양전하를 띤 자기 나노입자를 사용하여 초저농도에서 박테리아를 포획

자료 및 방법

나노물질

철(III) 염화물 수화물(FeCl₃ ·6H₂ O), 수산화암모늄(NH₄ OH, 28 wt%), 염산(37 wt% 수용액), 에틸렌 글리콜 및 아세트산 나트륨은 Shanghai(China) Reagent Company에서 구입했습니다. 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS), (3-아미노프로필) 트리에톡시실란(APTES) 및 플루오레세인 테트라메틸로다민(TRITC)은 Sigma-Aldrich(미국)에서 구입했습니다. 분지형 폴리(에틸렌 이민)(PEI, 99%, Mw =10,000) Alfa Aesar에서 구입했습니다. 모든 용액은 Milli-Q 탈이온수(25 °C 저항에서 18.2 MΩ cm)를 사용하여 준비되었습니다.

NP 합성

Fe₃ O₄ 나노입자는 용매열 반응에 의해 제조되었다[10]. 간단히 말해서, 0.081 g의 FeCl₃ ·6H₂ O를 자기 교반 하에 30 mL의 에틸렌 글리콜에 용해시켰다. 그런 다음, 0.3 g의 폴리아크릴산(PAA)과 1.8 g의 요소를 이 용액에 첨가했습니다. 30분 동안 교반한 후, 용액을 테플론 라이닝된 스테인리스강 오토클레이브를 사용하여 200℃에서 12시간 동안 가열하였다. 상온으로 냉각하면 자성 나노입자 코어인 흑색 생성물이 자석에 의해 포집되었다. 에탄올과 탈이온수로 각각 3회 세척하면 Fe₃ O₄ 나노 입자를 15분 동안 초음파 처리 하에 0.15M HCl로 처리한 다음 가수분해 및 TEOS를 통해 실리카로 코팅했습니다.

음으로 하전된 형광 자성 나노 입자(NP-)를 제조하기 위해 APTES-TRITC(C33H44N3O6Si) 복합체를 먼저 에탄올에서 암실 조건에서 밤새 반응시켰다. 그런 다음 복합체는 Fe₃에 접목되었습니다. O₄ APTES와 Fe₃의 수산기 사이의 반응을 통한 나노 입자 O₄ @SiO₂ 나노입자. 이어서, 30 μL의 TEOS를 첨가하고 암실에서 24시간 동안 반응시켰다. 에탄올과 탈이온수로 각각 3회 세척하면 형광성 NP-가 생성된다. 폴리양이온 폴리머 PEI로 NP-를 변형하여 양전하를 띤 자성 나노입자(NP+)를 완성하였다.

NP 특성화

투과 전자 현미경(TEM) 연구는 TECNAI F ^{− 30} 에 의해 수행되었습니다. 300 kV에서 작동하는 고해상도 투과 전자 현미경. NP의 입자 크기와 제타 전위는 Malvern Zeta Sizer Nano 시리즈(Westborough, MA)에 의해 결정되었습니다. 형광은 Carl Zeiss LSM5 EXITER 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Zeiss, Jena, Germany)으로 검사되었습니다.

박테리아 준비

그람 음성 균주 E. 대장균 BL21은 모델 박테리아로 사용되었습니다. 이. 대장균 Luria Broth 성장 배지 100 mL에서 배양되었습니다[11]. 박테리아는 200 rpm, 37 °C에서 16 시간 동안 온도 조절식 인큐베이터에서 배양되었습니다. 이어서, 100 μL의 세균 배양물을 제거하고, 1 × 10 ⁵ 배지로 희석하였다. 한천에 코팅하고 37 °C에서 24 시간 동안 배양하였다. 콜로니 형성 유닛의 수를 세었다. 나머지 박테리아 세포를 5000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 수확하고, 1x PBS(10 mM, pH 4)로 3회 세척하고, 약 1 x 10 ³ 의 농도로 희석했습니다. 집락 형성 단위(CFU)/mL. 안전을 위해 모든 박테리아 샘플을 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브에 넣어 폐기하기 전에 박테리아를 죽이고 박테리아와 접촉하는 모든 유리 제품을 사용 전후에 멸균했습니다.

