복부대동맥류(Aabdominal aortic aneurysm, AAA)는 복부대동맥의 하부동맥이 확장된 상태를 말하며 진단을 위해서는 조기발견도구의 규명이 시급하다. 현재 연구에서 IDE(Interdigitated Electrode) 감지 표면을 사용하여 AAA의 형성을 반영하는 miRNA-335-5p를 식별했습니다. 실리카 물질의 균일성은 3D 프로파일로메트리로 관찰되었으며, 화학적으로 변형된 고전도성 표면은 I-V 모드를 통한 검출을 개선했습니다. 표적 miRNA-335-5p는 용량 의존적으로 검출되었고 선형 회귀 및 3σ 분석을 기반으로 하여 비오틴화된 프로브를 사용하여 1 fM의 민감도를 확인했습니다. 비-상보적 및 단일 및 삼중 불일치 서열로부터 표적 서열을 구별함으로써 높은 특이성을 나타내었다. 이러한 출력은 AAA의 중증도를 결정하기 위한 우수한 재현성과 함께 miRNA-335-5p의 고성능 검출을 입증했습니다.
복부 대동맥류(AAA)는 직경이 3 cm 이상인 복부 대동맥으로 정의되는 생명을 위협하는 질병입니다[1, 2]. 이 상태는 동맥경화 또는 플라크 축적으로 발생하며, 이는 복부 대동맥 벽을 약화시키고 풍선과 유사한 외부 팽창을 초래합니다. 시간이 지남에 따라 동맥 벽이 넓어지고 이러한 상황은 정원 호스의 노화와 비슷합니다. 대동맥을 통해 펌핑되는 혈액의 압력으로 인해 이 약해진 부위가 바깥쪽으로 부풀어 오르게 되는데, 이를 동맥류라고 합니다. AAA는 대동맥의 약화 된 부분이 합병증을 유발할 때 형성됩니다 [3,4,5,6]. AAA는 작은 동맥류의 파열로 인한 사망으로 이어질 수 있습니다. 현재 이 질환을 진단하기 위해 신체검사, 컴퓨터 단층촬영 혈관조영술, 자기공명영상촬영, 초음파초음파 등이 이용되고 있다[7,8,9,10]. 그러나 다른 건강 문제를 분석하는 동안 일반적으로 식별되는 AAA에 대한 감지 방법은 없습니다. 이 상황은 AAA의 식별이 지연되어 궁극적으로 불필요한 건강 문제를 야기합니다. 이 문제를 극복하기 위해 연구자들은 조기 탐지 방법을 개발해야 하며 한 가지 잠재적인 전략은 감지 시스템의 개발입니다.
정량적 방식으로 질병을 조기에 신속하고 민감하게 감지하는 것은 임상 진단의 중요한 목표입니다. 현재 바이오센싱 플랫폼은 여러 요구 사항을 충족했으며 적절한 실험실 설정과 교육이 필요합니다. 따라서 대부분의 방법은 이식성이 없으며 이상적인 현장 진단에 필요합니다[11, 12]. 또한 의사의 의사결정을 정확하고 신속하게 지원하기 위해서는 바이오마커 수준의 변화에 대한 분석이 매우 바람직하다. 특정 영역에서 발현되는 순환 바이오마커는 AAA를 진단하고 치료 진행을 추적하기 위해 추가 조사가 필요합니다. 이러한 유형의 순환 바이오마커를 식별하면 질병을 진단하고 치료 후 환자의 후속 조치를 수행하는 데 도움이 됩니다. 이러한 요구를 충족시키기 위해 이 연구에서는 AAA에 적합한 바이오마커의 센서를 생성할 것을 제안합니다. 본 연구에서 제안한 센서(interdigitated electrode)는 다양한 바이오마커로 고성능 분석이 가능하다. 유전체 측정에서 작동하는 교대 갭과 핑거가 있는 유전체 시스템입니다[13,14,15].
