이 연구에서는 인간 유방암 세포(MCF-7)의 광역학 요법(PDT)에서 프로토포르피린 IX(Pp IX)의 전달 시스템으로 라미나린 접합체 기반 나노 크기 입자를 제안했습니다. HLDM으로 명명된 헤마틴-라미나린-디티오디프로피온산-MGK는 이중 pH/산화환원에 민감한 양친매성 담체 물질로 소수성 약물을 로딩하여 용해도를 개선하고 생체 적합성을 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 우리는 감광제(Pp IX)와 HLDM을 결합하여 여기에서 Pp IX 로딩 HLDM 미셀이라고 하는 새로운 나노 미셀을 제작했습니다. Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀은 중성수에서 149.3 ± 35 nm 크기였습니다. Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀의 광독성, 시험관 내 PDT 효과, pH 및 산화환원 미세 환경에 대한 이중 감수성은 MCF-7 인간 유방암 세포를 사용하여 다양한 농도에서 조사되었습니다. 광독성 및 활성산소(ROS) 생성에 대한 실험은 미셀이 PDT를 생성하여 특정 파장의 빛으로 암세포를 죽일 수 있음을 입증했습니다. 세포 사멸 실험은 미셀이 핵 손상을 일으킬 수 있음을 나타냅니다. MCF-7 세포의 종양 보유 누드 마우스 모델을 구축하여 미셀의 생체내 PDT 효과를 연구하였다. 생체 내 연구는 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀이 놀라운 항종양 효과를 유도할 수 있음을 보여주었습니다. 유망한 라미나린 기반 나노의약품 플랫폼은 시험관 내 및 생체 내에서 Pp IX의 흡수, 축적 및 PDT 효능을 향상시키는 새로운 약물 전달 시스템 역할을 합니다.
광역학 요법(PDT)[1,2,3]은 광원, 광과민제 및 분자 산소[4]에 의해 영향을 받는 확립된 유형의 요법으로 활성 산소종(ROS) 매개[5,6] 직접적인 치사를 일으킬 수 있습니다. 최소 침습성 [6] 및 낮은 독성 조건에서 조명 영역 내의 암세포에 대한 영향. 이는 DNA 손상을 일으키고[7], 신호 경로를 활성화하여 종양 부위로의 혈액 공급을 차단하는 혈관독성 반응을 촉진하고[8], 면역계에 의한 종양 세포 인식 및 파괴를 유발할 수 있습니다[9]. 궁극적인 효과는 약제내성을 극복하고[10, 11], 선택적 항종양 효과를 유발하여 암세포를 사멸시키는 것입니다.
현재 임상에서는 방사선 요법, 화학 요법, 수술 등의 전통적인 종양 치료법[12]이 널리 사용되지만 이러한 방법은 독성과 부작용이 크며 외상이 크며 위험이 크며 한계가 있고 재발이 쉽다. PDT는 유방암[13,14,15], 간세포[14], 폐암[16], 흑색종[17], 피부[18]암을 포함한 광범위한 암의 치료에 사용되어 국내외 연구자들의 초점이 되고 있습니다. . 경험에 따르면 PDT는 암 전이를 억제하고[21] 선택적이고 적응할 수 있다는 장점이 있기 때문에 다양한 질병 및 종양 치료에서 화학요법[19] 및 수술[20]과 같은 기존 방법을 대체하는 것이 더 나은 선택입니다. 그러나 대부분의 감광제는 종양 부위에 축적이 제한되어 있어 암 치료에 적용이 제한적이었습니다[22].
Protoporphyrin IX(Pp IX)는 진단 및 PDT에 사용할 가능성이 큰 소수성 감광제[23, 24]입니다. Pp IX는 외부 자극(예:레이저 광[25]) 없이도 세포자멸사를 유도할 수 있는 헤마토포르피린 유도체로, 암을 치료하는 새로운 기능을 가질 가능성이 있음을 나타냅니다[26].
따라서 전암성 및 악성 병변에서 Pp IX의 국소 축적은 제공되어야 하는 흥미로운 전략입니다[27]. 형광성이 종양 방향을 위한 편리한 방법을 제공하기 때문입니다[28].
