현재 금 나노 입자는 특성과 특성을 이용하여 공학 및 의료 과학 분야에서 응용 프로그램을 발견했습니다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명은 세포 흡수의 핵심을 나타내는 고밀도와 같은 광학 응용 및 기타 물리적 특성의 주요 기능 중 하나입니다. 다른 응용 분야 중에서 의료 분야에서 일부 질병은 단일 유전 또는 다 유전 장애 및 감염을 포함하여 유전자 요법을 사용하여 치료할 수 있습니다. 유전자 추가, 억제 또는 치환은 유전자 조작을 위한 많은 옵션 중 하나입니다. 이 연구는 유기 고분자로 기능화된 금 나노 입자를 사용하여 유전자 전달을 위한 대체 비바이러스 방법을 탐구합니다. 두 가지 합성 경로가 사용되었습니다. 하나는 환원제로 수소화붕소나트륨을 사용하고 다른 하나는 환원제 및 안정화제로 키토산 올리고당을 사용하는 것입니다. 키토산, 아실화 키토산 및 키토산 올리고당과 결합된 금 나노입자를 사용하여 플라스미드 DNA의 세포 배양(HEK-293)으로의 형질감염 효율을 평가했습니다. 금 나노복합체의 물리화학적 특성은 UV-Vis Spectroscopy, ξ-를 사용하여 특성화되었습니다. 전위 및 투과 전자 현미경. 또한, 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 금 나노입자와 플라스미드 DNA 사이의 상호작용을 입증하였다. 형질감염 시험을 수행하고 β-갈락토시다제 활성 및 녹색 형광 단백질 발현에 의해 평가하였다. chitosan, acylated chitosan 및 chitosan oligosaccharide로 얻은 transfection의 비율은 각각 27%, 33% 및 60%였습니다.
<섹션 데이터-제목="배경">유전자 치료는 다양한 목적을 위해 유전 물질을 세포에 도입하는 방법으로 간략히 정의할 수 있으며, 그 중 유전 질환의 치료[1]. 유전자 치료용 DNA 벡터의 두 가지 주요 유형인 바이러스 및 비바이러스 중 마지막 것은 면역원성 부재, 우수한 순응도, 비감염성[2], 저장 안정성 및 생산 용이성의 장점이 있다. 한편, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련바이러스 등과 같은 바이러스 벡터는 형질전환율이 높고 전사가 빠르더라도 순환으로부터의 빠른 제거, 독성, 면역원성, 용량 감소 등의 단점이 있다. 많은 양의 정보를 전달하기 위해 [3,4,5]. 일반적으로 비바이러스성 운반체의 경우 외래 DNA가 플라스미드에 로딩되어 접합체 또는 복합체 형성 전반에 걸쳐 보호 및 안정화됩니다. 특히, 키토산(CO)은 높은 형질전환율과 낮은 독성을 나타내어 세포간 수송 동안 핵산으로부터 DNA를 보호하기 때문에 비바이러스성 DNA 벡터의 개발을 위해 연구되고 있다[4]. 자연계에 널리 존재하는 이 고분자(갑각류 껍질의 주성분 및 많은 균류의 세포벽의 일부로 발견됨[6])는 키틴 변형(2-아미노-2-데옥시를 얻음) 후에 얻을 수 있는 다당류입니다. -β-D-글루코피라노스 반복 단위이지만 여전히 소량의 2-아세트아미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노스 잔기[7])(그림 1a). 천연 키토산의 의학적 적용은 대부분의 경우 폴리머의 일부 변형을 필요로 합니다. 극복해야 할 주요 단점 중 하나는 생리학적 pH에 대한 불용성 및 묽은 산 용액에서 높은 점도이다[8]. 일부 연구자들은 세포 형질감염 역학이 비히클의 크기와 모양에 의존한다고 지적했습니다[1, 8,9,10,11,12], 예를 들어 Huo et. 알. 이러한 특성이 금 나노입자의 경우 침투 효율과 어떻게 관련되는지 보고했습니다[10].
키토산 용해도는 사슬에 남아 있는 아세틸기의 분포와 아세틸화 정도를 변경하여 수정할 수 있습니다[13]. 키토산의 물리적 특성을 제어하는 또 다른 방법은 아실화입니다(그림 1b). 아미노기의 이용 가능성과 아세틸화 정도에 따라 키토산의 일부 생물학적 상호작용이 조절되어 지방산과의 아실화에 의해 소수성이 증가할 수 있습니다[7]. Le Tien et. 알. [7]은 의약품에서 제어 방출 매트릭스에 대한 키토산 N-아실화를 보고했습니다. Bhattarai et. 알. N-아실화 키토산 안정화 금 나노입자를 생리학적 조건에 적용하여 비아실화 키토산의 장점을 나타내었다. 키토산의 또 다른 유용한 변형은 고분자 사슬 길이를 줄이는 것입니다(Chitosan oligosaccharide, COS) [15]. 키토산에서 얻은 여러 종류의 COS의 특성 중 점도가 낮고 물에 대한 용해도가 높기 때문에 많은 응용 분야에 매우 유용합니다[16]. 저분자량의 키토산은 주로 더 짧은 사슬 길이(2-10 D-글루코사민 단위)(그림 1c)와 유리 아미노기 때문에 세포 흡수를 증가시킬 수 있다고 보고되었습니다[17,18,19]. 또한 환원제로 키토산 올리고당을 사용하여 금 나노 입자를 합성할 때 독성 시약이 포함되지 않습니다[20].