바이오마커는 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물, 지질 및 변형된 형태를 포함하는 모든 생체분자일 수 있습니다[16, 17]. 또한 연구자들은 비암호화 RNA와 같은 다양한 바이오마커가 세포 시스템에서 발현되지만 단백질로 번역되지는 않을 것이라고 제안했다[18]. 비암호화 RNA는 일반적으로 단백질로 번역되지 않으며 일반적으로 짧은 서열을 갖는다[18,19,20,21]. microRNA(miRNA), 리보솜 RNA, 전이 RNA, 소형 핵성 RNA, 소형 핵 RNA, 텔로머라제 RNA, snRNA, Xist RNA, 볼트 RNA 및 7SL RNA와 같은 비암호화 RNA의 다른 부류가 보고되었습니다. miRNA는 주로 유전자 발현의 전사 및 전사 후 조절 기능을 하며 종종 유전자 침묵을 초래합니다[22]. 최근 연구자들은 AAA 예측을 위한 miRNA의 중요성을 설명하고 AAA 환자에서 miRNA-335-5p의 발현 감소를 보고했습니다[23]. 임상적 요인과 microRNA의 발현의 조합이 질병의 예측을 획기적으로 향상시키고 정확도를 높인다는 것이 입증되었다[24]. 연구원들은 특히 빠르게 성장하는 AAA를 가진 개인에서 상당히 최소 범위를 나타내는 miRNA-335-5p에 초점을 맞췄습니다[2, 23]. 또한, miRNA-335-5p 수준의 감소는 성장하는 AAA 검출의 신뢰도를 높였습니다. 즉, miR-335-5p의 음의 출력(높은 수준)은 AAA의 심각성을 나타내며 힘든 스크리닝을 최소화합니다. 이 발견은 Wanhainen et al.에 의해 입증되었습니다. [23] miRNA가 AAA를 스크리닝하고 빠르게 성장하는 AAA의 위험을 제거하는 데 유용한 바이오마커임을 밝혔습니다. 현재 연구는 IDE(Interdigitated Electrode) 센서에 의한 miRNA-335-5p 검출을 적용하여 영향을 받는 개인에서 AAA의 중증도를 결정하는 것을 보여줍니다.
스트렙타비딘, 1,1'-카보닐디이미다졸(CDI) 및 인산완충액(PBS)은 미국 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 에탄올아민은 영국 Fisher Scientific에서 구입했습니다. 모든 올리고는 Apical Scientific Sdn에서 상업적으로 합성되었습니다. Bhd., 말레이시아.
처음에 유전체 센서의 패턴은 AutoCAD 소프트웨어를 사용하여 설계되었습니다. 원하는 치수는 길이 7500 μm, 너비 4100 μm, 핑거 갭 쌍 20개, 갭 크기 85 μm, 전극 크기 100 μm, 전극 두께 40 nm, 핑거 길이 4000 μm였습니다. 패턴은 빈 포토마스크에 인쇄되어 크롬 유리 표면에 붙여졌습니다. 이 크롬 유리는 패턴 전사 절차를 위해 UV 노출 시스템에서 고정되었습니다. 알루미늄 박막이 증착된 이산화규소 기판을 크롬 유리와 반대 방향으로 놓고 자외선에 10 초 동안 노출시켰다. 패턴을 전사한 후 레지스트 현상액을 이용한 현상을 진행하였습니다.
표면 전극은 다음과 같이 표면을 제조하기 위한 기존의 마이크로 전자 제조 공정을 통해 생산되었습니다. (i) 기존의 천연 산화물을 사용하여 4인치 웨이퍼를 준비했습니다. (ii) 버퍼 산화물 에칭(BOE) 및 피라냐 용액을 사용하여 웨이퍼를 세척하여 천연 산화물 및 무기 오염물을 제거했습니다. (iii) 2800Å 두께의 산화물 층이 1000 °C의 온도에서 1시간의 습식 열 산화를 통해 성장되었습니다. (iv) 더 나은 핸들링을 위해 산화물 층이 있는 웨이퍼를 4개로 나누었습니다. (v) 금속 층은 전도성 층에 대한 접착 층으로서 l을 사용하여 증착되었다. 알루미늄층(40 nm)은 열증발기 기반의 물리증착법을 통해 길이 3 cm, 직경 0.5 mm로 제작하였다. 90 °C에서 60 초 동안 부드럽게 굽습니다. (viii) 웨이퍼를 크롬 마스크로 정렬하고 10 초 동안 UV 광에 노출시켰다. (ix) 웨이퍼는 노출되지 않은 영역을 제거하기 위해 15 이내의 RD6 현상액으로 헹구어 산화물과 맞물린 전극(IDE) 패턴을 생성했습니다. (x) 웨이퍼를 90 °C에서 120 초 동안 하드 베이크했습니다. (xi) 두 층의 노출된 영역을 제거하기 위해 왕수를 사용하여 웨이퍼를 에칭했습니다. (xii) 표면 패턴을 생성하고, 남아있는 포토레지스트를 아세톤을 사용하여 세척하였다. 그 다음, 전극 사이의 명확한 갭 이미지를 관찰하기 위해 3D 나노프로파일로메트리(Hawk 3D-profilometry, USA) 분석을 수행하였다. 전류 측정(A)은 0.1 V 단계(20 s에서)에서 0 ~ 2 V의 선형 스윕으로 Keithley 6487을 사용하여 수행되었습니다.
