과를 완화합니다(참고문헌 7). 생체 내에서는 작은 AuNP가 간과 비장에 축적되어 간 Cyp1a1과 Cyp2b 발현을 변화시킵니다(참고문헌 23). 이러한 발견을 바탕으로 본 연구는 단백질 코로나가 AuNP 크기, 전하, 표면 화학에 미치는 영향을 통해 pHLM과 단일 공여자 HLM에서 CYP 매개 TST 대사에 미치는 영향을 조사합니다.
테스토스테론, 그 대사산물, ¹³C₃-표지 TST는 MilliporeSigma(St. Louis, MO)에서 구입했습니다. 추가 시약은 Steraloids 또는 MilliporeSigma에서 구매했습니다. LC-MS 등급 용매는 Fisher Scientific에서, 초순수는 Merck Synergy® UV-R 시스템으로 제조했습니다.
혼합 HLM(pHLM)은 200명 공여자(남성 100명, 여성 100명)로부터, 단일 공여자 HLM은 Corning Inc.(Charlotte, NC)에서 얻었습니다. 공여자별 CYP 활성은 보충 표 S1에 상세히 나와 있습니다.
Biopure™ 40nm 및 80nm AuNP(BPEI, LA, PEG 기능화)는 nanoComposix에서 구입했습니다. 핵심 합성은 K₂CO₃ 존재 하에서 HAuCl₄·3H₂O 환원, 숙성, 횡류 여과(TFF) 과정을 거쳤습니다. 표면 기능화: LA(0.2:1 w/w) 또는 PEG(0.5:1 w/w) 첨가 후 TFF 및 무균 여과를 수행했습니다. BPEI 표면은 EDC/NHS 화학을 통해 LA 카르복실기와 BPEI 아민기를 결합하여 제조했으며, 비결합 BPEI는 TFF와 원심분리로 제거했습니다.
혼합 인간 혈장(n=5)을 40nm 또는 80nm AuNP와 55% 혈장 부피 비율로 37°C 진탕기(250 rpm, 1시간) 배양했습니다. PC-AuNP는 원심분리(20,000×g, 20°C, 20분)로 수집하고 PBS로 3회 세척한 후 PBS에 재현탁하여 특성 분석에 사용했습니다.
DLS와 TEM으로 입자 크기, 분산도, 제타 전위를 측정했습니다. 측정은 DI water, PBS, 미세소체 배양 버퍼(pH 7.4)에서 0분과 45분(37°C) 시점에 수행했습니다. TEM 그리드는 Tecnai G2 Spirit BioTWIN(120 kV)으로 관찰했습니다. UV-Vis 스펙트럼은 Spectra Max i3 리더로 기록했습니다.
10µM TST에서 1.3-9.3 mg/mL 미세소체 단백질 농도, 최대 60분까지 선형 대사가 확인되었습니다. pHLM을 TST와 다양한 농도의 나노입자 단독 또는 PC-AuNP(0-571 µg/mL)와 배양했습니다. 반응은 NADPH(0.25 mM NADP, 2.5 mM 글루코스-6-인산, 2 U/mL 탈수소효소) 유무 하에 개시하고 37°C에서 45분 후 4% 인산으로 정지했습니다. 상청액을 원심분리, -20°C 보관 후 LC-MS/MS 분석용으로 처리했습니다. 단일 공여자 HLM도 10 µg/mL AuNP 농도에서 유사하게 처리했습니다.
1차 표준품(1 mM)과 내부표준(¹³C₃-TST)을 메탄올에 제조했습니다. 작업 표준은 0.01-200 µM 범위, QC 시료는 0.01, 0.05, 0.1 µM이었습니다. 시료에 내부표준 첨가 후 Oasis PRIME HLB 플레이트로 추출, 세척, 용출, 희석하여 LC-MS/MS로 분석했습니다.
Waters UPLC HSS T3 컬럼(2.1 × 50 mm, 1.8 µm), 유속 600 µL/min으로 분리했습니다. 기울기: 30% B에서 8.4분간 98% B까지. ESI⁺ 소스 4000 V, 150°C; 탈용매화 450°C. MRM 전이는 보충 표 S2에 있습니다. 검량선 범위 0.001-20 µM. LOD와 LOQ는 각각 0.001 µM, 0.005 µM이었습니다.
D_H와 PDI 차이는 Student's t-test로 평가했습니다. IC₅₀와 EC₅₀는 GraphPad Prism®에서 Hill 방정식으로 계산했습니다. 일원배치 분산분석 후 Tukey's HSD(p < 0.05)로 AuNP 효과를 평가했습니다. Pearson 상관계수(r)로 CYP 활성과 대사산물 생성 간 상관관계를 분석했습니다.
