이황화주석 나노플레이크 기반 타액 전기화학 코르티솔 바이오센서

초록

스테로이드 호르몬인 코티솔은 시상하부-뇌하수체-부신계에서 분비됩니다. 이것은 심리적 스트레스의 잘 알려진 바이오마커이며 따라서 "스트레스 호르몬"으로 알려져 있습니다. 코르티솔 과발현이 장기간 반복되면 결국 코르티솔 조절 장애가 발생합니다. 따라서 코티솔을 검출하기 위한 신속한 현장 진단 분석이 필요합니다. 타액 코르티솔 전기화학적 분석은 코르티솔 수치를 신속하게 측정하는 데 잠재적으로 유용한 비침습적 방법입니다. 이 연구에서는 2차원 이황화주석 나노플레이크, 코티솔 항체(C-M_ab ) 및 소 혈청 알부민(BSA)은 BSA/C-M_ab으로 유리 탄소 전극(GCE)에서 제조되었습니다. /SnS₂ /GCE, 전기화학적 임피던스 분광법 및 순환 전압전류법을 사용하여 특성화됩니다. 코티솔 농도의 함수로서 바이오센서의 전기화학적 반응은 순환 전압전류법 및 차동 펄스 전압전류법을 사용하여 결정되었습니다. 이 코티솔 바이오센서는 100pM ~ 100μM의 검출 범위, 100pM의 검출 한계, 0.0103mA/Mcm² 감도를 나타냈습니다. (R ² =0.9979). 마지막으로, 개발된 전기화학 시스템을 사용하여 얻은 실제 타액 샘플의 코티솔 농도는 효소 결합 면역흡착 분석법을 사용하여 얻은 결과와 잘 상관되었습니다. 이 바이오센서는 항체-항원 상호작용의 특이성을 기반으로 생리학적 범위에서 타액 코르티솔의 전기화학적 검출을 위해 성공적으로 준비되고 사용되었습니다.

소개

스테로이드 호르몬인 코티솔은 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 시스템에서 분비됩니다. 이는 심리적 스트레스의 잘 알려진 바이오마커이므로 "스트레스 호르몬"으로 불립니다[1, 2]. 코르티솔 수치는 24시간 주기에 걸쳐 일주기 리듬을 따릅니다. 가장 높은 수준은 이른 아침에 관찰되며 수준은 밤에 점진적으로 감소합니다[3,4,5,6]. 과도한 수준의 코티솔은 중심 비만, 자주색 줄무늬 및 근위 근육 약화의 증상과 함께 쿠싱 병을 유발할 수 있습니다. 그러나 코티솔 수치가 감소하면 만성 피로, 권태감, 식욕 부진, 자세 저혈압 및 저혈당증을 동반한 애디슨병이 발생할 수 있습니다[7,8,9]. 따라서 적절한 코티솔 균형을 유지하는 것은 인간의 건강에 필수적입니다.

의학적, 심리적으로 관련된 사건의 전조로서 코티솔 측정에 대한 관심이 증가하고 있으며, 그 중 가장 최근의 고통은 외상 후 스트레스 장애(PTSD)입니다. PTSD에서 비정상적인 HPA 축 기능의 중요성은 논쟁의 여지가 없습니다. 따라서 전통적인 평가 방법은 여전히 풍부한 증거와 정보를 제공할 수 있습니다[10,11,12,13,14]. 최근 많은 연구에서 코르티솔 검출의 중요성을 보고하고 다양한 질병과의 상관관계를 확인했습니다[15,16,17,18]. 다양한 연구에서 코티솔이 자폐 스펙트럼 장애[19], 우울증[20], 자살 충동[21], 아동기 역경 및 외현화 장애[22]와 관련이 있음이 확인되었습니다.