그러나 Pp IX는 용해도가 낮고 수용액에서 응집되기 쉬워 효능이 떨어지는 등 해결해야 할 몇 가지 단점이 있다[29]. 따라서 라미나린[30]은 감광제의 불리한 특성을 개선하기 위해 친수성기 운반체로 사용되는 해양 나노의약품 운반체 생체재료이다. 라미나린은 항종양, 항바이러스 등을 포함한 효과적인 생물학적 활성을 소유하고 있음이 입증되었습니다. 축적된 증거는 [31] 시험관 내 및 생체 내 다양한 유형의 암세포(유방암 및 결장암 세포[32]와 같은)에 대해 우수한 치료 효율을 가지고 있음을 시사합니다.
리포솜 및 미셀과 같은 자극 반응성 고분자 나노 입자는 약물 전달을 더욱 보장하고 부작용을 줄일 수 있습니다. 리포좀[33]은 진단 및 치료 도구로 사용될 수 있으며, 암포테리신 B는 진균 감염을 치료하기 위해 리포좀에 통합될 수 있습니다[34]. 고분자 미셀 나노입자[35]는 스마트 약물 전달[36]입니다. 이중 pH/산화환원 민감성 및 광반응을 갖는 Pp IX-적재된 헤마틴-라미나린-디티오디프로피온산-MGK(HLDM) 미셀은 Pp IX 뿐만 아니라 라미나린 친수성 쉘을 로딩하기 위한 소수성 코어를 포함합니다. 이는 약물 생체 분포, 부작용 및 약물 부하 방출과 같은 감광제의 불리한 특성[37]을 개선하기 위한 가장 중요한 나노 약물 전달 중 하나였습니다[38, 39].
이와 관련하여 우리는 pH[41] 및 산화환원 특성[42]에 반응하는 라미나린을 기반으로 하는 다기능 약물 전달 나노플랫폼[40]을 설계했습니다. 표적 부위에서 Pp IX를 dequenching[43]. 내부 및 외부 자극 반응형 약물 전달은 온도[44], 초음파[45], pH 및 산화환원과 같은 광범위한 관심을 받았습니다. 약물 전달을 제어하기 위해 열반응 시스템이 연구되어 더 나은 약물 전달 가능성을 보여줍니다[46]. 자극 반응 약물 전달 시스템은 지속적인 약물 주문형 방출[47]을 비가역적으로 촉진하고 빠르게 배포합니다.
이 연구에서 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀은 수용액에서의 불안정성 및 응집과 같은 Pp IX의 몇 가지 단점을 극복하기 위해 준비되었습니다[48]. 우리는 HLDM 나노운반체로부터 자가 조립된 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀[49]이 종양 미세 환경에서 축적되어 Pp IX를 방출해야 한다고 가정했습니다[50]. Pp IX는 암 세포 사멸을 유발할 수 있는 종양 세포에 Pp IX가 축적된 후 ROS 생성을 촉진하기 위해 자극되었습니다(그림 1 참조). HLDM 물질의 합성 및 특성화는 이전에 보고된 바와 같이 1H-NMR에 의해 입증되었습니다[51]. 따라서 본 연구에서는 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀의 세포 흡수, 광독성, ROS 생성, 핵 형태학적 관찰 및 생체 내 PDT 효과를 연구했습니다.
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종양 치료를 위해 감광제를 전달하는 데 사용되는 HLDM(라미나린 기반 나노의약품)의 개략도
Laminarin은 Sigma-Aldrich(Shanghai, PR China)에서 구입했습니다. 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 Tianjin Bodi Co. Ltd. l-글루타티온(GSH), Hoechst 33342는 Sigma-Aldrich(Shanghai, PR China)에서 제공했습니다. Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 및 태아 소 혈청(FBS)은 Science Biotechnology Co. Ltd.(Shangdong, Yantai, China)에서 입수했습니다. 반응성 산소종(ROS) 분석 키트는 Beyotime Biotechnology(중국 상하이)에서 제공했습니다. 안녕하세요& E는 Bioworld Technology Co. Ltd.(중국 난징)에서 구입했습니다. Pp IX는 Aladdin Reagent Net(Shanghai, China)에서 공급했습니다. 다른 모든 시약과 용매는 화학 등급이었습니다.
