siRNA(Small Interfering RNA) 기반 유전자 치료는 암 치료에 대한 대안적인 전략을 제공했습니다. 유전자 치료 과정의 핵심 구성 요소 중 하나는 전달 시스템입니다. 새로운 비바이러스성 유전자 벡터로서 mPEG-PCL 미셀을 양이온성 DOTAP 지질로 변형하여 제조한 DMP가 준비되어 플라스미드 DNA 기반 대장암 유전자 치료 연구에 성공적으로 적용되었습니다. 그러나 siRNA 전달에서의 가능성은 알려져 있지 않습니다. 본 연구에서는 DMP의 제조 과정을 최적화하고 DMP/siMcl1 및 DMP/siBcl-xl 복합체의 항암 효능을 마우스 대장암 모델에서 연구하였다. 우리의 결과는 DMP 양이온 미셀 전달 siRNA가 시험관 내에서 C26 결장암 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 입증했습니다. 한편, DMP/siMcl1 및 DMP/siBcl-xl 복합체의 종양내 투여는 생체내 피하 종양 모델을 분명히 억제하였다. 이러한 결과는 DMP/siRNA 복합체가 암 유전자 치료의 잠재적 후보임을 시사합니다.
암은 전 세계적으로 중요한 공중 보건 문제입니다. 결장암은 전 세계적으로 매년 100만 명이 넘는 사람들이 앓고 있는 흔한 악성 종양입니다[1]. 유전자 요법은 고형 종양과 혈액 종양을 치료하는 방법으로 적용되어 왔다[2, 3]. 암 유전자 치료의 핵심은 안전하고 효과적인 유전자 전달 시스템에 달려 있다[4, 5]. 양이온성 지질, 지질 나노에멀젼, 고체 지질 나노입자 및 폴리머 기반 벡터를 포함한 비바이러스 벡터는 유전자 전달에서 잠재적인 이점으로 인해 바이러스 벡터보다 더 많은 관심을 받았습니다. 더 나은 생체 적합성 [6, 7]. 나노기술은 생체적합성, 생분해성, 안전성 및 표적화 능력 등의 장점을 가진 비바이러스성 벡터 연구를 위한 새로운 수단을 제공합니다[2, 8]. 그 안에 높은 양전하를 갖는 다수의 나노입자 담체는 전하 효과에 의해 음이온성 핵산 약물과 결합할 수 있어 유전자 치료에서 광범위하고 밝은 응용 가능성을 보여주고 있다[9, 10].
PEG/PCL 공중합체는 생분해성과 생체적합성을 지닌 고분자 공중합체의 일종으로 약물 전달 시스템에서 유망한 응용을 보여주고 있다[11,12,13]. MPEG-PCL 미셀을 기반으로 양친매성 DOTAP를 사용하여 MPEG-PCL 공중합체를 한 단계로 수정하여 양이온성 자가 조립 DOTAP 및 MPEG-PCL 하이브리드 미셀(DMP)을 생성했습니다[14,15,16,17]. 이러한 미셀은 안정성과 안전성이 우수한 화학약품 및 유전자 약품의 전달에 유망한 전망을 보여줍니다. 예를 들어 DMP는 결장암 치료를 위해 survivinT34A 자살 유전자와 커큐민을 전달하는 데 활용되었습니다[14, 18]. 그러나 이전 연구는 플라스미드 DNA의 전달에 국한되었고 지금까지 다른 형태의 유전자 치료를 위한 DMP 미셀의 전달에 대한 보고가 없어 유전자 치료에 DMP 미셀의 적용에 제한이 있었습니다.