코르티솔 수치를 확인하는 것이 중요한 진단 도구이기는 하지만 크로마토그래피[23, 24], 방사선 면역분석[25], 전기화학발광 면역분석[26,27,28], 효소결합 면역흡착 분석[28, 29]과 같은 일상적인 실험실 코르티솔 검출 기술[28, 29] ], 표면 플라즈몬 공명 [1, 30, 31] 및 석영 수정 미세 저울 [32]은 분석 시간이 길고 비용이 많이 들고 현장 진료(POC) 설정에서 구현할 수 없습니다[33]. 따라서 현재 민감하고 효율적이며 실시간으로 코티솔 수치를 측정할 필요가 있습니다.

최근 몇 년 동안 항원과 항체 사이의 특이적 분자 인식에 기반을 둔 전기화학적 면역분석법은 간단한 장치, 신속한 분석, 저비용, 무표지 POC 검사, 생체 유체에서 코티솔에 대한 높은 감도 및 낮은 검출 임계값 [34, 35]. 전위 변화는 전극에서 전기화학적 산화환원 반응 농도의 변화에 기인합니다. 분비된 코티솔은 결국 순환계로 들어가 간질액[36], 혈액[37], 소변[38], 땀[39], 타액[40]과 같은 다양한 생체 유체에서 발견될 수 있습니다. 비침습적 방법인 타액 코르티솔의 전기화학적 검출의 장점은 시료 수집, 취급 및 보관이 용이하여 실시간 측정을 위한 POC 센서의 응용 가능성을 높였습니다[41].

이상적인 바이오센서는 낮은 검출 한계, 빠른 선택성 및 높은 감도를 가져야 합니다. 면역 센서를 제작하기 위해 선택한 고정 매트릭스는 높은 전자 전달 속도와 함께 높은 표면 기능성, 높은 생체 분자 로딩 및 낮은 전자 전달 저항을 가져야 합니다[42]. 그러나 전기화학적 바이오센싱을 위한 단백질 고정화를 위한 금속 황화물 나노물질은 거의 제안되지 않았다. 따라서 여기에서 이황화주석은 타액에 존재하는 코티솔을 감지하기 위한 면역 센서 개발을 위한 잠재적인 고정 매트릭스로 선택되었습니다.

나노 2차원(2D) 재료는 최근 10년 동안 풍부한 연구 관심을 불러일으켰습니다. 반도체에서 금속까지, 무기에서 유기까지[43,44,45,46] 및 관련 복합 재료[47,48,49,50]에 이르기까지 다양한 종류의 2D 재료가 있습니다. 나노 2D 물질에 대한 발견, 제조 및 조사는 다양한 분야에서 지배적인 흐름입니다. 나노 2D 이황화주석(SnS₂ ), 2.18–2.44 eV의 밴드갭을 갖는 n형 반도체[51, 52]는 육각형으로 배치되고 밀접하게 배열된 황(S) 원자의 두 층 사이에 샌드위치된 Sn 원자로 구성되며 인접한 S 층은 약한 반 데르로 연결됩니다. 발스 세력[53]. 흥미로운 전기적 특성, 높은 캐리어 이동성, 우수한 화학적 안정성, 저렴한 비용 및 광학적 특성으로 인해 [54], SnS₂ 리튬 이온 배터리 [57, 58], 가스 센서 및 포도당 모니터 [59, 60]의 전극으로 태양 전지 및 광전자 장치 [55, 56]의 다양한 응용 분야에서 유망한 재료로 발전했습니다. 전극 재료의 선택은 효소와 전극 표면 사이의 전자 이동을 용이하게 하기 위해 넓은 반응 면적과 유리한 미세 환경을 제공하여 성능을 향상시키는 중요한 핵심 요소입니다.

이 작업에서 바이오 센서는 SnS₂를 사용하여 제작되었습니다. 코티솔을 검출하기 위한 고정 매트릭스로 사용됩니다. 전기화학적 감지와 관련된 차동 펄스 전압전류법(DPV) 연구 결과에 따르면 0.0103mA/Mcm² 의 높은 감도가 나타납니다. 100 pM의 최저 검출 농도.

