키토산, N-아실화 키토산, 키토산 올리고당 기능화 금 나노입자로 유전자 전달 효율 향상

요약

금 나노입자(AuNPs)는 독특한 광학적 특성, 높은 밀도, 쉬운 표면 수정으로 생의학 연구에서 점점 더 사용됩니다. 여기서는 세 가지 키토산 유래 폴리머: 천연 키토산(CO), N-아실화 키토산(Acyl-CO), 키토산 올리고당(COS)과 AuNPs를 결합한 비바이러스 유전자 전달 플랫폼을 제시합니다. 두 합성 경로 탐구: 붕소수소화나트륨 기존 화학적 환원과 COS가 동시에 AuNPs를 환원 및 안정화하는 친환경 원팟 합성. 결과 나노복합체는 UV-Vis 분광법, 제타 전위, FTIR, 투과 전자 현미경(TEM)으로 완전히 특성 분석되었습니다. 아가로스 겔 전기영동으로 플라스미드 DNA(pDNA) 복합화 강건함 확인, HEK-293 세포에서 β-갈락토시다아제 활성과 EGFP 형광으로 형질주입 효율 평가. CO-AuNPs, Acyl-CO-AuNPs, COS-AuNPs로 각각 27%, 33%, 60% 형질주입률 달성으로 독성 환원제 회피하면서 우수한 유전자 전달 성능을 제공하는 친환경 COS 기반 제형의 우월성 입증.

배경

유전자 치료는 치료 유전 물질을 표적 세포로 전달하는 데 의존합니다. 바이러스 벡터가 높은 형질주입 효율을 제공하지만 면역원성, 제한된 탑재량, 생산 복잡성 문제가 있습니다. 비바이러스 캐리어는 더 안전하고 생산이 쉽고 저장 중 더 안정적입니다. 키토산은 키틴에서 유래한 천연 다당류로 양전하, 저독성, DNA 효소적 분해 보호 능력으로 유망한 비바이러스 벡터로 부상했습니다. 그러나 천연 키토산은 생리적 pH에서 용해도가 낮고 희석 산 용액에서 고점도로 생의학 적용을 제한합니다. N-아실화 같은 화학적 수정은 소수성 증가와 탈아세틸화도 조절, 올리고머화(COS)는 점도 감소와 짧은 사슬 길이로 세포 섭취 향상을 제공합니다.

금 나노입자는 조절 가능한 크기, 표면 플라즈몬 공명, 아민, 티올, 시아나이드 기에 대한 강한 친화력으로 다기능 나노캐리어 구축에 이상적입니다. 키토산 같은 양이온 폴리머를 AuNPs에 접목하여 양전하 표면을 생성하면 플라스미드 DNA를 정전기적으로 결합하여 세포 내재화를 촉진합니다. 또한 AuNPs의 높은 밀도는 빠른 세포 섭취를 촉진하고 광학적 특성은 전달 실시간 모니터링을 가능하게 합니다.

이전 연구에서 키토산-AuNP 결합체가 리포좀이나 폴리머 나노입자보다 높은 형질주입 효율을 달성함이 입증되었습니다. 그러나 대부분 합성이 붕소수소화나트륨이나 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 같은 독성 환원제에 의존합니다. 본 연구에서는 유해 화학물질 없이 COS를 환원제와 안정화제로 동시에 사용하는 친환경 합성 경로를 도입하여 나노복합체의 유리한 물리화학적 특성을 보존했습니다.

실험 방법

나노복합체 합성

세 가지 고유 AuNP 제형을 제조했습니다(그림 2). CO-AuNPs와 Acyl-CO-AuNPs는 NaBH₄ 화학적 환원으로, COS-AuNPs는 COS가 Au³⁺를 동시에 환원하고 나노입자를 캡핑하는 친환경 원팟 법으로 합성했습니다.

각 합성 개략도: a-b CO-AuNPs 및 Acyl-CO-AuNPs 화학적 합성; c-f COS-AuNPs 친환경 합성.