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a의 화학 구조 키토산, b 아실화 키토산 및 c 키토산 올리고당
금 나노입자(AuNPs)는 광학적 특성과 높은 물리적 안정성을 활용하여 여러 응용 분야에서 매우 실용적인 옵션이 되는 새로운 종류의 나노 물질 개발을 이끌었습니다[21,22,23,24,25]. 이로써 밀도가 더 높고 흡수 시간이 감소하여 리포복합체 또는 중합체에 비해 세포 형질감염이 개선되었습니다[12]. 금은 아미노(-NH2)와 친화력이 높기 때문에 ), 시아노(-CN) 및 티올(-SH) 작용기, 다양한 유형의 작용화에 대한 방대한 기회가 열려 있습니다[9, 26]. 양이온성 단층은 예를 들어 금 나노입자에 양이온성 고분자를 추가하여 핵산 상호작용과 정전기 흡착을 개선함으로써 얻을 수 있습니다[27, 28]. 이러한 방식으로 키토산과 금을 결합한 나노복합체는 생물학적 응용을 위한 두 재료의 이점을 취하며[29,30,31,32,33], 이는 DNA 운반체 개발을 위한 유망한 재료를 나타냅니다[5, 10, 12, 14].
AuNP를 합성하는 생물학적 방법에는 탄수화물, 미생물, 효소, 비타민, 생체고분자 등의 다양한 생물학적 방법이 있습니다[34]. 소위 녹색 합성[35] 사이에서 환원제와 안정화제로 키토산을 사용하는 원 포트 합성 방법의 사용은 생물의학 적용에 더 조정 가능하고 안전한 것으로 입증되었습니다[36, 37]. 기존 합성 방법과 동일하게 원-포트 합성의 경우 얻어지는 입자 크기는 환원제의 농도에 따라 달라집니다. 이와 같이 키토산 올리고당의 경우 나노입자의 크기와 모양 분포에 중요한 키토산의 분자량인 키토산의 분자량이 다른 입자 크기를 얻기 위해서는 키토산/금 비율을 조절해야 한다. 이 연구는 유사한 응용에 대해 보고된 것보다 분자량이 낮은 5 kDa 키토산 올리고당을 사용한 녹색/원-포트 합성을 포함하여 DNA 형질감염을 위한 다양한 키토산-AuNP 기반 나노복합체의 평가를 목표로 했습니다[36, 38].
HEK-293 세포주(호모 사피엔스 (인간)-상피 형태-배아 신장-태아) pSV-β-Gal 및 pIRES2-EGFP 플라스미드. 이러한 테스트는 Corsi et. 알. [4], transfection은 MG63 및 중간엽 줄기세포에 비해 세포주 HEK-293에 더 유리합니다.
각 실험은 변형된 키토산과 변형되지 않은 키토산이 있는 금 나노 입자로 수행되었습니다. 두 가지 주요 합성 방법이 사용되었습니다. 하나는 단순한 형태의 키토산(CO-AuNPs)과 소수성으로 변형된 아실 그룹 키토산(Acyl-CO-AuNPs)을 포함하는 금 나노입자의 화학적 합성을 포함하고 다른 하나는 녹색/원- 단쇄 키토산(키토산 올리고당, COS@n-AuNPs)을 사용한 냄비 합성. 그림 2는 각 합성에 대한 개략도를 보여줍니다. 해당 실험 절차는 아래에 설명되어 있습니다.
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각 합성의 개략도:a –b 단순한 형태의 키토산(CO-AuNPs)과 소수성으로 변형된 아실기(Acyl-CO-AuNPs) 및 c를 포함하는 금 나노입자의 화학적 합성 –f 짧은 사슬 키토산(키토산 올리고당, COS@n-AuNPs)에 대한 녹색/원 포트 합성
금(III) 염화물 삼수화물(HAuCl4 ∙3H2 O), 수소화붕소나트륨(NaBH4 ), 저분자량 키토산(50-190 kDa, 75% 탈아세틸화도) 및 키토산 올리고당(저분자량, 5 kDa)은 Sigma Aldrich에서 얻었다. 모든 유리 제품을 세척하고 새로 준비한 왕수(HCl:HNO3 , 3:1 v /v ) 24 시간 동안 금속의 흔적을 제거하기 위해 사용하기 전에 Mili-Q 물로 완전히 헹구십시오[39].