박테리아 포획 실험

모든 배치 캡처 연구는 멸균된 1x PBS 버퍼에서 수행되었습니다. 40 마이크로리터의 NP(1 μg/μL)를 멸균된 식염수에 10분 동안 초음파 처리한 다음 박테리아 용액 1 mL(약 10 ³ CFU/mL)를 현탁액에 첨가하였다. 10분 인큐베이션 후 NP 결합 박테리아는 영구 자석을 통해 바이알 벽에 포획되었고 유리 박테리아는 세척 용액으로 제거되었습니다. 포획된 박테리아는 자석을 제거하여 방출하고 PBS에 재현탁시켰다. 현미경 분석을 위해 박테리아의 분취량을 슬라이드에 펴고 Hema-3(Fisher Diagnostics)로 염색했습니다. 면역형광 분석을 위해 박테리아의 분취량을 슬라이드에 펴고 4'-6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 염색했습니다.

다양한 농도에서 NP의 박테리아 포획 효율

세균 현탁액 1밀리리터(약 2 × 10 ² CFU/mL)는 10분 동안 NP+ 또는 NP-의 다른 양(5, 10, 20, 30, 40, 50, 75 및 100 μg/mL)과 함께 인큐베이션되었습니다. 나노 입자에 의한 자기 분리 후, 전체 용액을 샘플링하고 플레이트 카운팅 방법을 통해 박테리아 농도를 분석했습니다. NPs의 박테리아 포획 효율은 LB-agar plate에 있는 CFU의 수를 세어 테스트했습니다.

저농도에서 박테리아를 포획하는 NP의 능력

40 마이크로그램의 NP+ 또는 NP-를 매우 낮은 농도(10 및 10 ² )에서 1 mL의 박테리아 현탁액과 함께 배양했습니다. CFU/mL). 나노 입자에 의한 자기 분리 후, 전체 용액을 샘플링하고 플레이트 카운팅 방법을 통해 박테리아 농도를 분석했습니다. NPs의 박테리아 포획 효율은 LB-agar plate에 있는 CFU의 수를 세어 테스트했습니다.

통계 분석

결과는 그림 범례에 표시된 대로 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시되었습니다. P가 있는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 적절한 임시 분석을 통한 양방향 분산 분석(ANOVA)을 계산했습니다. 값 <0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주됩니다.

결과

자기 NP의 특성

표면 대전 자성 복합 나노 입자의 제조를 위한 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. Fe₃ O₄ 나노 입자는 APTES와 접합되어 SiO₂의 얇은 층을 형성합니다. TEOS 및 NH₄와 반응 시 나노입자 표면의 쉘 오. 캡처된 세포를 직접 시각화하고 정량화하기 위해 APTES-TRITC 복합체가 초기에 반응한 다음 Fe₃ 표면에 접목됩니다. O₄ @실리카는 고전적인 졸-겔 반응을 통한 합성물입니다. 풍부한 SiOH 그룹은 이 제품의 전체 표면을 지배하여 강한 음의 표면 전하, 즉 음으로 하전된 자기 나노 입자(NP-)를 나타냅니다. 양으로 하전된 자성 나노입자(NP+)의 경우 PEI 분자는 NP-의 표면을 덮고 수정하는 데 사용됩니다. 개질된 제품은 아민 그룹의 풍부한 존재로 인해 강한 양의 표면 전하를 나타냅니다.