표면 화학적 기능화를 위해 실리카 표면을 초기에 1 M 수산화칼륨(pH 9.0)으로 철저히 세척하여 표면을 활성화했습니다. 이 표면은 1 nM 스트렙타비딘(1 h 동안)과 반응하도록 1 h의 배양 기간으로 CDI(0.5 M)에 의해 추가로 수정되었으며, 10 mM 인산염 완충 식염수(PBS, pH 4)에서 원래 스톡에서 희석되었습니다. 이 단계 후, 미반응 공간은 1 M 에탄올아민(1 h 동안)을 사용하여 차단되었습니다. 그런 다음, 4가 streptavidin을 실온에서 1 μM의 biotinylated probe miRNA-335-5p(10 분 동안)와 반응시켰다. 각 수정이 완료되면 달리 명시되지 않는 한 표면을 PBS로 철저히 세척했습니다.
전체 길이 miRNA-335-5p(5'-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCUUCAUUUGCUAUAUUCA-3') 데이터 뱅크에서 수집 코드가 MIMAT0000765입니다. 이 연구에서 목표로 하는 영역은 5'-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3'입니다. 표적 miRNA-335-5p 영역을 포착하기 위해 프로브는 5'-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3'으로 설계되었습니다. 3'-말단에서 비오틴은 감지 표면에 고정된 스트렙타비딘과 상호작용하도록 태그가 지정되었습니다. 전장 miRNA-335-5p의 2차 구조는 온라인 mfold 소프트웨어(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)에 의해 예측되었습니다.
위에서 설명한 대로 비오틴화된 프로브를 스트렙타비딘 표면에 결합하면 표적 miRNA-335-5p 서열이 낮은 펨토몰에서 낮은 나노몰 농도까지 주변 실온에서 상호작용했습니다(10분 동안). 이러한 농도는 PBS에서 10배 연속 희석하여 1 fM에서 1 nM 범위였습니다. 부착물은 낮은 농도에서 높은 농도로 독립적으로 테스트되었으며 이중체 형성 시 표면을 5배 부피의 PBS로 세척하고 측정했습니다.
전기적 특성화는 전압/전류 공급 장치가 있는 Keithley 6487 Picoammeter를 사용하여 I-V 측정에 의해 수행되었습니다. 측정은 맨 표면에서 위에서 언급한 전압에서 기록된 후 각 표면에서 화학적 변형이 뒤따랐습니다. 유사하게, 각 농도에서 프로브와 표적 miRNA-335-5p 간의 상호작용 분석을 위해 10 반응 부피로 세척 단계 후에 측정을 수행하였다. 달리 명시되지 않는 한 모든 수정, 상호 작용 및 측정은 습한 조건에서 유지되었습니다.
현재 연구에서는 서로 맞물린 전극(IDE) 센서에 대한 대화식 분석을 통해 AAA의 심각성을 설명하는 도구로 miRNA-335-5p를 사용했습니다(그림 1). miRNA-335-5p의 전체 길이에서 설계된 프로브와 타겟을 사용한 상호 작용 분석을 위해 기존 포토리소그래피 기술을 사용하여 IDE 표면을 설계하고 제작했습니다. 전류계로 단계별 표면 개질을 수행하고 측정했습니다(그림 2b, c). IDE 제작을 위해 설계된 마스크 정렬과 균일성은 고해상도 3D 나노프로파일로메트리 분석을 통해 확인되었습니다. 이 관찰은 제작과 각 손가락 사이의 거리가 잘 정렬되었음을 확인했습니다(그림 2d). IDE는 ~100 μm의 전극 크기와 ~85 μm의 간격을 가지며 수백만 개의 바이오마커가 직렬/병렬로 삽입된 대규모 네트워크가 형성됩니다. 제작된 IDE의 성공을 보장하기 위해 다른 베어 장치를 사용하여 유전체 시스템에서 재현성을 확인했습니다. 이 시스템은 쌍극자 모멘트에 의해 발생하는 쌍극자 사이의 분자 진동을 측정합니다(그림 2c). 이 유전체 IDE는 다양한 생체 분자 및 화학 분석에 널리 사용되는 널리 인정되는 시스템입니다[15, 25,26,27,28]. 이 연구에서는 모든 표면 화학적 변형과 상호작용 분석을 I-V 전류 모드로 측정했습니다.