siRNA를 기반으로 하는 유전적 간섭은 플라스미드 DNA의 치료 유전자 외에 유전자 치료에서도 필수적인 부분이다. 유전자 약물의 필수 구성 요소인 siRNA는 이중 가닥 RNA의 작은 분자입니다. siRNA 항암제는 내인성 RNAi 메커니즘을 활용하여 종양유전자 발현을 억제합니다. 향상된 안정성 및 억제 효능과 같은 상당한 이점으로 인해 siRNA는 암 치료 응용 프로그램으로 개발될 가능성이 있습니다[19]. 플라스미드 DNA의 큰 분자량에 비해 siRNA는 형질감염 효율이 높아 유전자 치료의 특정 유전자 표적 지점에 특히 적합합니다. 따라서 유전자 치료에 좋은 선택이 될 수 있습니다. 현재 사이클로덱스트린 양이온 고분자 나노입자 기반 CALAA-01 및 지질 기반 ALN-TTR02와 같은 비바이러스 벡터 기반의 여러 siRNA 치료제가 임상 시험에서 테스트되고 있다[2]. 그러나 새로운 siRNA 표적화 지점을 개발하고 siRNA의 안전하고 효과적이며 특이적인 전달체를 찾기 위해서는 siRNA를 기반으로 한 유전자 치료가 여전히 필요합니다.
본 연구에서는 siRNA를 전달하기 위한 DMP 미셀의 효율성과 안전성을 연구하기 위해 DMP 미셀을 사용하여 siRNA를 전달하고자 하였다. 우리는 Bcl-xl siRNA와 Mcl1 siRNA를 치료 표적으로 사용하여 in vitro 및 in vivo에서 대장암 치료에 대한 항종양 효과를 조사했습니다. Bcl-xl 유전자와 Mcl1 유전자는 anti-apoptosis 유전자의 Bcl-2 family에 속하며, apoptosis 억제에 중요한 역할을 한다[20, 21]. 우리는 합성 DMP 미셀이 Bcl-xl siRNA와 Mcl1 siRNA를 효과적이고 안전하게 전달할 수 있다고 추측합니다. Bcl-xl siRNA와 Mcl1 siRNA는 Bcl-xl 유전자와 Mcl1 유전자 발현을 억제하여 C26 세포의 세포사멸을 유도하여 C26 세포의 성장을 억제하는 치료 효과를 얻을 수 있습니다.
N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸 설페이트(DOTAP)는 Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL, USA)에서 구입했습니다. 4000의 설계된 분자량을 갖는 MPEG-PCL 이블록 공중합체는 우리의 이전 보고서에 따라 합성되었습니다[22]. MPEG-PCL 공중합체의 Mn은 4050이었다. Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM) 및 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma-Aldrich(USA ) 추가 정제 없이 사용하였다. 디클로로메탄 및 기타 유기 용매는 ChengDu Kelang Chemical Co., Ltd.(Chengdu, P. R. China)에서 구입했습니다. C26(뮤린 결장 선암종) 세포 및 293 T(HEK 293 T/17) 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입했습니다. 세포를 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 DMEM에서 배양하고 5% CO2와 함께 37°C에서 배양했습니다. -습한 공기 분위기.
더 나은 DMP 제조 공정을 선택하기 위해 DMP 미셀을 세 가지 유기 용매에서 제조했으며, 각 용매는 세 가지 다른 투여량의 DOTAP를 사용했습니다. 용매는 dichloromethane, chloroform, ethyl acetate를 연구 대상으로 선택하였고 DOTAP의 투여량은 5 mg, 10 mg, 20 mg였다. DOTAP과 MPEG-PCL을 유기용매에 함께 녹인 후 진공펌프로 증발시켜 건조된 필름을 형성하였다. 건조된 필름은 이후 증류수에서 재수화되었습니다. 마지막으로, 준비된 DMP 미셀을 4 °C에서 보관했습니다.
DMP 미셀의 입자 크기와 제타 전위는 Zeta sizer Nano ZS(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)에 의해 측정되었으며 측정 과정 동안 25°C에서 유지되었습니다. 모든 결과는 3회 실행의 평균이었습니다. DMP 마이셀의 안정성을 정성적으로 평가하였다. DMP 미셀의 응집체를 육안으로 검사했습니다. 침전의 존재는 DMP 미셀의 불안정성을 나타내는 반면 균일하게 투명한 용액은 안정성을 시사합니다.
DMP-delivered Scramble siRNA(DMP/Scramble siRNA)를 2 μL loading buffer와 혼합하고 1% agarose gel에 loading한 후 140 V에서 10분 동안 전기영동으로 분리합니다. 0.2 μg의 Scramble siRNA를 1, 2, 3, 4, 5 및 6 μg의 DMP 미셀과 결합했습니다. 겔을 골드 뷰어로 염색하고 스크램블 siRNA에 해당하는 밴드를 자외선 아래에서 시각화했습니다.