인간 유방암 세포(MCF-7)는 Yantai University(중국 산둥성) 약학부의 분자 약리학 연구소에서 제공했습니다.
14-18g(3-4주) 무게의 암컷 누드 마우스를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.에서 구입했습니다.
HLDM 재료는 이전 보고서[51]에 제시된 방법을 사용하여 합성 및 제공되었습니다. 먼저, 옥살로일 클로라이드를 사용하여 디티오프로피온산을 아실 클로라이드로 활성화하고, 이를 MGK로 아실화하여 HOOC-S-S-MGK를 얻었다. 그 후 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(EDCI)과 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 이용하여 HOOC-S-S-MGK를 활성화시킨 후 40℃에서 라미나린으로 에스테르화 반응을 진행하였다. 마지막으로 EDC/DMAP을 촉매로 사용하여 에스테르화 반응을 통해 HLDM 물질을 합성했습니다. DMSO-D6 및 D2 O는 화합물의 조성을 분석하기 위한 용매로 선택되었습니다. 그리고 1 HLDM 물질에 대한 H-NMR(Advance Bruker 400M; Switzerland Bruker Company, Madison, WI, USA) 스펙트럼, IR 스펙트럼 및 UV-가시광 흡수 스펙트럼(200–700 nm)은 실온에서 테스트 및 결정되었습니다.
Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀은 투석 방법을 통해 이용되었습니다. 간단히 말해서, 소수성 코어는 MGK, 디티오디프로피온산 및 헤마틴으로 구성되며 라미나린 친수성 쉘은 물에서 자가 조립되어 폴리미셀을 형성할 수 있습니다. Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀을 얻기 위해 교반하는 동안 Pp IX를 소수성 코어에 로딩했습니다. HLDM 및 Pp IX를 유기 시약에서 합리적인 시간 동안 교반한 후 90-1 교반기에서 600rpm으로 탈이온수(MWCO 2000 Da)에서 투석하여 용해시킨 후 후속 처리하여 Pp IX-로딩된 HLDM 미셀을 얻었다. 모든 과정은 상온에서 진행되었습니다.
실온에서 Beckman Coulter 입자 분석기(부품 번호:A35878)를 사용하여 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀에 대한 입자 크기 및 제타 전위를 결정했습니다. Pp IX가 장착된 HLDM 미셀의 형태는 H-600 투과 전자 현미경(H-600 TEM; Hitachi, Tokyo, Japan)으로 시각화했습니다. 로딩 능력을 결정하기 위해, Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀을 유기 시약에서 초음파 장치로 파괴했습니다. 미셀에서 유리 Pp IX의 농도는 630 nm에서 UV-가시광선 흡수 스펙트럼으로 측정되었습니다. 포집 효율(EE) 및 약물 로딩 함량(DL)은 공식에 따라 계산되었습니다.
EE(%) =(Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀에서 Pp IX의 중량/전체 Pp IX의 중량) ×100%
DL(%) =(Pp IX가 로딩된 HLDM 마이셀에서 Pp IX의 무게/마이셀의 무게) × 100%
인간 유방암 세포주(MCF-7), 결장암 세포주(CT-26)(그림 5) 및 폐암 세포주(A549)(그림 5)를 사용하여 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀을 결정했습니다. 도립 형광 현미경(AxioVert.A1)에 의해. 이러한 물질이 항종양 효과가 있다는 것은 사전에 널리 입증되었습니다. 그러나 실험은 MCF-7이 다른 두 암세포주보다 더 많이 흡수될 수 있음을 보여주었습니다. 따라서 10% 소태아 혈청이 포함된 DMEM(Hyclone)에서 배양된 MCF-7을 선택하여 5% CO2를 포함하는 습한 분위기에서 37°C에서 치료 효과를 모니터링했습니다. .