자료 및 방법

자료

히드로코르티손(코르티솔), 항토끼 코르티솔 항체(항코르티솔, C-M_ab ), 칼륨 헥사시아노철산염(II), 칼륨 헥사시아노철산염(III), β-에스트라디올, 테스토스테론, 프로게스테론 및 코르티코스테론은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 소 혈청 알부민(BSA)은 PanReac에서 입수했습니다. 주석(IV) 염화물 5수화물(SnCl₄ ^. 5H₂ O) 및 티오아세트아미드(C₂ H₅ NS)는 Showa(일본) 및 Alfa Aesar(영국)에서 공급했습니다. NaCl, KCl, Na₂로 준비된 인산염 완충 식염수(PBS) HPO₄ , 및 KH₂ PO₄ Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 미세 광택 알루미나는 Buehler(영국)에서 공급되었습니다. 다른 모든 화학 물질은 분석 등급이었고 추가 정제 없이 사용되었습니다. Cortisol Saliva ELISA 키트(Cat # SA E-6000)는 LDN(독일)에서 구입했습니다.

이황화주석의 합성

SnCl₄ 분말 ·5H₂ O 및 C₂ H₅ NS를 70mL 탈이온수에 혼합하고 pH를 7.4로 조정했습니다. 반응물을 포함하는 열수 오토클레이브 반응기를 실온에서 200 ^° 까지 가열했습니다. 1시간 내에 C, 200 ^° 에서 유지 11시간 동안 C. 그런 다음 결과 SnS₂ 분말을 6000rpm에서 15분 동안 탈이온수와 에탄올로 세척하고, 마지막으로 80 ^° 공기 중에서 건조했습니다. C. 이 열수법은 SnS₂ 합성에 성공적으로 적용되었습니다. .

재료 특성화

X선 회절(XRD, PANalytical, The Netherlands)을 사용하여 2D 육각형 SnS₂의 결정상을 조사했습니다. 플레이크. 다기능 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM, Zeiss, Germany)을 사용하여 재료의 표면 형태를 이미지화했습니다. 전계 방출 총 투과 전자 현미경(FEG-TEM, Tecnai, USA)을 사용하여 SnS₂의 미세 구조를 식별했습니다. , 선택 영역 회절(SAED, Tecnai)을 사용하여 결정 패턴을 얻었습니다.

BSA/C-M의 제작_ab /SnS₂ /GCE 바이오센서

유리질 탄소 전극(GCE)은 먼저 알루미나 슬러리로 연마한 다음 5M SnS₂ 혼합물을 떨어뜨립니다. 전처리된 GCE의 표면에 증착되었습니다. 항-코르티솔 항체(1 mg/mL) 및 BSA(1%)의 용액을 PBS에서 제조하였다. SNS₂ 그런 다음 /GCE를 항체 및 BSA 용액으로 순서대로 장식했습니다. 조작된 BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE 바이오센서는 4 ^° 에서 냉장 보관되었습니다. C 사용하지 않을 때. 연구 개념과 탐지 시스템의 설정은 그림 1에 나와 있습니다.

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탐지 시스템의 연구 개념 및 설정

전기화학 분석

조작된 BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE는 전기화학적 임피던스 분광법(EIS) 및 순환 전압전류법(CV)을 사용하여 특성화되어 전기 활성 동작을 비교했습니다. 코르티솔 농도의 함수로서의 전기화학적 반응 연구는 CV 및 차동 펄스 전압전류법(DPV)을 사용하여 수행되었습니다. 모든 실험은 5 mM Fe(CN )₆ ^3-/4- . 전기화학적 측정은 모델 CHI6114E 시리즈 전기화학적 워크스테이션(CH Instruments, USA)에서 수행되었습니다. CV 및 DPV 측정은 달리 명시되지 않는 한 10mV/s 스캔 속도에서 - 0.4V와 1.0V 사이에서 수행되었습니다.