키토산-금 나노입자 합성은 Huang et. 알. [9]의 방법론. 이를 위해 20 mg의 저분자량 키토산 용액(2 mg/ml)을 10 ml의 1% 아세트산에 첨가하고 완전히 용해될 때까지 와류로 혼합하고 밤새 보관하였다. 얻어진 용액 2ml를 0.22μm 폴리에테르설폰 시린지 필터를 사용하여 여과한 다음, 10mM HAuCl4 1ml와 혼합하였다. ∙3H2 O 용액을 30 분 동안 강하게 저어줍니다. 새로 준비된 100 mM NaBH4 0.4 ml 차가운 용액을 환원제로 사용했습니다. 교반하면서 적가하고, 황색에서 포도주색으로 빠르게 변하는 색이 관찰되었다; 그 후, 총 2 시간 동안 교반을 계속하였다(그림 2a).
카프로일 클로라이드(C6 H11 ClO, Sigma Aldrich)는 acylated chitosan-gold nanoparticles의 합성에 사용되었습니다.
키토산(저분자량) 아실화는 Remant Bahadur et al.에 의해 보고된 방법에 따라 수행되었습니다. [6] 약간의 수정이 있습니다. 이를 위해 0.83 g의 키토산을 100 ml의 1% 아세트산 용액에 첨가하고 24시간 동안 계속 교반하였다. 이 용액 5ml를 0.22μm 폴리에테르설폰 시린지 필터로 여과한 다음, 격렬하게 교반하면서 천천히 첨가한 0.1M 수산화나트륨(NaOH) 용액으로 pH를 7.2로 조정하였다. 이 마지막 용액 5ml에 카프로일 클로라이드 1ml를 첨가하고 생성된 혼합물을 5시간 동안 교반하였다. 혼합물의 pH는 수산화물 용액으로 6.8-7로 조정되었습니다. 얻어진 겔을 아세톤으로 침전시키고 4 ℃에서 5000 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 과량의 카프로산은 메탄올(50–60 °C)로 3회 세척하고 경사를 따라 스토브에서 3일 동안 건조하여 제거했습니다. 이 젤은 나노복합체 합성에 사용되었습니다.
10mM HAuCl4 1밀리리터 ∙3H2 O 용액을 0.1 M HCl 용액에 0.33%로 희석된 2 ml의 겔에 첨가하고 1 시간 동안 교반하였다. 마지막으로 여기에 0.1M NaBH4의 마지막 0.4 ml를 추가합니다. 신선하게 준비된 차가운 용액을 교반하면서 금 나노 입자 형성은 2 h 연속 교반을 완료하기 전에 분홍색/적색으로 변하는 것이 분명했습니다(그림 2b).
COS@n-AuNPs는 Manivasagan et al.에 의해 보고된 수정된 방법론에 따라 준비되었습니다. [20]. 키토산 올리고당(COS)을 10 ml의 HAuCl4에 첨가했습니다. ∙3H2 O 용액을 넣고 80 °C에서 60분 동안 교반합니다. COS의 양(100 및 200 mg)과 HAuCl4의 금 농도를 변화시켜 4가지 합성을 수행했습니다. ∙3H2 O 용액(0.003 및 0.017 wt%). 표 1은 각 실험의 AuNP 합성에 사용된 매개변수를 보여줍니다. 금 나노입자 형성은 와인-레드/핑크-레드 색상 전환과 함께 명백했으며, 환원제 및 금 전구체의 양에 따라 각각의 경우 상이한 시간에 색상 변화를 기록하였다. 얻어진 나노복합체를 12,000g에서 원심분리하여 정제했습니다. 30 분 동안(그림 2c–f).
CO-AuNPs에 사용된 키토산, Acyl-CO-AuNPs에 대한 아실화 키토산 및 일련의 COS@n-AuNPs에 대한 키토산 올리고당을 FTIR 분광법(Spectrum One, Perkin Elmer)으로 특성화하여 Acyl-CO 폴리머의 아실화를 확인했습니다. 샘플 사이의 기능 그룹에서 특성 밴드의 강도. Remant Bahadur et.에 따르면 IR 스펙트럼 정보에서 치환도(SD)를 추정했습니다. 알. [6].