유리 Pp IX, Pp IX-로딩된 라미나린-헤마틴(LH) 미셀 또는 Pp IX-로딩된 HLDM 미셀을 포함하는 신선한 배지를 각각 24시간 후에 원래 배지를 대체하기 위해 추가했습니다. 그런 다음 MCF-7 세포를 1시간, 2시간 및 4시간 동안 배양하거나(Pp 1X 농도:20㎍/mL) 또는 4시간 동안 다양한 농도의 Pp 1X:10㎍/mL, 20㎍/mL, 및 위의 대기에서 50 μg/mL. 세포 흡수의 결과를 도립형광현미경(Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokyo, Japan)으로 관찰하여 정성적 분석을 하였다[52].
이 연구에서 Pp IX는 암세포 사멸을 유도하는 항암제일 뿐만 아니라 흡수 위치를 찾기 위한 적색 형광 프로브였습니다. 유리 Pp IX, Pp IX-로딩된 LH 미셀 또는 Pp IX-로딩된 HLDM 미셀을 포함하는 신선한 배지에서 MCF-7 세포를 대기보다 20μg/mL 농도에서 4시간 동안 배양했습니다. 4% paraformaldehyde로 고정한 후 고정액을 Hoechst 33342(10μg/mL)로 교체하여 15분간 핵을 염색하였다. 위치에 대한 결과는 도립 형광 현미경으로 시각화되었습니다.
활성산소종(ROS)에 대한 생성 능력은 ROS 프로브 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하는 형광 현미경을 사용하여 세포 내에서 측정되었습니다. MCF-7을 6-웰 플레이트에 접종하고 인큐베이션했습니다. 24시간 후, 배지를 제거하고 유리 Pp IX 또는 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀(20μg/mL)을 포함하는 새로운 배지로 2시간 동안 교체했습니다. 세포를 DMEM 배지로 세척한 후 30분 동안 조사(630 nm)하였다. 두 번 세척한 후 MCF-7 세포를 DCFH-DA(10 μmol/L)와 함께 위의 분위기에서 30분 동안 배양한 다음 다시 세척한 후 형광 현미경(여기 파장:488 nm, 방출 파장:525 nm)으로 이미지화했습니다. DMEM 배지로.
MCF-7을 96웰 식물에 접종하여 생존력 분석을 위한 다양한 제형의 세포독성을 검출했습니다. 그런 다음 다양한 농도의 유리 Pp IX, Pp IX-로딩된 LH 미셀 또는 Pp IX-로딩된 HLDM 미셀(1, 2, 5 및 10 μg/mL)을 포함하는 새로운 DMEM을 각 웰에 첨가했습니다. 광독성군은 세포를 4시간 동안 배양하여 흡수시킨 후 30분간 더 조사한 후 상온에서 24시간 동안 배양하였다. 한편, 대조군으로 암 조건에서의 세포독성 및 생존력을 분석하기 위해 웰을 설정하였다. 그들은 위의 대기에서 24시간 동안 추가로 접종되었습니다.
20 마이크로리터의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT) 용액(5 mg/mL) 및 180 μL PBS(pH 7.4)를 96-웰에 첨가하였다. 플레이트에 넣고 추가로 3시간 동안 배양합니다. 이어서, 150 μL DMSO를 사용하여 포르마잔 생성물을 용질화하고 490 nm에서 효소 표지 기기(SpectraMax M 5)를 사용하여 흡광도(OD)를 측정하였다. MCF-7 생존력은 다음 공식을 사용하여 표현되었습니다.
생존력 =((OD 샘플-OD 검정)/(OD 대조군-OD 검정))×100%.
OD 샘플의 값은 약물 처리된 세포에 의해 제공된 반면 OD 대조군의 값은 약물이 없는 세포에 의해 제공되었으며 OD 검정 값은 약물이 없는 웰 및 세포에서 얻은 것입니다.
MCF-7 세포주를 24시간 동안 배양한 다음, Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀로 4시간 동안 자극했습니다. 헹구고 고정한 후 세포를 핵형광 프로브로 37 °C에서 20분 동안 염색한 다음 PBS를 사용하여 환경에서 염료를 제거했습니다. 해당 형광 이미지는 형광 현미경을 사용하여 시각화되었습니다.