293 T 세포와 C26 세포에 대한 DMP 미셀의 세포독성을 MTT 방법으로 평가하였다. 간단히 말해서, 293T 세포와 C26 세포를 1.2 × 10 3 의 밀도로 플레이팅했습니다. 96웰 플레이트에 10% FBS(소 태아 혈청)를 함유한 DMEM 배지 100 μL에서 웰당 세포를 24 시간 동안 성장시켰다. 그런 다음 세포를 72 시간 동안 다른 농도에서 일련의 DMP 미셀 또는 PEI25K에 노출시켰다. 세포의 생존력은 MTT 분석을 사용하여 측정되었습니다. 결과는 6번의 테스트 실행의 평균이었습니다.
형질감염 24시간 전에 C26 세포를 5 × 10 4 밀도로 24웰 플레이트에 접종했습니다. 10% FBS(소 태아 혈청)를 함유하는 0.5 mL DMEM 배지에서 웰당 세포. Transfection 시 각 well의 배지는 0%, 10%, 20%, 30% FBS와 DMP-delivered FAM(Carboxyfluorescein) siRNA(DMP/FAM siRNA)와 PEI-를 포함하는 0.5mL 배지로 교체하였다. 무혈청 배지에 1 μg의 siRNA를 포함하는 전달된 FAM siRNA(PEI/FAM siRNA)를 각 웰에 피펫팅하였고, DMP/FAM siRNA와 PEI25K/FAM siRNA의 질량비는 30:1 및 2:1이었다. 24시간 후, 이식된 세포를 현미경으로 관찰하고 루시퍼라제 활성을 유세포분석법(Epics Elite ESP, USA)으로 측정했습니다.
siRNA-표적화 마우스 Bcl-xl, Mcl1-1, Scramble siRNA 및 FAM 표지 음성 대조군 siRNA는 GenePharma Co., Ltd(Shanghai, P.R. China)에서 보호되지 않고 탈염되고 어닐링된 형태로 구입되었습니다.
Bcl-xl mRNA의 수준을 결정하기 위해 TRIzol™ Reagent(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 C26 세포에서 total RNA를 추출하고 SuperScript II 역전사효소 분석(Invitrogen)을 사용하여 개별 cDNA를 합성했습니다. 실시간 정량 PCR은 SYBR GreenER 정량 PCR SuperMix Universal 키트(Invitrogen)를 사용하여 수행되었습니다. PCR 프라이머는 TSINGKE Biological Technology(Chengdu, P. R. China)에 의해 합성되었습니다.
DMP/siBcl-xl 및 DMP/siMcl1의 C26 세포에 대한 항증식 능력을 MTT 방법으로 평가하였다. 간단히 말해서, C26 세포를 1.2 × 10 3 의 밀도로 플레이팅했습니다. 96웰 플레이트에 10% FBS를 포함하는 100 μL의 DMEM에 웰당 세포를 넣고 24 시간 동안 성장시켰습니다. 그런 다음 세포를 72시간 동안 다른 농도에서 일련의 DMP/siBcl-xl 및 DMP/siMcl1에 노출시켰다. 세포의 생존력은 MTT 방법을 사용하여 측정되었습니다. 결과는 6번의 테스트 실행의 평균이었습니다.
C26 세포를 10 3 의 밀도로 6웰 플레이트에 시딩했습니다. 10% FBS를 포함하는 2 mL DMEM 배지에서 웰당 세포. 24시간 후, 세포를 일련의 DMP 미셀 또는 DMP/스크램블 siRNA 및 DMP/siBcl-xl 및 DMP/siMcl1에 다양한 농도로 노출시켰다. 세포가 육안으로 볼 수 있는 클론으로 성장하면 배양을 종료하고 헹구고 고정하고 염색하였다. 클론의 수를 직접 세어 억제율을 계산하였다.
세포 사멸은 Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)와 propidium iodide 염색을 통해 관찰되었습니다. 간단히 말해서, C26 세포를 6웰 플레이트에 접종하고 일련의 DMP 미셀, DMP/스크램블 siRNA, DMP/siBcl-xl 및 DMP/siMcl1에 72시간 동안 노출시켰다. 그런 다음 세포는 Annexin V-FITC 및 propidium iodide 염색을 받았습니다.