복합 표면 전위를 평가하기 위해 Zetasizer(Nano Z, Malvern)를 사용했습니다. 나노복합체는 DNA에 성공적으로 부착되어 복합체를 형성할 수 있을 것으로 기대됩니다. ξ- DNA 부착 후 변화를 확인하기 위해 복합체 형성 전후에 잠재력을 평가했습니다. 모세관 세포(DTS 1060, Malvern)를 사용하여 표면 전위 측정에 적절한 희석 샘플 1.5ml를 사용했습니다.
400~700 nm 범위의 UV-Vis 스펙트럼(UV-1800 m, Shimadzu)은 530 nm 부근의 표면 플라즈몬 공명 밴드를 통해 금 나노 입자 형성의 예비 확인을 위해 획득되었습니다. 보완적으로 새로 준비된 나노복합체의 스펙트럼을 사용하여 샘플의 광안정성을 정성적으로 평가했습니다. 이것은 합성 후 150 일에 동일한 샘플에서 얻은 스펙트럼과 비교하고 표면 플라즈몬 공명 대역 주변의 변화를 추적하고 각 방법에 대해 하나의 샘플을 선택하고 COS@n-AuNP의 가장 대표적인 것으로 COS@2-AuNP를 사용하여 수행되었습니다. 시리즈. Quartz cell은 sample의 용기로 사용되었고 deionized water는 blank로 사용되었습니다.
TEM 현미경(JEM 1010, JEOL)을 사용하여 모양 및 입자 크기 분포를 결정했습니다. TEM 이미지의 경우, 200 메쉬 구리 그리드 지지대 위에 10 μl 용액을 증착하고 formvar로 덮고 실온에서 15분 동안 건조하여 나노복합체 샘플을 준비했습니다. Matlab® 소프트웨어로 개발된 집에서 만든 이미징 처리 프로그램을 사용하여 각 샘플에 대해 3개의 이미지를 선택하고 분석했습니다.
pSV-β-Gal(6.82 kb) 및 pIRES2-EGFP(5.3 kb)(pDNA)는 형질전환된 DH5α Escherichia coli에서 분리되었습니다. . 플라스미드 정제는 Mo Bio® UltraClean Microbial DNA Isolation Kit를 사용하여 알칼리 용해에 의해 수행되었습니다. 아가로스 겔 전기영동은 고성능 자외선 투과 조명기를 사용하여 플라스미드의 구조적 무결성을 확인하고 Kodak Gel Logic 100 디지털 이미징 시스템으로 이미지를 수집하는 데 사용되었습니다. 플라스미드 DNA 농도 및 순도는 Gen5 프로그램을 사용하는 Synergy™ 2 다중 검출 마이크로플레이트 판독기로 검증되었습니다. 복합체는 무혈청 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM, Sigma-Aldrich)에서 각 유형의 금 키토산 나노입자 나노복합체와 플라스미드 DNA(pDNA)를 200~400 ng의 플라스미드 양으로 혼합하여 얻었습니다. 나노복합체에 대한 pDNA 접착력은 0.8%의 아가로스 겔과 60분 동안 90 V의 전압을 사용하여 전기영동으로 평가되었습니다.
HEK-293 호모 사피엔스 (인간)-상피 형태-배아 신장-태아 세포를 5% CO2에서 37 °C, 소 태아 혈청(SFB, Sigma-Aldrich)이 포함된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에서 배양했습니다. - 포함하는 분위기. pDNA 형질감염을 위해 HEK-293 세포를 96웰 플레이트에 웰당 12,000개 세포로 시딩하고 5% CO2에서 37°C, 24시간 동안 인큐베이션했습니다. -90% 합류점 획득.
시험관 내 pDNA 나노복합체 기능화는 세포가 간신히 덮일 때까지 웰에서 배양 배지를 붓고 각 웰에 복합 용액(나노복합체 15μl 및 DNA 200ng)을 첨가하여 동일한 배양 조건에서 2시간 동안 배양함으로써 수행되었습니다. 그 후, 500 μl의 완전한 DMEM을 48시간 동안 배양을 위해 첨가하였다. pIRES2-EGFP 형질감염은 형광현미경(Axio Vert.A1, Carl Zeiss)으로 직접 평가되었습니다.