암컷 누드 마우스는 이후 생체 내에서 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀의 항암 가능성을 조사하는 데 사용되었습니다. MCF-7 세포(1.5 × 10 6 세포/0.1 mL)를 동물 모델로 암컷 누드 마우스의 소에 주사한 후, 에스트로겐을 위관영양법으로 투여하여 종양 성장을 촉진시켰다. 종양의 부피가 약 70-100mm에 도달하면 마우스를 무작위로 5개 그룹으로 나누었습니다. 3 생리 식염수, 유리 Pp IX(5 mg/kg), Pp IX 로딩 HLDM 미셀(유리 Pp IX 등가물의 5 mg/kg), 유리 Pp IX(5 mg/kg) 플러스 광 조사, 및 Pp IX-로딩된 HLDM 미셀(5 mg/kg의 유리 Pp IX 등가물) 및 광 조사. 광 처리 그룹은 주입 후 24시간에 30분 동안 630nm 레이저에 노출되었습니다. 치료 효능은 격일로 5개 처리군의 종양 부피를 모니터링하고 20일 후에 조직병리학적 슬라이드를 분석함으로써 평가되었다. 그리고 2일 간격으로 5개 치료군의 약물 안전성을 평가하기 위해 체중을 측정하였다[53].
이 연구의 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차(n =3). 또한 ANOVA(One-Way Analysis of Variation)를 사용하여 다른 그룹 간의 유의한 차이를 분석했습니다. 차이는 *P < 확률 수준에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 0.05(유의함), **P < 0.01(매우 중요).
1 HLDM 물질에 대한 H-NMR 스펙트럼은 이전 보고서에 나와 있습니다[51]. MGK에 대한 메틸 피크는 약 δ:0.8에서 관찰되었습니다(그림 2h). 1 H-NMR 스펙트럼은 약 δ:2.8에서 흡수 피크를 나타내었으며(그림 2g), 이는 CH2였습니다. 3,3-디티오디프로피온산에서. δ:6.5에서 신호 피크의 출현(그림 2j)은 헤마틴의 존재를 확인했습니다. 양친매성 고분자 물질에서 라미나린의 특징적인 피크는 3~4ppm 사이에서 발견되었으며, 이는 HLDM의 새로운 제품이 성공적으로 합성되었음을 나타냅니다.
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1 HLDM의 H-NMR 스펙트럼
HLDM 물질의 IR 스펙트럼은 이전 보고서에 나와 있습니다[51]. 사진 속 더블피크는 MCK의 연결을 증명했다. 또한, 에스테르 카르보닐기의 특성화된 피크가 IR 스펙트럼에서 관찰되었습니다.
도 3a에서 헤마틴은 자외선 흡수 파장(약 580 nm)을 가졌고, 도 3b에서 Laminarin-Dithiodipropionic acid-MGK는 같은 위치에서 흡수가 없었다. 이를 기반으로 하여 헤마틴의 연결을 확인하기 위해 UV-가시광 흡수 스펙트럼을 수행하였다. 결과는 580 nm에서 특성화된 흡수 파장이 HLDM 재료에서 관찰되었음을 나타냅니다(그림 3c). 헤마틴은 HLDM 재료에 성공적으로 연결되었습니다.
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헤마틴의 UV 가시 흡수 스펙트럼(a ), 라미나린-S-S-MGK(b ) 및 HLDM(c )
Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀의 크기와 제타 전위는 그림 4a, b에 나와 있습니다. 미셀이 암세포에 더 잘 흡수되어 효율성을 높이고 부작용을 줄이는 것으로 나타났습니다(증강 투과성 및 체류 효과, EPR). 도 4c에서 Millipore 멤브레인 필터 후 육안으로 미셀을 볼 수 있었다. 이를 기반으로 Pp IX가로드 된 HLDM 미셀의 사진을 그림 4d와 같이 투과 전자 현미경 (TEM)으로 스캔했습니다. 형태가 불균일한 입자였는데, 이는 초음파 시간이 부족했기 때문이다. 반면, 사진에서는 입자의 덩어리가 관찰되었으며, 아마도 농도가 더 높아졌기 때문일 것입니다(그림 5).