6–8 주령의 BALB/c 마우스에 5 × 10 6 을 접종했습니다. 오른쪽 옆구리에 있는 C26 세포. 종양 부피가 100 mm 3 에 도달했기 때문에 10 μg의 siRNA에 해당하는 DMP/siRNA 복합체를 5회 치료 동안 격일로 종양 내 주사했습니다. . 동등한 양의 생리 식염수 또는 DMP를 투여한 마우스를 대조군으로 간주하였다. 종양 크기를 측정하고 모든 동물이 희생될 때까지 2 일마다 동물 체중을 모니터링했습니다. 종양 부피는 (1/2 × 길이 × 너비[2])로 계산되었습니다.
절제된 조직은 4% 중성 완충 포르말린 용액에 24시간 이상 고정하고 파라핀에 포매하였다. 조직의 섹션(3-5 μm)은 hematoxylin과 eosin으로 염색되었습니다. 이 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었으며 샘플은 형광 현미경(× 400)으로 검사되었습니다.
상업적으로 이용 가능한 TUNEL 키트(Promega, Madison, WI)를 사용하여 C26 마우스 흑색종 이종이식 종양 조직에서 세포자멸사 효과를 분석하였다. 이 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
데이터는 평균값 ± SD로 표현되었습니다. 통계 분석은 SPSS 소프트웨어를 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)으로 수행되었습니다. 모든 결과에 대해 P ≤ 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
<섹션 데이터-제목="결과">siRNA를 전달하기 위한 효과적인 transfection 효율과 낮은 세포독성을 얻기 위해 Table 1과 같이 DMP micelle에 대한 다양한 준비 과정을 연구하였다. 본 연구에서는 Ethyl acetate로 제조된 DMP micelle이 매우 불안정했으며 DMP micelle의 안정적인 시간 10 분을 넘지 않았다. 그리고 디클로로메탄과 클로로포름으로 제조한 DMP 미셀은 모두 안정성이 우수하여 클로로포름으로 제조한 DMP와 DOTAP 20mg을 제외하고는 96시간 이상 안정한 상태를 유지할 수 있었습니다. 더 중요한 것은 적절한 크기, 제타 전위 및 PDI도 있었다는 것입니다. 그러나 초기 형질전환 효율을 비교해보면 디클로로메탄으로 제조된 DMP 마이셀의 형질전환 효율이 클로로포름으로 제조한 DMP 마이셀보다 높았다. 그래서 우리는 DMP 미셀을 준비하기 위해 디클로로메탄을 선택했습니다.
DOTAP 3회 투여량으로 제조한 DMP 마이셀은 크기, 제타 전위, PDI에서 뚜렷한 차이가 없었으나, DOTAP 20mg 투여량으로 제조한 DMP 마이셀은 3회 투여량에서 형질감염 효율이 가장 높았다. 위의 비교를 통해 DOTAP 및 MPEG-PCL 기반 준비 프로세스(그림 1a)를 선택하여 안정성과 transfection 효율이 높은 DMP 미셀을 준비했습니다. DMP 미셀의 준비 계획은 그림 1b에 나와 있습니다.
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아 DOTAP 및 MPEG-PCL의 분자 구조. ㄴ DMP 미셀의 제조 계획. ㄷ DMP 미셀의 크기 분포 스펙트럼. d DMP 미셀의 제타 전위 스펙트럼. 이 siRNA 지연 분석. 에 293T 세포에 대한 DMP 미셀의 세포독성. 지 C26 세포에 대한 DMP 미셀의 세포독성
도 1c에 제시된 바와 같이 입자 크기 분포 스펙트럼은 DMP 미셀이 평균 입자 크기가 144.8 nm인 나노 크기(PDI =0.315)임을 나타내어 매우 좁은 입자 크기 분포를 가짐을 시사한다. DMP의 제타 전위 스펙트럼은 46.4 mV의 제타 전위로 그림 1d에 제시되었습니다. DMP 미셀의 안정성을 정성적으로 평가하였다.