X-gal 조직화학을 사용하여 HEK-293 세포주에서 pSV-β-Gal 플라스미드 발현을 수정하여 β-갈락토시다제 활성을 평가했습니다. 이 방법론에서 형질감염된 세포는 파란색으로 변했습니다. 시험관 내 pDNA 나노복합체 기능화는 동일한 배양 조건에서 2 시간 동안 배양하면서 위에서 설명한 대로 수행되었습니다. 그 후, 500㎕의 완전한 DMEM을 첨가하여 24시간 동안 배양하고, 배지를 교체하고 추가로 24시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 제거한 후 웰을 50㎕ 멸균 인산완충식염수(PBS)로 1회 2회 세척한 다음, 세포를 2% 포름알데히드 및 0.2% 글루타르알데히드 혼합물로 5분 동안 고정시켰다. 그 후, 50 μl PBS 1x로 두 번 세척했습니다. 50μl PBS 1x로 2회 세척하기 전에 고정제를 제거한 다음 희석된 0.4mg/ml X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, Sigma-Aldrich)의 혼합물로 세척했습니다. PBS 1X의 5 mM 칼륨 페로시안화염(Meyer) 및 염화마그네슘 2 mM(Meyer) 중. 그런 다음, 세포를 실온에서 24시간 동안 배양하였다. β-갈락토시다제 발현은 명시야 현미경(AE2000, Motic)에 의해 관찰되었으며, 웰당 5개 필드를 × 40 대물렌즈로 사용하여 형질감염된 세포가 파란색으로 변할 것으로 예상했습니다. 형질감염 효율은 필드당 총 세포에 대해 β-갈락토시다제 발현(파란색으로 바뀜)이 있는 세포를 비교하여 평가되었습니다. LipofectAMINE TM 2000(30 μl)은 모든 테스트에서 양성 대조군으로 사용되었습니다.
세포 계대 후 24시간 후에 미세배양물을 사용하였다. 배양 배지를 제거하고 40㎕의 복합 용액을 첨가하기 전에 세포를 PBS 1x로 세척하였다. 그 후, 세포를 37 °C, 5% CO2에서 2시간 동안 배양했습니다. - 포함하는 분위기. 염료 배제를 위해 복합 용액을 50㎕ PBS 1x로 세포에서 세척하고 20㎕ Trypan blue(PBS 1x에서 0.2%)를 통합했습니다. 이 마지막 혼합물을 사용하여 세포를 37 °C 및 5% CO2에서 10분 동안 배양했습니다. - 포함하는 분위기. 이 마지막 인큐베이션 후, 염료를 웰에서 제거하고 50 μl PBS 1x로 2회 세척하여 세척했습니다. 세포는 필드당 총 세포에 대해 파란색으로 염색된 세포(죽었거나 손상된)를 계산하는 명시야 현미경으로 관찰되었습니다. 세포 생존력 테스트는 0.1 mM에서 3 mM, CO-AuNPs 및 Acyl-CO3 mM에서 물에 대한 다양한 복합 농도에 대해 얻었습니다. 0.5 mM에서 COS@3-AuNP 및 COS@4-AuNP; COS@1-AuNP 및 COS@2-AuNP의 경우 최저 농도(0.1 mM)입니다.
소프트웨어 이미지 J (오픈 소스 소프트웨어 (OSS ) 라이센스 ) 플러그인 Nuclei-ICTN 계산을 위한 이미지 기반 도구와 함께 transfection 및 생존력 테스트를 위해 세포를 계산하는 데 사용되었습니다.
이번 연구에서 합성된 세 종류의 복합체 중 COS@n-AuNP는 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride)나 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)와 같은 독성 시약을 사용하지 않고 합성되었기 때문에 특별한 주의가 필요하다. 키토산은 반응 시간, 온도, 키토산 탈아세틸화 정도 및 분자량 등 여러 요인에 따라 원하는 크기와 모양으로 AuNP 복합체를 합성하기 위한 환원제 및 안정화제 및 최적 농도로 적합하다고 보고되었습니다[38 , 40]. 이러한 고려 하에 키토산 분자량은 HAuCl4을 취하여 4개의 COS@n-AuNP 합성에 대해 5 kDa로 일정하게 유지되었습니다. ∙3H2 농도가 다른 O 및 키토산 용액.
그림 3은 이 작업에서 합성된 AuNPs-키토산 나노복합체의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 보여줍니다. 플라스몬 밴드는 키토산(CO-AuNPs)의 경우 534 nm, 아실화 키토산(Acyl-CO-AuNPs)의 경우 507 nm, 533 nm(COS@1-AuNPs)의 다양한 키토산 올리고당(COS@1-AuNPs), 53 -AuNPs), 535 nm(COS@3-AuNPs) 및 536 nm(COS@4-AuNPs)는 금 나노 입자의 존재를 확인합니다. 이 그림의 삽입은 착색이 나노입자의 농도, 크기, 모양 및 표면 기능화에 따라 달라지는 얻은 나노복합체의 사진을 보여줍니다.