재료

염화금(III) 삼수화물(HAuCl₄·3H₂O), 붕소수소화나트륨(NaBH₄), 저분자량 키토산(50-190 kDa, 75% 탈아세틸화), COS(5 kDa)를 Sigma-Aldrich에서 구입. 모든 유리기구는 왕수 24시간 세척 후 Milli-Q 물로 헹궈 금속 흔적 제거.

CO-AuNPs

CO(2 mg mL^-1)를 1% 아세트산에 용해 후 하룻밤 보관. 용액 여과(0.22 µm) 후 10 mM HAuCl₄(1 mL)와 30분 격렬 교반. NaBH₄(100 mM, 0.4 mL) 방울방울 첨가; 색상 노란색에서 와인 레드로 변화하여 나노입자 형성 지시. 2시간 추가 교반.

Acyl-CO-AuNPs

저분자량 키토산 아실화를 카프로일 클로라이드로 변형 프로토콜 따라 수행. 결과 겔 아세톤 침전, 메탄올 세척, 건조. 겔(0.33% in 0.1 M HCl)을 10 mM HAuCl₄(1 mL)과 혼합 1시간 교반. NaBH₄(100 mM, 0.4 mL) 첨가, 분홍-적색 용액이 2시간 교반 내 완전 착색.

COS-AuNPs

친환경 합성으로 COS(100-200 mg)를 HAuCl₄(0.003-0.017 wt%)에 첨가하고 80°C에서 60분 교반. COS 양과 금 농도 차이로 4가지 변형 제조(표 1). 나노입자 원심분리(12,000 g, 30분)로 정제.

특성 분석

FTIR

FTIR 스펙트라(Perkin Elmer Spectrum One)로 아미드 밴드 존재와 Acyl-CO 성공적 아실화 확인. 치환도(DS)는 1651 cm^-1과 3350 cm^-1 흡광도 비율로 75% 계산.

제타 전위

제타 전위 측정(Malvern Nano Z)으로 모든 복합체 양전하 표면(43-55 mV) 확인, DNA 결합 적합성 입증. 복합화 후 값 하락으로 플라스미드 흡착 성공 확인.

UV-Vis

UV-Vis 스펙트라(400-700 nm)로 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR) 피크: CO-AuNPs 534 nm, Acyl-CO-AuNPs 507 nm, COS-AuNPs 533-536 nm. 150일 후 스펙트라 무변화로 콜로이드 안정성 입증.

TEM

TEM 이미지(JEOL JEM-1010)로 3-15 nm 직경 구형 나노입자 확인. COS-AuNPs 크기 분포가 더 좁아 우수한 단분산성 반영.

복합체 형성 및 DNA 결합

플라스미드 pSV-β-Gal(6.82 kb)과 pIRES2-EGFP(5.3 kb) 알칼리 용해로 정제. DNA(200-400 ng) 각 나노복합체와 DMEM 혼합, 아가로스 겔 전기영동(0.8% 아가로스, 90 V, 60분)으로 모든 나노복합체에서 웰 내 완전 DNA 잔류 확인, 정전기적 복합화 입증.

세포 형질주입

세포 배양

HEK-293 세포 96-웰 플레이트 웰당 12,000 세포 씨딩, 24시간 후 ~90% 컨플루언스 도달.

EGFP 형질주입

복합체(15 µL, 200 ng DNA) 2시간 세포 첨가, 완전 DMEM 48시간 배양. GFP 발현 형광 현미경(Carl Zeiss Axio Vert.A1)으로 정량.

β-갈락토시다아제 형질주입

24시간 인큐베이션 후 세포 고정, X-gal 용액 인큐베이션. 청색 염색(β-갈락토시다아제 활성 지시)을 명시야 현미경(Motic AE2000)으로 관찰. LipofectAMINE™ 2000 양성 대조군.