DMP와 siRNA의 결합 능력을 평가하기 위해 젤 지연 분석을 수행하였고 그 결과를 그림 1e에 나타내었다. DMP 대 siRNA의 질량비가 ≥ 30일 때 Scramble siRNA의 완전한 지연이 달성되었습니다. 음이온성 Scramble siRNA는 정전기적 상호작용으로 인해 DMP 표면에 흡수되어 DMP/siRNA 복합체를 형성합니다.
C26 세포 및 293T 세포에 대한 DMP 미셀의 세포독성을 MTT 방법으로 평가하였다. 도 1f 및 g에서 보는 바와 같이 PEI25K는 IC50으로 293T 세포에서 높은 독성을 나타냈다. 0.83 μg/mL. 그러나 DMP 미셀은 훨씬 덜 독성이 있었고 IC50 DMP의 3.7 μg/mL이었다. IC50 DMP 미셀의 0.497 mg/mL는 C26 세포에서였습니다. 그러나 PEI25K는 IC50로 엄청난 독성을 나타냈습니다. <0.1 μg. 따라서 DMP 미셀은 PEI25K보다 세포 독성이 낮고 siRNA를 C26 세포에 안전하게 전달하는 데 사용할 수 있습니다.
생물물리학적 특성화에 더하여, 우리는 DMP 미셀의 형질감염 효율을 PEI25K("gold standard" 형질감염 제제)의 in vitro 형질감염 효율과 비교했습니다. . Fig. 2에서 보는 바와 같이 FBS transfection이 0%, 10%, 20%, 30%인 배지에서 DMP micelle의 transfection 효율은 85.47 ± 1.01%, 81.57 ± 2.04%, 75.29 ± 1.20 %, 716이었다. 1.59%, PEI는 86.38 ± 2.92%의 형질감염 효능을 가졌다. 혈청군과 비혈청군 사이에 형질감염 효율의 차이는 거의 없었다. 그리고 혈청군과 비혈청군의 transfection 효율은 PEI의 transfection 효율과 유사하였다. 또한, 도 2a의 사진은 FAM 기반 리포터 유전자로 DMP 미셀의 형질감염 능력을 직접 관찰한 것이다. 사진에서 PEI군은 DMP군에 비해 세포의 형태가 변화하여 PEI는 높은 세포독성을 갖고 DMP 마이셀은 낮은 세포독성을 나타내었다.
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DMP 미셀의 형질감염 효율. 아 형질감염된 C26 세포의 사진(b , ㄷ ) 0%, 10%, 20% 및 30% FBS 및 PEI25K를 포함하는 배지에서 DMP 미셀의 형질감염 효율, 유세포 분석으로 계산
유전자 치료 과정에서 siRNA는 중요한 역할을 합니다. 따라서 우리는 Bcl-xl-targeting siRNA와 Mcl1-targeting siRNA를 설계하여 이들의 항암 활성을 연구했습니다. Bcl-xl siRNA와 Mcl1 siRNA의 간섭능을 평가하기 위해 qPCR을 통해 Bcl-xl siRNA와 Mcl1 siRNA의 간섭능을 확인하였다. 우리의 결과(그림 3)에 따르면 DMP/siMcl1 그룹의 mRNA 수준은 대조군보다 낮았다(그림 3a). 그리고 DMP/siBcl-xl 그룹의 mRNA 수준은 대조군보다 낮았다(Fig. 3b). DMP/siBcl-xl 및 DMP/siMCL1이 관련 mRNA 수준을 효율적으로 감소시킨다는 것이 잘 입증되었습니다.
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아 Bcl-xl의 mRNA 수준은 DMP/siMcl1에 의해 분명히 감소했습니다. ㄴ Mcl1의 mRNA 수준은 DMP/siBcl-xl에 의해 분명히 감소했습니다. ㄷ 다른 농도에서 DMP/siBcl-xl 또는 DMP/siMcl1 처리 후 클론 형성 사진. d 농도가 다른 siRNA의 DMP/siBcl-xl 처리 후 클론 수. 이 시험관 내 C26 세포에 대한 50nM 및 100nM 농도의 siRNA를 갖는 DMP/siBcl-xl 및 DMP/siMcl1의 항암 능력. 에 농도가 다른 siMcl1의 DMP/siMcl1 처리 후 클론 형성 억제율. 지 siBcl-xl 농도가 다른 DMP/siBcl-xl 처리 후 클론 형성 억제율
또한, DMP/siBcl-xl 및 DMP/siMcl1이 C26 세포의 성장을 억제할 수 있음을 연구하기 위해 DMP 미셀을 사용하여 siRNA를 C26 세포에 전달했습니다. C26 세포의 생존력은 MTT 방법에 의해 결정되었습니다. 그 결과 DMP/siBcl-xl(50nM 및 100nM)의 세포 생존율은 69.6%±3.3% 및 56.3%±1.9%였고, DMP/siMcl1(50nM 및 100nM)의 세포 생존율은 82.8이었다. %±3.1% 및 56.3%±3.2%(그림 3e).