타액 샘플 수집 및 전기화학적 감지

개발된 BSA/C-M_ab을 검증하기 위해 정오쯤 두 명의 건강한 자발적 피험자로부터 타액 샘플(2mL)을 수집했습니다. /SnS₂ /GCE. 타액 샘플은 여과 없이 얻어졌으며 생물학적 특성을 유지하기 위해 초기에 - 20 °C에서 보관되었습니다. 감지하기 전에 타액 샘플을 실온으로 해동하고 3500 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 측정을 위한 상등액을 수집했습니다. 분리된 타액은 - 20 °C에서 보관되었습니다. BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE는 타액 샘플에서 코티솔 농도의 전기화학적 감지에 사용되었습니다. BSA/C-M_ab으로 전기화학적 분석을 사용한 코티솔 검출 /SnS₂ /GCE는 위에서 언급한 상업적으로 이용 가능한 ELISA 코르티솔 키트와 비교되었습니다.

간섭 연구

BSA/C-M_ab에 대한 다른 스테로이드 호르몬과 같은 잠재적 교란제의 억제 효과 /SnS₂ /GCE 특이성은 바이오센서를 100 nM β-에스트라디올, 100 nM 테스토스테론, 100 nM 프로게스테론, 100 nM 코르티코스테론에 10분 동안 넣은 다음 CV로 스캔하여 조사했습니다. 스캐닝 속도는 10mV/s이고 스캐닝 범위는 - 0.4V ~ 0.6V입니다.

ELISA에 의한 타액 코르티솔 검출

ELISA는 제조업체의 프로토콜에 따라 타액 샘플에 대해 수행되었습니다. 코티솔 측정을 위한 보정 곡선을 설정하기 위해 각 웰의 흡광도를 측정하기 위해 6개의 알려진 표준 코티솔 농도(0.0, 0.1, 0.4, 1.7, 7.0 및 30ng/mL)를 포함하는 96웰 역가 플레이트에서 분석을 수행했습니다. 450nm에서 미지의 샘플 계산을 위한 방정식을 얻기 위해 보정 곡선에 추세선이 맞춰졌습니다.

결과 및 토론

SnS의 자료 분석₂

그림 2a의 XRD 패턴에서 알 수 있듯이 합성된 제품은 육각상 SnS₂에 해당하는 XRD 피크만 표시합니다. (JCPDS 카드 번호 89-2358). 그림 2b, c는 합성된 SnS₂의 FE-SEM 이미지를 보여줍니다. 약 300 nm 크기의 균일한 플레이크 같은 형태를 가집니다. 그림 2d–f는 SnS₂의 FEG-TEM 및 SAED 이미지를 보여줍니다. , 여기서 0.167 nm 및 0.316 nm의 격자 무늬 간격이 육각형 SnS₂에 대해 식별됩니다. 단결정 구조로. 나노플레이크의 적층은 총 두께가 10nm 미만인 10개 미만의 층입니다.

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아 SnS₂의 XRD 패턴 . SnS₂의 FE-SEM 이미지 나노플레이크는 (b ) × 250,000 및 (c ) × 100,000 d SnS₂의 FEG-TEM 이미지 나노플레이크. 이 SnS₂의 단면 FEG-TEM 나노플레이크 및 확대된 FEG-TEM 이미지. 에 SnS₂의 SAED 이미지 나노플레이크

전극의 전기화학적 반응

산화 전류는 이황화주석을 추가하면 크게 증가할 수 있습니다. Fig. 3a, b에서 보는 바와 같이 SnS₂에서 감소된 산화전류의 크기 /GCE에서 C-M_ab으로 /SnS₂ /GCE 다음에 BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE, 전하 이동 저항 값이 증가함에 따라. 따라서 결과는 전극에서 센서 특성이 수정되었음을 나타냅니다. 처음에는 BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE는 그림 3c와 같이 스캔 속도를 10mV/s에서 100mV/s로 변경하여 연구했습니다. 그림 3d와 같이 스캔 속도에 따른 전류 응답의 변화는 산화 전류가 스캔 속도에 따라 선형적으로 증가하고 다음 관계를 따랐음을 보여줍니다. I =0.5156 υ–0.0319 (R ² =0.9985) 산화, 그리고 I =0.6758υ–0.0288 (R ² =0.9997) 감소. 그러나 잘 정의된 산화환원 피크와 함께 스캔 속도가 증가함에 따라 피크 전류가 증가하는 선형성에 가깝다는 것은 안정적인 전자 전달과 함께 표면 제어 프로세스를 나타냅니다.