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나노복합체에 대한 UV-Vis 스펙트럼. 삽입된 값은 국부적인 표면 플라즈몬 공명의 최대 파장에 해당합니다. 이 최대값은 다음과 같습니다. 534 nm에서 CO-AuNP(0.1 M NaBH4 ) (a ), 507 nm에서 Acyl-CO-AuNP의 경우(b ), COS-@n-AuNP 키토산 올리고당의 경우 533, 530, 535, 536 nm에서 각각 1-4개의 서로 다른 두께의 나노복합체 제제(c )
그림 4는 새로 합성된 나노복합체의 UV-Vis 흡수 스펙트럼과 합성 후 150일 간의 비교를 보여줍니다. 관찰할 수 있는 바와 같이, 각 경우에 대한 2개의 스펙트럼은 본질적으로 동일하게 유지되며 최대 공명 대역이 크게 이동하지 않으며 추가 피크의 증거도 없습니다. 이러한 결과는 얻어진 나노복합체의 높은 안정성을 정성적으로 시사한다.
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합성 후 150 일에 얻은 UV-Vis 흡수 스펙트럼에 의한 금 나노입자 나노복합체의 안정성:화학적으로 합성된 CO-AuNPs(a ) 및 Acyl-CO-AuNP(b ) 및 COS@2-AuNP(c)에 대한 녹색/원 포트 합성 )
세 가지 다른 키토산 샘플에 대한 적외선 분광법이 그림 5에 나와 있습니다. 이 기술은 화학 구조의 특성인 적외선(IR) 영역 내부의 흡수 밴드와 IR을 비교하여 아실화된 키토산을 식별하는 데 사용되었습니다. 데이터 베이스. 몇 가지 특징적인 IR 밴드를 지적할 가치가 있습니다. 키토산(50–190 kDa, 75% 탈아세틸화 정도) 밴드 1656 cm −1 , 1593 cm −1 및 1373 cm −1 아미드 그룹(각각 아미드 I, II 및 III)에 해당합니다. 2895 cm −1 의 밴드 C-H 결합에 해당하며 3200–3500 cm −1 사이의 결합 N-H 및 O-H 결합에. 아실화 키토산의 경우 1651 cm -1 에서 IR 밴드를 얻었습니다. , 1591 cm −1 및 1369 cm −1 아미드 그룹(각각 아미드 I, II 및 III) 및 3200–3500 cm -1 내부에 해당 N-H 및 O-H 결합에 해당합니다. IR 분광법 데이터 [7]에 따라 키토산 아실화가 확인되었습니다. 1591 cm -1 의 밴드 아실화 키토산에 더 많은 수의 2차 아미드로 인해 천연 키토산에 비해 아실화 키토산의 경우 더 낮았습니다. 3200–3500 cm −1 내부 밴드 , 천연 키토산의 N-H 및 O-H 진동 특성은 1차 아미드 환원으로 인해 아실화 키토산 및 키토산 올리고당에서 사라집니다.
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키토산, 아실-키토산 및 키토산 올리고당의 FT-IR 스펙트럼. 1591 cm −1 의 밴드 2차 아미드에 해당하며; 3200–3500 cm −11 영역은 N-H 및 O-H 진동에 해당합니다.
Bahadur et. 알. [6], 다음 식에 의해:
$$ \% DS=\left(\left(\frac{A_{1651}}{A_{3350}}\right)-0.25\right)\times 100=75.16781\% $$여기서 A 1651 =1.973965 및 A 3350 =1.977278은 1631 cm −1 에서 아실화 키토산의 흡광도(각각 아미드 I 및 OH 진동)에 해당합니다. 및 3350 cm −1 , 각각, 0.25는 유리 아민 그룹에 해당합니다. 75%의 N-아실화도를 얻었다.
ξ-전위 값은 다음과 같이 각 합성물에 대해 얻었습니다(표 2, 열 "ξ-전위"):43.3 mV(CO-AuNPs), 40.2 mV(Acyl-CO-AuNPs), 52.2 mV(COS@1-AuNPs) , 55.3 mV(COS@2-AuNPs), 51.6 mV(COS@3-AuNPs) 및 46.3 mV(COS@4-AuNPs). 모든 나노복합체에 대한 잠재력은 키토산의 아민 그룹으로 인해 양수이며 정전기력에 의해 DNA 복합체 형성을 달성하기 위해 계획되었습니다. 복합체 형성 후, ξ-전위 값의 감소는 DNA의 성공적인 접착을 확인했습니다(표 2, "ξ-전위/DNA" 열).
그림 6은 크기 분포 계산을 위한 나노입자 크기 히스토그램과 함께 각 나노복합재의 대표적인 TEM 현미경 사진을 보여줍니다. 각 나노복합체에 대한 크기 분포는 다음과 같이 얻었습니다. 각 샘플에 대한 3개의 TEM 이미지를 획득하고 Matlab®으로 개발한 집에서 만든 이미지 처리 소프트웨어로 분석했으며 나노입자 수는 Acyl-CO-AuNP의 경우 500개, CO-AuNP의 경우 1000개였습니다. , COS@n-AuNP 시리즈의 경우 100. 각 샘플의 평균 크기는 표 2의 '평균 TEM 직경(nm)' 열에 요약되어 있습니다. 키토산 올리고당으로 합성된 AuNP는 문헌[36, 38, 41, 42, 43]에 보고된 다른 녹색 합성 방법으로 얻은 유사한 것과 비교하여 더 나은 크기 분포로 구형을 생성했다는 점을 지적할 가치가 있습니다.