나노 입자의 디자인. 표면 전하, 형광성, 초상자성 복합 나노입자(NP)의 설계를 보여주는 개략도

그림 2a와 같이 TEM은 자성 복합 나노 입자의 직경이 450 nm이며 균일한 SiO2로 구성되어 있음을 보여주었습니다. 코팅(60 nm의 크기). 그림 2b에서 입자의 동적 광산란(DLS)은 표면 기능화 후 평균 직경이 증가하면서 좁은 크기 분포를 나타냅니다. 양전하 및 음전하를 갖는 복합 나노입자의 최대 크기는 각각 620 및 700 nm입니다. DLS로 측정한 나노 입자는 일반적으로 TEM으로 측정한 것보다 큽니다. 이는 DLS 평가 크기가 브라운 운동의 영향을 받으며 주변 온도, 나노 입자의 동적 반경 및 충돌 발생을 통해 정적 환경에 의해 촉발되는 나노 입자 덩어리의 정도에 따라 달라지기 때문입니다[12]. 그림 2c는 음성 및 양성 나노 입자의 제타 전위 분포를 보여줍니다. 탈이온수(pH 7.0)에서 NP- 및 NP+의 제타 전위는 각각 - 26.6 mV 및 + 28.1 mV입니다. NP+에 대한 제타 전위의 pH 의존성은 추가 파일 1:그림 S1에 설명되어 있습니다. 이러한 결과는 표면 전하를 띤 나노 입자가 중성 조건에서 수용액에 잘 분산되어 세포 포획에 적용될 수 있음을 나타냅니다.

나노 입자의 특성. 아 양전하 나노입자(NP+)와 음전하 나노입자(NP-)의 투과전자현미경(TEM) 이미지. ㄴ 동적 광산란 크기 및 NP 분포. ㄷ NP의 제타 전위 분포

자기 NP가 포획하는 능력 E. 대장균

그림 3은 박테리아 포획의 일반적인 실험 절차를 보여줍니다. 나노입자를 박테리아 용액과 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 그 후, 우리는 영구 자석을 사용하여 "자화"된 박테리아(세포 표면에 결합된 자성 나노 입자)를 튜브 벽에 포획했습니다. 남아있는 용액을 제거하고 PBS로 응집체를 세척한 후(외부에 자석이 있음) 현미경 분석을 위해 응집체를 슬라이드로 옮겼습니다. 구성표에서 볼 수 있듯이 NP+는 E를 빠르게 풍부하게 하는 데 충분한 정전기 응답성을 제공합니다. 대장균 . 반대로 NP- 실험에서는 PBS를 헹구어 박테리아를 제거합니다.

박테리아 포획 절차의 그림. 이. 대장균 현탁액에서 각각 NP+ 및 NP-와 혼합한 다음 10분 인큐베이션합니다. "자화"된 박테리아는 자석에 의해 유리병의 벽에 끌렸습니다. 남아있는 용액을 제거한 후 NPs로 세균을 포획하고 PBS로 세척한 후 세균 콜로니 수에서 계수함

나노 입자의 광학 이미지는 그림 4에 나와 있습니다. NP-의 광학 이미지는 단분산 및 균일하게 분포된 입자를 보여줍니다. 그러나 NP+는 응집되는 경향이 있었다. NP+의 크기 분포는 NP-의 크기 분포보다 분명히 넓습니다. 이러한 결과는 NP+ 및 NP-가 E와 완전히 다른 패턴의 상호작용을 가짐을 입증했습니다. 대장균 . NP+의 박테리아 친화도를 추가로 조사하기 위해 E에서 NP+를 현지화합니다. 대장균 형광분석을 이용하여 조사하였다. 그림 5a는 캡처한 E를 보여줍니다. 대장균 DAPI(파란색) 및 TRITC(빨간색) 모두에 대해 양성입니다. 세균에 대한 NP+의 친화성을 명확히 확인하기 위해 TEM 기술을 사용하였다. 도 5b에서 다수의 NP+가 세균 세포벽에 응집되는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 NP+가 박테리아에 강한 친화력을 가지고 있음을 시사합니다.

의 비교 E. 대장균 NP+ 및 NP-의 결합 능력. 왼쪽 이미지는 NP+와 결합하는 박테리아의 위상차 필드입니다. 오른쪽 이미지는 나노입자만을 가지고 있으며, 이는 E에 대한 결합 능력이 없는 NP-임을 시사합니다. 대장균 세포

E의 형광 및 TEM 이미지. 대장균 NP+와 결합. 아 상단 패널은 E의 형광 이미지를 보여줍니다. 대장균 NP+와 결합하는 세포. DAPI는 세포 핵을 염색하는 데 사용됩니다. TRITC는 NP로 표시됩니다. ㄴ 하단 패널은 NP+ 및 E를 보여주는 대표적인 TEM 이미지입니다. 대장균 단지