TEM 확인 결과, 40nm 및 80nm PC-BPEI-AuNP가 PBS에서 응집을 보인 것을 제외하고 모든 나노입자 단독 및 PC-AuNP는 단분산성을 보였습니다. 40nm 나노입자 단독 BPEI- 및 LA-AuNP, PC-PEG-AuNP의 D_H 값은 45분간 증가했으며, 80nm PC-LA-AuNP는 감소했습니다. 40nm 나노입자 단독 및 PC-PEG-AuNP에서 PDI가 증가했고, 나노입자 단독 BPEI-AuNP의 제타 전위는 시간이 지남에 따라 감소했습니다. 이러한 변화는 단백질 코로나가 나노입자 크기, 흡광도, 형태를 변화시킨다는 선행 연구 결과와 일치합니다(참고문헌 6, 7, 10, 26).
pHLM에서 6가지 TST 대사산물(5가지 하이드록실화 산물과 AD)이 검출되었습니다. 나노입자 단독 40nm 및 80nm AuNP는 2β-OH-TST, 6β-OH-TST, 15β-OH-TST 생성을 농도 의존적으로 억제했습니다(IC₅₀: 416-1113 µg/mL). 16α- 또는 16β-OH-TST는 억제하지 않았으나, 40nm BPEI-AuNP가 최고 농도에서 16β-OH-TST를 약간 억제했습니다. 흥미롭게도 나노입자 단독 AuNP는 고농도에서 AD 생성을 증가시켰습니다(40nm BPEI-AuNP: 4.3 pmol mg⁻¹ min⁻¹). PC 코팅 AuNP는 이러한 억제 효과를 대부분 제거했으며, PC는 80nm LA-AuNP의 AD 자극 효과도 완화했습니다. 전반적으로 나노입자 단독 AuNP는 하이드록실화를 감소시키면서 때때로 탈알킬화를 증진시켰으며, 이 효과는 단백질 코로나에 의해 약화되었습니다.
공여자별 CYP 활성은 대사산물 생성과 강한 상관관계를 보였습니다: 6β-OH-TST는 CYP2C19(r = 0.99, p = 0.01) 및 CYP3A4(r = 0.99, p = 0.03)와 양의 상관관계, AD는 CYP4A11(r = -0.98, p = 0.04)와 음의 상관관계를 보였습니다. 비억제 농도에서 AuNP는 공여자별로 대사산물 생성을 다르게 조절했으며, 이는 CYP 다형성과 표현형을 반영합니다(참고문헌 33). 크기, 표면 코팅, 단백질 코로나 형성 모두 대사산물 수준에 유의미한 영향을 미쳤습니다(p < 0.0001). 예를 들어 PC-PEG-AuNP는 크기와 관계없이 공여자 HDC3에서 AD 생성을 활성화했습니다.
나노입자 단독 40nm 및 80nm AuNP는 pHLM에서 TST 하이드록실화를 억제하고 탈알킬화를 자극할 수 있습니다. 생물학적으로 관련 있는 단백질 코로나 존재 시 이러한 효과가 완화되며, 특히 양이온성 BPEI-AuNP에서 두드러집니다. 단일 공여자 HLM에서 AuNP 효과는 표면 화학 의존적이며 개별 CYP 활성에 따라 달라져, AuNP가 잠재적 내분비 교란 물질임을 시사합니다. 본 결과는 다른 나노물질의 스테로이드 호르몬 대사 영향 평가와 취약 하위 집단 식별을 위한 프레임워크를 제공합니다.
본 연구에서 생성되거나 분석된 모든 데이터는 본 논문과 보충 정보 파일에 포함되어 있습니다.
나노물질
초록 금 나노입자(GNP) 크기를 화학적 합성법으로 조절하려면 복잡하고 엄격한 프로토콜이 필요합니다. 본 연구에서는 반응 매질의 용매 극성을 도구로 삼아 화학적 환원법으로 GNP 크기를 조절하는 방법을 제시합니다. 에탄올(극성 용매), 에탄올-물 혼합물(반응 매질), L-아스코르브산(환원제), 폴리비닐피롤리돈(PVP, 안정제)을 사용해 GNP를 합성하고, 에탄올과 물의 부피 비율을 바꿔 반응 매질의 극성 지수를 조절했습니다. UV-Vis, 동적 광산란(DLS), 투과전자현미경(TEM) 분석 결과, 반응 매질의 극성 지수가 감소함에
초록 본 연구는 1.5~21nm의 잘 제어된 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 간격 두께에서 금 나노입자(NPs) 근처의 서브모노레이어 로다민 6G 분자의 형광을 조사했습니다. 금 NPs의 플라즈몬 공명 피크는 다양한 두께의 PMMA 스페이서에 의해 530~580nm로 조절되었습니다. 플라즈몬 공명 여기 강화로 인해 562nm에서 로다민 6G 분자의 방출 강도가 향상되었으며, PMMA 스페이서 두께가 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였습니다. 유한차분 시간영역(FDTD) 방법으로 시뮬레이션한 스펙트럼 강도 변화는 실험 결과와 일치했습