<사진>
a의 TEM 현미경 사진 4.7 nm 아실화 키토산 AuNP, b 3.5 nm 키토산 AuNPs(0.1 M NaBH4 ), c 7.4 nm 올리고당 키토산 AuNPs(COS@1), d 15.6 nm 올리고당 키토산 AuNP(COS@2), e 10 nm 올리고당 키토산 AuNP(COS@3) 및 f 14 nm 올리고당 키토산 AuNPs(COS@4)
다른 농도의 플라스미드를 취하여 모든 pDNA 복합체와 순수한 DNA의 전기영동도를 수행했습니다. 결과는 그림 7에 나와 있습니다. 그림 7a는 순수 플라스미드와 200 및 300 ng의 플라스미드가 포함된 모든 복합체에 대한 해당 전기영동도를 보여줍니다. 이러한 전기영동도에 대한 나노복합체 샘플의 분포는 다음과 같습니다. 레인 1과 2에서 Acyl-CO-AuNPs(300 및 200 ng), 레인 3에서 CO-AuNPs(300 ng), COS@1-AuNPs(300 및 200 ng) 4 및 5에서, 6 및 7에서 COS@2-AuNP(300 및 200 ng), 8 및 9에서 COS@3-AuNP(300 및 200 ng), 10에서 COS@4-AuNP(300 및 200 ng) 및 11 및 300 ng의 순수 pDNA가 레인 12에 있습니다. 모든 테스트에 대해 10 μl의 복합 용액이 사용되었습니다. 이 그림은 pDNA만 젤에서 이동하고(레인 12에서 분명함) 다른 pDNA 복합체가 해당 웰에 남아 있음을 보여주므로 이러한 방식으로 모든 복합체에 대한 pDNA 부착이 확인됩니다. 이는 금 나노입자 표면에 남아 있는 키토산의 아미노기의 양전하와 DNA 나선의 인산기의 음전하의 상호작용 때문이다.
<그림>
아 200 및 300 ng pDNA 농도의 나노복합체에 대한 전기영동도. 레인 12는 순수한 pDNA에 해당합니다. ㄴ CO-AuNPs 및 Acyl-CO-AuNPs, 300 ng의 pDNA, 레인 3의 순수한 pDNA. c 300 및 350 ng의 DNA, 400 ng의 순수 pDNA가 레인 3에 있는 COS@2-AuNPs 나노복합체. d same CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs at 1:10 dilution, with respectively pure DNA control at lane 3
To evaluate the retention ability of COS@2 complexes, eletropherograms for the corresponding pDNA complex were carried out with the same COS@2 concentration but different pDNA concentrations (300 ng, 350 ng, and 400 ng); the results are shown in Fig. 7b. Lanes 1, 2, and 3 on this figure correspond to plasmid concentration of 300 ng, 350 ng, and 400 ng, respectively; results in lane 1 is in perfect agreement with the corresponding result in Fig. 7a (lane 7) and, both results in lane 2 and 3 of Fig. 7b, indicate that retention power of this complex is below 350 ng of the plasmid.
As it was pointed out before, two different tests were made in order to evaluate pDNA transfection, taking advantage of the X-galactosidase activity of the pSV-β-Gal plasmid and the fluorescence activity for the case of the piRES2-EGFP plasmid. Figure 8 shows the micrographs of transfection test in HEK-293 cells by X-galactosidase activity on pSV-β-Gal; blue cells in this figure (pointed out by arrows) are some of the transfected cells, according to the corresponding methodology. On the other hand, Fig. 9 shows the fluorescence micrographs of transfected HEK-293 cells; this technique was used to evaluate transfection efficiency with pIRES2-EGFP plasmid. For both figures, (a) shows pure cells and (b) shows cells using LipofectAMINE TM 2000 as a positive control. Corresponding transfections rates with each conjugate are shown as follows:(c) CO-AuNP, (d) Acyl-CO-AuNPs, (e) COS@1-AuNPs, (f) COS@2-AuNPs, (g) COS@3-AuNPs, and (h) COS@4-AuNPs. Transfection efficiency percentages obtained with the different complexes were as follows:CO-AuNP 27%, Acyl-CO-AuNP 33%, COS@1-AuNP 48%, COS@2-AuNP 60%, COS@3-AuNP 45%, and COS@4-AuNP 52%. Figure 10 shows the histograms for the transfection percentages obtained with each complex. Transfection efficiency was evaluated by comparing cells presenting pDNA expression against total cells per well. The highest transfection efficiencies were obtained with conjugates from COS@2-AuNP complexes; this can be explained by the highest chitosan/gold ratios used for this green method of synthesis. These results may complement those reported by Köping-Höggård et. 알. [40], which suggests that the use of DNA conjugates with chitosan oligomers of different length affects the stability and transfection efficiency. The present work deserves additional consideration since the transfection efficiencies were improved in this case using low molecular weight chitosan oligosaccharides complexed with gold nanoparticles.
HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pSV-β-Gal). 아 HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells
HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pIRES2-EGFP).a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells
Transfection efficiency percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293-transfected cells
Figure 11 (inset) shows the micrographs for cell viability evaluation. Blue dyed cells (dead or damaged) were compared against total cells per field. The highest cell viability was obtained with COS@1-AuNPs and COS@2-AuNPs, with 93.53% and 93.46%, respectively. It is interesting to note that COS@2-AuNPs also showed the best transfection efficiency. Among COS@n-AuNP series, COS@4-AuNPs showed lower viability (78.23%). As expected, tests with LipofectAMINE TM 2000 and CO-AuNPs presented the lowest viability (61.45% and 77.85% respectively). Finally, viabilities with Acyl-CO and COS@3-AuNPs were 90.75% and 92.08 % respectively.
Cell viability percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293 cells
Chitosan, acylated chitosan, and chitosan oligosaccharide nanocomposites with gold nanoparticles, featuring positive charges, were synthesized. They presented good stability in colloidal solution; this confirms the viable use of chitosan as a stabilizer and chitosan oligosaccharide as both reducing agent and stabilizer, and positive charges by its amino groups improved affinity with plasmid DNA. Size distributions of the synthesized gold nanoparticles were in a range of 3 to 15 nm. Gel electrophoresis and ξ-potential studies showed that plasmid DNA was successfully incorporated to the nanoparticles by interaction with the positive charges from chitosan at the surface of the nanocomposites. The best transfection efficiency, with 93.46% viability, was obtained with the COS@2-AuNP complexes, possibly due to its relatively high chitosan/gold ratio (1.96/0.003); this means larger effective surface for the anchoring of the plasmids by means of the electrostatic interaction of its phosphate groups with the chitosan amine functional groups. The COS@n-AuNP complexes obtained by the green/one-pot synthesis described in this work showed high transfection efficiency, as compared with those obtained with traditional chemical synthesis (CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs), and can be proposed as promising green route-synthesized pDNA vehicles without the inconvenience of using toxic chemical reagents. Moreover, chitosan oligosaccharide as a reducing agent can be considered as a green synthesis method for AuNPs and renders spherical nanoparticles with good size distribution. This kind of safe and non-toxic routes of synthesis for nanocomplexes, like the ones proposed in this work, deserve further research in the search of obtaining more safe plasmid carriers for gene therapy applications.
All datasets on which the conclusions of the manuscript rely are presented in the main paper.
Acylated chitosan
Gold nanoparticles
Chitosan
Chitosan oligosaccharide
Dulbecco’s modified Eagle’s medium
푸리에 변환 적외선
인산염 완충 식염수
Plasmid Deoxyribonucleic acid
투과전자현미경
나노물질
초록 금 나노입자(GNP)는 종양 진단 및 치료를 위한 독소루비신(DOX) 수송 벡터로 항상 사용되어 왔습니다. 그러나 이러한 벡터의 합성 과정은 먼저 화학적 환원법을 통해 GNP를 제조한 다음 DOX 또는 특정 펩타이드와 결합하는 것이므로 이러한 방법은 여러 단계, 높은 비용, 시간 소모, 복잡한 준비 및 후처리. 여기서는 처음으로 DOX의 화학적 구성을 기반으로 DOX-conjugated GNP를 준비하는 1단계 전략을 제시합니다. 또한, 우리는 DOX, RGD 펩타이드 및 핵 국소화 펩타이드(NLS)가 보유하는 환원성 작용기
초록 화학 합성 방법에서 금 나노 입자(GNP)의 크기를 조정하기 위해 복잡하고 엄격한 프로토콜을 따릅니다. 이 연구에서 우리는 화학적 환원 방법에서 GNP의 크기를 조정하기 위한 도구로서 용매의 극성을 다룹니다. 화학적 환원법에 의한 금 나노 입자 합성에 대한 반응 매질의 극성 지수 변화 효과가 조사되었다. 극성 용매로 에탄올, 반응 매질로 에탄올-물 혼합물, 환원제로 L-ascorbic acid, 안정제로 polyvinylpyrrolidone을 사용하여 GNP를 합성했습니다. 반응 매질의 극성 지수는 에탄올 대 물의 부피비를