세포 생존율

트리판 블루 배제(0.2%)로 형질주입 2시간 후 생존율 평가. 농도 범위: CO-AuNPs와 Acyl-CO-AuNPs 0.1-3 mM, COS@3-AuNPs와 COS@4-AuNPs 0.5 mM, COS@1-AuNPs와 COS@2-AuNPs 0.1 mM.

결과 및 논의

나노복합체 합성 및 특성 분석

친환경 COS-AuNPs가 유해 시약 없이 생산되어 완전 생체 적합 합성 경로 실행 가능성 입증. UV-Vis 스펙트라(그림 3)로 AuNP 형성 확인, 모든 제형에서 일관된 LSPR 피크. 150일 안정성 테스트에서 스펙트럴 이동 없어 우수한 콜로이드 견고성 입증.

나노복합체 UV-Vis 스펙트라. LSPR 최대값: CO-AuNPs 534 nm, Acyl-CO-AuNPs 507 nm, COS-AuNPs 533-536 nm.

안정성

150일 후 UV-Vis 스펙트라: CO-AuNPs(a), Acyl-CO-AuNPs(b), COS-AuNPs(c).

FTIR

키토산, Acyl-키토산, COS FT-IR 스펙트라. 주요 밴드: 1651 cm^-1(아미드 I), 1591 cm^-1(아미드 II).

제타 전위

표 2 제타 전위 값: CO-AuNPs 43.3 mV, Acyl-CO-AuNPs 40.2 mV, COS-AuNPs 46.3-55.3 mV. DNA 결합 후 모두 양전하 유지로 복합화 확인.

TEM

TEM 현미경 사진: (a) Acyl-CO-AuNPs 4.7 nm, (b) CO-AuNPs 3.5 nm, (c-f) COS-AuNPs 7.4-15.6 nm.

DNA 복합화

아가로스 겔(그림 7)로 모든 나노복합체에서 완전 DNA 잔류 확인, 자유 플라스미드는 바닥 이동. COS-AuNPs가 가장 강한 결합으로 포화 전 350 ng 플라스미드 잔류.

pDNA 복합체 아가로스 겔 전기영동.

형질주입 효율

HEK-293 세포에서 COS-AuNPs가 최고 형질주입률 달성: β-갈락토시다아제 60%, EGFP 48%. Acyl-CO-AuNPs와 CO-AuNPs는 각각 33%, 27%. COS-AuNPs 우수 성능은 더 높은 키토산/금 비율과 최적 입자 크기 기인.

HEK-293 세포 형질주입 분석.

EGFP 형광 이미징.

형질주입 효율 백분율.

세포 생존율

트리판 블루 배제로 COS-AuNPs 높은 생존율(>90%) 확인, LipofectAMINE™ 2000과 CO-AuNPs는 낮은 생존율(61%, 78%). COS-AuNPs가 높은 형질주입 효율과 최소 세포독성 결합.

세포 생존율 백분율.

결론

기존 및 친환경 경로로 금 나노입자-키토산 결합체 성공적 제작. 독성 시약 없는 COS-AuNPs가 우수한 형질주입 효율(최대 60%)과 뛰어난 세포 적합성(>93%) 나타냄. 좁은 크기 분포와 양전하 표면으로 강건한 플라스미드 결합과 효율적 세포 섭취 가능. 이 결과는 COS-AuNPs를 추가 전임상 개발에 적합한 유망하고 환경 친화적 유전자 전달 플랫폼으로 위치시킵니다.

데이터 및 자료 가용성

본 연구 결론을 뒷받침하는 모든 데이터셋은 본문 내 포함되어 있습니다.

약어

Acyl-CO:

아실화 키토산

AuNPs:

금 나노입자

CO:

키토산

COS:

키토산 올리고당

DMEM:

둘베코 변형 이글 배지

FTIR:

푸리에 변환 적외선

PBS:

인산염 완충 식염수

pDNA:

플라스미드 디옥시리보핵산

TEM:

투과 전자 현미경