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아 , b Pp IX-로딩된 HLDM 미셀의 크기 및 제타 전위. ㄷ 물에서 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀. d Pp IX가 로드된 HLDM 미셀의 TEM 이미지
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CT-26(왼쪽) 및 A549(오른쪽)에서 유리 Pp IX, Pp IX가 로드된 LH 및 Pp IX가 로드된 HLDM 미셀의 흡수
포획 효율(EE) 및 약물 로딩 함량(DL)은 공식에 의해 계산되었다(표 1). Pp IX가 로드된 HLDM 미셀이 수용액에서 응집할 수 있다고 추측했기 때문에 EE와 DL의 변동이 불안정하다는 것이 많은 실험 후에 발견되었습니다.
본 연구에서는 시간 및 농도 의존성을 조사하기 위해 Pp IX의 형광을 검출하였다. 다이어그램에서 볼 수 있듯이 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀은 MCF-7 세포에 흡수되었으며 시간과 농도에 따라 형광 강도가 증가했습니다. 도 6a에서 3개의 미셀을 비교함으로써, Pp IX-로딩된 HLDM 미셀이 제공된 암세포는 더 많은 형광을 가졌다. 이는 pH/산화환원 모이어티가 종양 미세환경에 반응하는 물질에 연결되었기 때문입니다. free Pp IX를 투여한 암세포는 DMEM의 응집으로 인해 형광이 약했습니다.
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아 유리 Pp IX, Pp IX-로딩된 LH 및 Pp IX-로딩된 HLDM 미셀의 흡수. ㄴ Pp IX가 로드된 HLDM 미셀의 세포 위치
위에서 논의한 것에서 우리는 pH 및 감소 민감성 부분을 포함한 HLDM 물질이 Pp IX의 응집을 개선하고 종양 세포에서 흡수 및 방출을 향상시킬 수 있다는 결론을 안전하게 이끌어낼 수 있습니다.
도 6b에서 보는 바와 같이 핵을 형광염료로 염색한 후 청색형광 외부에 적색형광이 나타나는 현상을 확인할 수 있었다. 우리는 세포 흡수가 세포질과 관련이 있을 수 있다고 추측했기 때문에 Pp IX가 축적되어 종양 세포의 미토콘드리아와 세포질에 국한되었다는 이전 연구에 의해 이 가설이 확인되었습니다[54].
도 7에 도시된 바와 같이, DCFH-DA를 지표로 사용하여 MCF-7 세포의 활성산소종(ROS)을 모니터링하였으며, 이는 형광현미경에서 녹색 형광을 갖는 것으로 관찰되었다. Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀은 빛 아래에서 더 강한 녹색 형광 강도를 갖는 반면 유리 Pp IX는 거의 형광을 나타내지 않았습니다. 우리는 유리 Pp IX가 덩어리져 DMEM에서 자가 소광 효과를 일으킬 수 있다고 추측했습니다. 세 그룹의 녹색 형광은 빛이 없으면 무시할 수 있습니다(예:대조군). 이러한 결과는 Pp IX가 산소를 자극하여 빛의 조건에서 감광제로서 ROS를 생성할 수 있음을 확인했습니다.
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광 조건에서 활성산소(ROS) 생성
MTT 분석을 사용하여 두 가지 다른 외부 환경에서 인간 유방 MCF-7 암세포로 세포 세포 독성 및 생존력 분석을 수행했습니다. 도 8a에 도시된 바와 같이, 유의한 세포 손상 차이는 어둠 속에서 모든 샘플에서 무시할 수 있을 정도였다. Pp IX 농도가 50μg/mL로 증가했을 때, 우리가 감지한 MCF-7 세포 생존력은 높은 수준으로 유지되었습니다. 이 현상은 세포나 기관에 대한 세포독성이 Pp IX의 농도 증가에 따라 크게 증가하지 않음을 보여주었다.