DMP/siBcl-xl 및 DMP/siMcl1의 항암 활성에 대한 추가 연구를 위해 클론 형성 분석을 수행했습니다. 도 3c 및 d에서 대조군에 비해 DMP/siBcl-xl 및 DMP/siMcl1(50 nM 및 100 nM)의 클론 수가 적음을 분명히 나타내었다. 이러한 결과는 DMP/siBcl-x1 및 DMP/siMcl1이 C26 세포에 명백한 항증식 효과를 갖는다는 것을 시사하였다. 따라서 MTT assay 결과를 종합하면 DMP/siBcl-x1과 DMP/siMcl1이 C26 세포의 증식을 억제하고 C26 세포에 대해 현저한 항암 활성을 나타내는 것으로 나타났다.
DMP/siBcl-xl- 및 DMP/siMcl1-유도된 DMP 미셀의 증식능 손실 및 세포 생존율이 세포자멸사 유도와 관련이 있는지 여부를 결정하기 위해, 세포자멸사 세포의 수를 유세포 분석에 의해 평가하였다. 도 3f에 나타난 바와 같이, DMP/siMcl1 그룹의 세포자멸사 비율은 37.9% ± 4.7%로 대조군 및 DMP 그룹 및 DMP/Scramble siRNA 그룹보다 높았다. 도 3g에서 보는 바와 같이 DMP/siBcl-xl군의 세포사멸률은 33.0% ± 3.8%로 다른 대조군보다 높았다. 이러한 apoptosis 데이터는 DMP/siMcl1 및 DMP/siBcl-xl이 강력한 apoptosis 유도 능력을 가지고 있음을 나타냅니다. apoptosis assay 결과는 앞서 설명한 MTT 결과 및 클론 형성 결과와 일치하여 apoptosis를 유도하는 것이 C26 세포의 증식과 생존을 억제하는 가능한 메커니즘임을 시사합니다.
C26 이종이식 동물 모델도 생체 내에서 DMP/siRNA 복합체의 항종양 효능을 테스트하는 데 사용되었습니다. 각 그룹의 C26 이종이식 종양의 종양 성장 곡선과 이미지가 그림 4a 및 b에 나와 있습니다. 우리의 결과에 따르면, DMP/siMcl1 및 DMP/siBcl-xl의 종양내 주사는 대조군에 비해 이종이식 종양 성장의 유의한 억제를 초래하였다. 각 그룹의 종양 무게는 그림 4b에 나와 있습니다. NS 처리군(0.85 ± 0.09 g) 및 DMP군(0.76 ± 0.11 g)과 비교하여, DMP/siMcl1 복합체는 통계적으로 유의한 종양 중량 감소(0.34 ± 0.06 g, P <0.01), 한편, DMP/siBcl-xl 복합체는 종양 무게에서 통계적으로 유의한 감소를 일으켰습니다(0.42 ± 0.08 g, P <0.01). 이러한 결과는 DMP/siRNA 복합체의 종양내 주사가 C26 결장암 모델의 피하 이종이식편의 성장을 효율적으로 억제할 수 있음을 시사한다. 다른 장기에 대한 DMP/siRNA 복합체의 생체 내 부작용을 H 분석을 통해 조사했습니다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 심장, 간, 비장, 폐, 신장에서 유의한 병리학적 변화는 관찰되지 않았다.