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아 GCE 전극(곡선 a), SnS₂의 CV 응답 연구 /GCE 전극(커브 b), C-M_ab /SnS₂ /GCE 전극(곡선 c), BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE 전극(커브 d). ㄴ GCE, SnS₂의 EIS 대응 연구 /GCE, C-M_ab /SnS₂ /GCE 및 BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE 전극. 삽입:해당 등가 회로. ㄷ BSA/C-M_ab의 산화 반응 전류의 크기 증가 /SnS₂ /GCE 전극은 스캔 속도가 10mV/s에서 100mV/s로 증가했습니다. d 현재 크기는 스캔 속도가 증가함에 따라 증가했습니다. 이 BSA/C-M_ab의 이력서 연구 /SnS₂ /GCE 전극은 100pM에서 100μM까지 다양한 코티솔 농도의 함수입니다. 에 코티솔 농도가 다른 현재 반응에 대한 선형 곡선. 지 BSA/C-M_ab의 DPV 연구 /SnS₂ /GCE 전극은 100pM에서 100μM까지 다양한 코티솔 농도의 함수입니다. 아 코티솔 농도가 다른 현재 반응에 대한 선형성 곡선

전류는 100pM에서 100μM 범위에 걸쳐 코티솔 농도가 증가함에 따라 감소했습니다. 전류의 차이는 감지되는 코티솔 농도와 직접적인 상관관계가 있습니다. BSA/C-M_ab에 대해 전류 값과 잘 분리된 산화 피크를 얻었습니다. /SnS₂ /GCE 전극, 도 3e, f에 도시된 바와 같이. 농도의 로그에 따른 전류의 변화는 거의 선형이었습니다. CV에 대해 선형 회귀 계수의 감소가 더 좋다는 것은 분명합니다. 따라서 보다 구체적이고 정확한 DPV로 추가 측정이 이루어졌습니다. 이러한 DPV 연구의 결과는 전류 응답의 크기가 그림 3g에 설명된 것처럼 코티솔을 추가함에 따라 감소했음을 나타냅니다. 그림 3h에 표시된 보정 곡선은 전류 응답의 크기와 코티솔 농도의 대수를 표시하며 선형 종속적이며 다음 방정식을 따르는 것으로 나타났습니다. y =− 0.0103x + 0.0443; R ² =0.9979. 이 센서는 100pM에서 100μM 사이의 감지 범위를 나타내었으며 감지 한계는 100pM이고 감도는 0.0103mA/Mcm² 입니다. (R ² =0.9979).

저장소 안정성 연구

BSA/C-M_ab의 유통 기한을 연구하기 위해 CV 연구도 수행되었습니다. /SnS₂ /GCE 1일에서 1주일 간격으로. 두 가지 보존 조건을 비교하기 위해 하나의 조건은 전극을 진공 건조하여 보관하는 것이고 다른 하나는 전극을 4°C에서 보관하는 것이었습니다. 4°C 및 진공 상태에서 전극의 산화환원 피크 안정성은 각각 그림 4a, c에 나와 있습니다. 4 °C의 보존 조건이 진공 상태보다 더 나은 것은 분명합니다. 그림 4b, d는 전극 안정성 값이 7일 동안 진공 하에 보관된 전극의 경우 82%인 반면 전극 안정성 값은 4°C에 보관된 전극의 경우 91%임을 보여줍니다. 4 °C에 보관된 전극의 안정성이 진공 상태보다 더 높음을 관찰할 수 있습니다. 전극의 활성 손실은 진공 상태에서 코르티솔 항체 활성의 저하로 인해 발생할 수 있습니다. 저장 안정성은 효소 센서의 중요한 문제입니다. 보호 코팅은 향후 전극 설계에 도입될 수 있습니다.