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아 가벼운 조건에서 유리 Pp IX, Pp IX-로딩된 LH 미셀 또는 Pp IX-로딩된 HLDM 미셀의 MCF-7 세포 생존력. ㄴ 조사 시 유리 Pp IX, Pp IX-로딩된 LH 미셀 또는 Pp IX-로딩된 HLDM 미셀의 상대적 광독성. n =3; *는 P <를 나타냅니다. 0.05
도 8b에 도시된 바와 같이, 5 Pp IX의 μg/mL는 자유 약물과 미셀 그룹에서 유의한 차이를 보였습니다. Pp IX의 농도가 빛 아래에서 증가함에 따라 미셀 그룹에서 세포 또는 기관에 대한 세포독성이 유의하게 증가된 반면, 유리 Pp IX 그룹은 10 μg/mL 농도까지 거의 변화를 나타내지 않았다. 이러한 데이터는 Pp IX가 로딩된 미셀의 광독성 효율이 유리 Pp IX의 광독성 효율보다 분명히 더 높음을 보여주었다. 다시 한번, 실험은 자유 감광제가 축적되어 자기 소광 효과를 일으킬 수 있음을 보여주었습니다. 따라서 우리는 Pp IX가 로드된 HLDM 미셀이 빛 조사로 암세포를 죽일 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있다고 결론지을 수 있습니다.
세포 위치 연구에서 우리는 자신도 모르는 사이에 염색된 핵이 흰색 반점을 보이는 것을 발견했으며 이 현상으로 Pp IX의 농도가 더 분명해졌습니다. 아마도 이것은 핵의 DNA 손상 때문일 것입니다. 도 8에 도시된 바와 같이, 20㎍/mL Pp IX-로딩된 HLDM 미셀은 MCF-7의 상응하는 대조군과 비교하여 DNA 손상을 유발할 수 있다. 농도가 50μg/mL에 도달하면 암세포의 손상이 심각할 것입니다. 핵 형태학적 관찰 연구는 DNA 손상이 Pp IX에 의해 유도된 MCF-7 세포 사멸의 초기 표지자임을 시사했다[26](그림 9).
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Pp IX 처리 후 MCF-7 세포의 DNA 손상
도 10a, b에 나타난 바와 같이, 5개 그룹의 종양 성장을 측정하여 생체내 효능을 평가하였다. 식염수 처리군은 비교적 빠른 속도로 지속적인 성장을 보였다. 유리 Pp IX 및 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀로 처리한 그룹과 식염수 그룹 간에는 유의한 차이가 없었습니다. 이들 데이터는 종양 부피가 방사선 조사 없이 Pp IX에 의해 덜 영향을 받는다는 것을 나타내었다. 한편, 유리 Pp IX + 빛으로 처리된 그룹은 종양 부피에 약간의 변화를 일으켰습니다. 이 현상의 원인은 유리 약물이 생체 내에서 불안정하여 혈액에 쉽게 수집되기 때문입니다. 따라서 종양 조직에 도달하기 전에 제거되었을 수 있습니다. 대조적으로, Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀로 처리된 종양 성장은 도 10a에서 유의하게 억제되었다. 이 현상은 미셀이 특정 파장의 빛을 자극하여 상당한 항종양 효과를 나타냄을 증명하였다. 요약하면, 이 실험은 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀의 항종양 효과가 조명 조건에서 분명히 개선되었음을 보여주었습니다.
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생체 내 항종양 활성 및 안전성 평가. 아 종양 부피는 치료 시간에 따라 변합니다. ㄴ 5개 그룹의 종양 부피:(a ) 생리 식염수, (b ) 유리 Pp IX(5 mg/kg), (c ) Pp IX 로딩 HLDM 미셀(5 mg/kg의 유리 Pp IX 등가물), (d ) 유리 Pp IX(5 mg/kg) + 광 조사 및 (e ) Pp IX-로딩된 HLDM 미셀(5 mg/kg의 유리 Pp IX 등가물) 및 광 조사. ㄷ 종양이 있는 누드 마우스의 신체 변화
한편, Pp IX가 로딩된 HLDM 마이셀의 안전성을 평가하기 위해 상대 체중을 측정하였다(도 10c). 모든 그룹에서 명백한 체중 감소 및 무시할 수 있는 변화가 없었으며, 이는 마우스에 대한 이러한 처리의 우수한 생물학적 안전성을 시사합니다.