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C26 마우스 이종이식 모델에 대한 DMP/siRNA의 항암 효과 및 안전성. 아 종양 부피로 계산된 종양 발달 곡선. ㄴ 각 그룹의 평균 종양 무게. 다른 치료 그룹과 비교하여 DMP/siMcl1 그룹 및 DMP/siBcl-xl 그룹은 종양 무게에서 통계적으로 유의한 감소를 달성했습니다(***P , 0.001). ㄷ C26 결장암 종양의 대표적인 이미지. d TUNEL 분석에 의해 검출된 종양 조직의 아폽토시스. 이 H 두 모델에서 각 치료군의 주요 장기 분석. 심장, 간, 비장, 폐 또는 신장에서 유의한 병리학적 변화가 관찰되지 않았습니다.
본 연구에서는 C26 결장암 치료를 위한 Bcl-xl siRNA 및 Mcl1 siRNA를 전달하기 위해 양이온성 자가조립 DOTAP 및 MPEG-PCL 하이브리드 미셀을 제조하였다. 이들 DMP 미셀은 안정성이 우수하고 Bcl-xl siRNA와 Mcl1 siRNA를 효과적으로 결합하여 C26 세포에 전달할 수 있었다. 더 중요한 것은 DMP 미셀이 전례 없이 siRNA(Bcl-xl siRNA 및 Mcl1 siRNA)를 전달하고 C26 세포의 세포 사멸을 효과적으로 유도할 수 있어 시험관 내 및 생체 내 모두에서 C26 세포의 성장을 높은 안전성으로 억제할 수 있다는 것입니다. 종합적으로, 우리 연구는 DMP가 siRNA에 대한 잠재적인 유전자 전달 운반체임을 시사했습니다.
양이온성 지질 DOTAP는 siRNA의 전달에 널리 적용되었지만 용혈을 유발하는 강한 양전하를 일으키고 세포 독성이 높다는 보고가 있습니다. 높은 transfection 효율을 가진 DOTAP 양이온 리포솜을 기반으로 하지만 양전하가 독성을 일으킬 수 있는데, 그 이유는 양전하를 띤 DMP의 4차 암모늄염 헤드가 리포솜 인지질 이중층의 표면에 노출되었기 때문일 수 있습니다. 그러나 DOTAP 지질 기반 DMP 마이셀은 높은 형질감염과 낮은 세포독성을 나타냈다. 우리는 미셀 자기조립 공정에서 DOTAP가 고분자 나노입자 내부에 내장되어 있고, 이 중 4차 암모늄염 헤드가 표면에 완전히 노출되지 않은 것으로 추측했습니다. 따라서 부분 양전하가 마스킹되었습니다. 한편, 우리의 결과는 또한 DMP 미셀의 형질감염 효율이 PEI25K의 형질감염 효율에 비해 낮지 않다는 것을 보여줍니다. DOTAP은 덮인 후의 양전하가 여전히 부분적으로 노출되어 적절한 전위를 보여주고 있으며, 이 정도의 전위는 siRNA를 결합하고 전달하기에 충분한 수준임이 증명되었다. 또한, 우리의 결과는 MPEG-PCL 기반 DMP 미셀이 DOTAP의 세포독성에 최적화되고 DOTAP의 유전자 전달 능력을 유지하는 효과적이고 안전한 유전자 전달 운반체임을 나타냈다. 그리고 유사한 연구에서 DOTAP의 세포독성이 다른 물질과 결합된 후에 감소한다고 보고하였다[23]. 최근 DOTAP와 SWNT로 구성된 새로운 벡터는 리포펙타민에 비해 siRNA 전달에서 세포독성이 더 낮았다[8]. DESE(이중 에멀젼 용매 증발) 방법을 사용하여 DOTAP-PLGA 미셀을 제조한 LPN은 나노 크기의 담체를 생성했습니다[24,25,26]. 이러한 연구는 우리 연구에서 설명한 것과 잘 일치했으며 우리의 추측을 어느 정도 설득력 있게 만들었습니다.
유전자 전달 벡터의 전달 효율은 혈청의 영향을 많이 받습니다. 혈청 내 혈청 단백질은 나노캐리어/siRNA 복합체 표면의 양전하를 중화할 수 있으며, 이는 음전하를 갖는 세포 표면의 정전기 효과에 의해 영향을 받습니다[27,28,29].