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BSA/C-M_ab의 산화환원 피크 안정성 /SnS₂ 보존 조건이 다른 /GCE 전극(a 그리고 b ) 진공 상태(c 그리고 d ) 4°C에서 7일 동안

간섭 연구

BSA/C-M_ab의 CV 연구 결과 /SnS₂ β-에스트라디올(100 nM), 테스토스테론(100 nM), 프로게스테론(100 nM) 및 코르티코스테론(100 nM)과 같은 잠재적 교란제를 코티솔(10 nM)에 대해 측정하기 위한 /GCE는 그림 1에 나와 있습니다. 5a. 코르티솔 신호의 반응 변화에 비해 간섭의 영향은 코르티솔에 대한 결과의 5% 미만으로, 이러한 잠재적 간섭을 편리하게 무시할 수 있음을 시사합니다.

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아 코티솔(10nM)과 관련된 β-에스트라디올(100nM), 테스토스테론(100nM), 프로게스테론(100nM) 및 코르티코스테론(100nM)을 포함하는 간섭 연구. ㄴ ELISA와 전기화학적 방법을 사용한 타액 코르티솔 측정 비교

ELISA 및 전기화학적 방법을 사용한 타액 코르티솔 검출

ELISA 및 BSA/C-M_ab으로 수행된 타액 코르티솔 샘플 측정 /SnS₂ /GCE 전극은 표 1 및 그림 5b에 요약되어 있습니다. ELISA를 사용하여 측정한 코티솔 농도는 1.105 ×10^-8 이었습니다. M 및 3.998 × 10⁻⁹ M. 전기화학적 측정을 이용한 코르티솔의 계산 결과는 1.046 × 10⁻⁸ M 및 3.911 × 10⁻⁹ M. 이 두 기술로 좋은 상관 관계를 얻었으며 2-5%의 차이로 비슷한 결과를 보였습니다. 따라서 결과는 이 BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE는 타액과 같은 생물학적으로 관련된 유체에서 전기화학적 코르티솔 감지에 사용할 수 있습니다.

다른 연구와의 비교

이 연구의 결과는 이 BSA/C-M_ab의 성능을 더 잘 이해하기 위해 문헌에 보고된 타액 코르티솔의 전기화학적 센서와 관련된 다른 연구와 비교되었습니다. /SnS₂ /GCE. 표 2와 3은 코티솔 검출에서 비금 전극을 사용하여 얻은 결과를 비교한 것입니다. 현재 작업의 세 가지 주요 이점이 있습니다. 첫째, 재료는 다른 연구에서 제시된 장치보다 비용면에서 훨씬 낮습니다. 둘째, 준비 과정이 비교적 간단하고 신속했습니다. 마지막으로, 검출 한계는 다른 문헌에서 보고된 것과 유사하거나 실제로 보고된 것보다 훨씬 더 나은 반면 타액 코르티솔의 목표 검출 범위는 쉽게 얻을 수 있습니다.

결론

SnS₂ 합성을 위해 열수법이 성공적으로 적용되었습니다. . SnS₂의 속성 XRD, FE-SEM, FEG-TEM 및 SAED로 특성화되었습니다. 코르티솔 농도의 함수로서 전극의 전기화학적 반응은 CV 및 DPV를 사용하여 결정되었습니다. 당사의 코티솔 센서는 100pM ~ 100μM의 감지 범위, 100pM의 감지 한계 및 0.0103mA/Mcm² 감도를 나타냈습니다. (R ² =0.9979). 획득한 감지 매개변수는 정상적인 생리학적 범위에 있었습니다. 잠재적 간섭의 영향은 5% 미만으로 이 센서의 우수한 특이성을 나타냅니다. 안정성 테스트는 4°C에 보관된 센서의 활동이 진공 상태보다 더 나은 것으로 나타났습니다. 타액 샘플에서 코티솔 측정을 위한 이 전극의 결과는 ELISA와 일치했습니다. 따라서 이 BSA/C-M_ab를 이용한 전기화학적 분석 /SnS₂ /GCE 전극은 시간이 많이 소요되는 기존의 면역분석법을 대체할 수 있습니다.