E의 저농도 감지. 대장균

박테리아와 NP+ 상호작용의 역학을 추가로 특성화하기 위해 E를 배양했습니다. 대장균 일정한 수로 (2 × 10 ² CFU/mL) 5 ~ 100 μg/mL 범위의 다양한 농도의 NP. 그런 다음 NP 결합 박테리아를 자기적으로 포획하여 분리했습니다. NP+ 및 NP-에 의한 박테리아의 자기 포획 효율은 그림 6과 같이 플롯됩니다. E의 수. 대장균 NP-에 의해 포착되는 것은 100 μg/mL의 고농도에서도 12%에 불과합니다. NP-와 대조적으로 NP+는 40 μg/mL(P <0.001). LB-agar plate에서 알 수 있듯이, NP+가 있는 박테리아 콜로니의 용량 의존적 증가가 입증되었습니다.

의 캡처 효율성 E. 대장균 표시된 다양한 농도에서 NP+ 또는 NP-에 의해. 왼쪽 이미지는 E로 코팅된 LB-agar plate의 사진입니다. 대장균 NP+ 및 NP-에 의해 캡처됩니다. 오른쪽 이미지는 표시된 다양한 농도에서 NP의 박테리아 포획 효율을 보여줍니다. 이. 대장균 (2 × 10 ² NP 인큐베이션이 없는 1 mL PBS 용액의 CFU)를 100%로 계산하고 대조군으로 사용했습니다. *피 <0.05, **P <0.01, ***P <0.001

E에 대한 NP+ 친화성을 확인하기 위해. 대장균 초저 농도에서 우리는 10 및 100 CFU의 E를 포함하는 1 ml PBS 용액과 40 μg NP를 혼합했습니다. 대장균 . 그림 7은 모든 샘플에 대한 한천 플레이트에서 생성된 콜로니의 사진을 보여줍니다. 예상대로 NP+는 과연 E를 사로잡았습니다. 대장균 박테리아 콜로니는 NP-를 사용하는 플레이트에서 명백하지 않은 반면, 초저 농도에서. 플레이트에 있는 몇 개의 콜로니는 나노입자의 비특이적 친화성 때문일 수 있습니다. 추가 분석은 NP+를 사용하여 초저 농도(10 및 100 CFU/mL)에서 90% 이상의 세균 포획 효율을 얻었다는 것을 나타냅니다. 대조적으로, 포획 효율은 동일한 조건에서 NP-의 경우 4% 미만이며 상당한 차이가 있습니다(P <0.001). 이러한 결과는 NP+가 박테리아에 대해 강한 친화력을 가지고 있음을 시사하며, 이는 정전기적 인력으로 설명될 수 있습니다. 광범위한 박테리아 포획 특성을 조사하기 위해 3개의 그람 양성 박테리아(Bacillus subtilis , 황색 포도상구균 , 및 락토코커스 락티스 ) 모델로. 추가 파일 1:그림 S2에서 볼 수 있듯이 NP+는 간균(E. coli 및 B. 자막 ) 포도구균(S. aureus ) 및 연쇄상구균(L. lactis ). 또한 3-브로모피루브산(3-BP) 및 DNA와 같은 음전하를 띤 분자가 박테리아 포획 효과를 방해할 수 있음을 발견했습니다. 죽은 E.coli 이러한 시스템에는 유효하지 않습니다(추가 파일 1:그림 S3).

의 캡처 효율성 E. 대장균 초저 농도에서 NP+ 또는 NP-에 의해. 왼쪽 이미지는 E로 코팅된 LB-agar plate의 사진입니다. 대장균 NP+ 및 NP-에 의해 캡처됩니다. 오른쪽 이미지는 E를 보여줍니다. 대장균 초저 농도의 박테리아로 NP(40 μg/mL)의 포획 효율. 이. 대장균 NP 인큐베이션이 없는 (1 mL PBS 용액에서 10 및 100 CFU) 100%로 계산되어 대조군으로 사용되었습니다. ***피 <0.001