본 연구에서는 DMP 미셀의 형질감염 효율을 연구할 때 형질감염을 위해 0%, 10%, 20% 및 30% FBS를 포함하는 일련의 DMEM 배지를 설정하여 로드된 미셀의 형질감염 효율에 대한 혈청의 영향을 조사했습니다. FAM siRNA 나노입자. 우리의 결과는 FBS의 존재가 형질감염 효율에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었습니다. 이 기사에서는 MPEG-PCL을 사용하여 DOTAP을 덮고 DOTAP는 MP 내부에 내장되어 일부 부품이 표면에 적절한 비율로 남습니다. 이 구조를 기반으로 우리는 MPEG-PCL의 덮개로 인해 DOTAP의 양전하가 부분적으로 숨겨져 혈청 단백질에 대한 노출 수준을 감소시켜 형질 감염에 대한 혈청의 영향을 피할 수 있다고 추측했습니다. 이는 변형 후 양이온성 담체의 감소된 표면 전하 외에 혈청 형질감염의 존재가 양이온성 고분자 담체의 효율에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 의미합니다. 시험관 내 DMP 미셀에 의해 입증된 혈청 환경에서의 우수한 형질감염 능력으로 인해, 시험관 내 세포 실험에서 혈청이 DMP 매개 siRNA 전달에 거의 애정을 갖지 않는다는 것을 시사했습니다.
이 연구에서 준비된 DMP 미셀은 siRNA를 전달할 수 있는 능력을 가졌다. 그리고 DMP 미셀을 사용하여 시험관 내 항암 활성 연구를 위해 Bcl-xl siRNA 및 Mcl1 siRNA를 C26 세포에 전달했습니다. 우리는 DMP 미셀의 준비 과정을 조사하고 우수한 준비 과정을 선택하여 좁은 크기, 좋은 제타 전위 및 우수한 안정성을 가진 DMP 미셀을 준비했습니다. 또한, 준비된 DMP 미셀은 in vitro transfection 실험에서 혈청의 존재에 영향을 받지 않았다. 더 중요한 것은 DMP/siBcl-xl과 DMP/siMcl1은 Bcl-xl 유전자와 Mcl1 유전자의 발현을 억제하여 C26 세포의 세포사멸을 유도한 후 C26 세포의 성장을 억제하는 치료 효과를 얻을 수 있다는 점이다. DMP/siRNA 복합체의 종양내 주사는 C26 결장암 모델의 피하 이종이식편의 성장을 효율적으로 억제할 수 있었습니다. 심장, 간, 비장, 폐 또는 신장에서 유의한 병리학적 변화는 관찰되지 않았습니다. DMP 미셀은 결장암 치료를 위한 siRNA를 전달하는 효과적인 운반체로 간주될 수 있다고 믿어집니다.
N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸 설페이트
메톡시폴리(에틸렌글리콜) 폴리(카프로락톤)
3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐 테트라졸륨 브로마이드
작은 간섭 RNA
나노물질
초록 빠르고 통제할 수 없는 세포 성장이 합병증과 조직 기능 장애를 일으키는 질병인 암의 유병률 증가는 과학자와 의사의 심각하고 긴장된 우려 중 하나입니다. 오늘날 암 진단과 특히 그 효과적인 치료는 지난 세기 건강과 의학의 가장 큰 과제 중 하나로 여겨져 왔습니다. 약물 발견 및 전달의 상당한 발전에도 불구하고 일반적으로 건강한 조직 및 기관에 손상을 일으키는 많은 부작용과 부적절한 특이성 및 민감도가 약물 사용에 큰 장벽이 되어 왔습니다. 이들 치료제의 투여 기간과 양에 대한 제한도 도전적이다. 반면에, 화학 요법 및 방사선
이것은 CAMX 2018에서 실제로 전시된 핵심 기술을 강조하는 이 pre-CAMX 2019 시리즈의 두 번째 블로그입니다. 이 블로그는 Heraeus Noblelight의 새로운 black.infrared를 중심으로 합니다. 합성물 처리를 위한 새로운 유형의 시스템인 시스템 및 humm3 자동 섬유 배치(AFP) 기계에서 레이저 및 적외선 히터를 대체하는 기술입니다. 빛으로 혁신 Heraeus Noblelight는 빛의 힘을 사용하여 광범위한 산업 공정을 혁신합니다. 배경을 설명하자면 모든 빛은 EMR(전자기 복사)이며 아