또한, 조직병리학적 슬라이드는 Fig. 11에서 생리식염수 그룹에서 명확한 핵 다형성을 보였다. hematoxylin과 eosin(H&E)으로 염색된 종양 조직의 병리학적 변화는 5개 그룹에서 유의한 차이를 보였다. 결과는 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀과 자유 Pp IX 그룹에서 약간의 핵 응축을 보여주었습니다. Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀(플러스 라이트) 그룹의 종양 조직은 명백한 핵 손상을 나타냈습니다. 따라서 이러한 결과는 위의 in vivo 효능 및 안전성 평가 결과와 일치한다고 결론지었습니다.
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다양한 제형으로 H&E 종양 염색. 모든 데이터는 평균 ± SD로 보고됩니다. n =3; *는 P <를 나타냅니다. 0.05
지금까지 약물 전달을 위한 다양한 물질이 연구되었습니다[55]. 이전 연구에서 우리는 이중 pH/산화환원 민감성 [56] 해양 다당류 라미나린 접합체를 성공적으로 합성했으며, 이 연구에서는 접합체를 Pp IX의 전달 시스템으로 사용하여 항종양 효과를 달성했습니다. 생체 내 실험은 Pp IX가 로드된 HLDM 미셀이 Pp IX를 암세포에 효과적으로 전달하고 암세포에 대한 ROS 매개 직접적인 치사 효과를 생성할 수 있음을 보여주었습니다. 세포 독성 실험은 미셀이 빛 조사 없이 약간의 세포 독성을 갖는 반면 미셀의 저농도 용액은 특정 조명 내에서 세포 생존에 현저한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 동물 수준에서 Pp IX가 로딩된 HLDM 미셀은 관련 항종양 효과를 생성하기 위해 광독성 효과를 발휘했습니다. Therefore, the activities of Pp IX-loaded HLDM micelles were convincingly certified in vitro and in vivo.
A novel laminarin-based nanomedicine platform to address undesirable characteristics of Pp IX such as instability and astatic distribution was successfully studied in this research. The photosensitivity and phototoxicity of Pp IX-loaded HLDM micelles were detected and evaluated in vitro and in vivo. Nuclear morphological observation of Pp IX showed that the Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively deliver and accumulate Pp IX to cancer cells and cause nuclear damage. The research on phototoxicity and ROS production manifested that Pp IX-loaded HLDM micelles exhibited a relevant PDT effect, exerting anti-tumor activity with a certain wavelength light. Likewise, the in vivo research testified that the Pp IX-loaded HLDM micelles could induce PDT effect under the light condition, which could remarkably enhance the anti-tumor effect of Pp IX. To sum up, the results for in vitro and in vivo studies indicated that Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively produce PDT effect and can be applied in the future in tumor treatment in the next research. This promising laminarin-based nanomedicine platform will have great potential for becoming new drug delivery system [57] to deliver hydrophobic photosensitizer for cancer photodynamic therapy (PDT).
The datasets supporting the conclusions of this article are included within the article.
Hematin-Laminarin-Dithiodipropionic acid-MGK
Laminarin-Hematin
Protoporphyrin IX
Photodynamic therapy
활성 산소 종
나노물질
초록 빠르고 통제할 수 없는 세포 성장이 합병증과 조직 기능 장애를 일으키는 질병인 암의 유병률 증가는 과학자와 의사의 심각하고 긴장된 우려 중 하나입니다. 오늘날 암 진단과 특히 그 효과적인 치료는 지난 세기 건강과 의학의 가장 큰 과제 중 하나로 여겨져 왔습니다. 약물 발견 및 전달의 상당한 발전에도 불구하고 일반적으로 건강한 조직 및 기관에 손상을 일으키는 많은 부작용과 부적절한 특이성 및 민감도가 약물 사용에 큰 장벽이 되어 왔습니다. 이들 치료제의 투여 기간과 양에 대한 제한도 도전적이다. 반면에, 화학 요법 및 방사선
초록 기존의 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 인해 비판을 받아왔다. 나노 입자의 돌파구는 전통적인 치료법과 진단을 업그레이드하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 실제로 나노 입자는 기존의 암 진단 및 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단 및 치료를 위한 새로운 관점과 첨단 장치를 만들 수 있습니다. 그러나 나노입자에 대한 연구는 대부분 in vivo 및 in vitro 단계에 머물고 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극히 소수에 불과하다. 이 리뷰에서 우리는 먼저 암 진단 및 치료에