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IDE에서 miRNA-335-5p의 검출 표현. 설계된 프로브 및 타겟이 IDE 표면에 이중체 형성과 함께 표시됩니다.
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IDE에서 표면 측정. 아 측정 단계. ㄴ 측정 모드. IDE 패턴과 연결 시스템이 표시됩니다. 유전체 측정도 표시됩니다. ㄷ 측정 중 표면 메커니즘. 쌍극자 모멘트가 표시됩니다. d 제작된 IDE의 3D 프로파일로메트리 프로파일
감지 표면 또는 바이오칩의 고밀도 분자 부착은 중요하며 표면 기능화에 크게 의존하는 것으로 나타났습니다[29, 30]. 이 연구는 유전자 발현, 발견 및 분자 분석에 필수적인 많은 수의 분자 조절에 필요한 적절한 표면을 결정하는 것을 목표로 하고 있습니다. 이러한 잠재적인 응용 분야의 경우 분석 시스템 표면을 생성하려면 분자를 적절한 형식으로 고정하기 위한 적절한 결합이 필요합니다. 이 재료 표면은 저렴하고 다양한 패킹 밀도, 형태 및 두께를 제공하기 때문에 표면 상호 작용 메커니즘을 조사하기 위해 연구되었습니다. 이 발견은 분자의 적절한 부착을 촉진하고 생체 분자 활성의 손실을 방지할 것입니다. 또한, 적절한 2차 구조 확인으로 생체 분자 고정의 올바른 방향이 유지됩니다.
표면에 고밀도 분자를 얻기 위해 우리는 초기에 실리카 표면을 알칼리 용액으로 철저히 세척하고 CDI로 수정했습니다. CDI 표면에서 높은 수준의 비오틴화 프로브를 캡처하기 위해 프로브를 streptavidin으로 고정했습니다. Streptavidin은 비오틴과 결합하는 4개의 부위를 가진 4가 단백질로 생물학에서 고친화성 분자로 간주됩니다[31, 32]. IDE의 표면은 현재 2.08E- 10 A 수준이었고, CDI 부착 후에는 9.2E- 06 A로 증가하였다. 이러한 결과는 CDI에 의해 변형된 IDE의 표면이 우리의 분석에 적합함을 분명히 시사한다. streptavidin이 추가되면 현재 수준이 2.36E- 05 A로 더 증가했습니다.이 전략을 사용하여 IDE 표면에 전체 길이 miRNA-335-5p에서 설계된 더 많은 수의 비오틴화된 프로브를 고정했습니다(그림 3a). IDE 표면의 차단 단계 후에 비오틴 상호작용을 수행하여 미반응 영역을 마스킹했습니다. 각 표면 수정에 따라 전류의 변화가 결정되었습니다(그림 3b). 도 3c에서 보는 바와 같이 에탄올아민을 첨가한 후 전류 변화는 2.53E- 05 A였으며, 1 nM의 바이오틴화 포획 서열을 첨가하였을 때 전류의 수준은 1.29E- 08 A로 감소하였다. 전류는 IDE 감지 표면에서 캡처 프로브의 고정을 확인했습니다. 일반적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 노출된 5-탄산 인산염 백본(프로브)과 함께 더 음전하를 띠는 반면 에탄올아민의 순 전하는 공급자가 언급한 대로 중성입니다. 이러한 전하의 큰 차이는 그림 3c와 같이 측정된 전류의 명백한 변화를 초래했습니다. 또한, 이 매개변수는 표적 가닥과의 이중체 형성 시 다시 복귀되었습니다. 이 발견은 인산염 백본의 노출 감소로 인한 것이며 추가 양전하는 miRNA 가닥의 핵염기에서 유래합니다(그림 4a).
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아 miRNA-335-5p의 예측된 2차 구조. 전체 길이 miRNA-335-5p는 줄기 및 루프 영역과 함께 표시됩니다. 대화형 분석을 위해 선택한 대상 영역이 표시됩니다. ㄴ 표면 화학적 및 생물학적 변형에 대한 IDE의 I-V 측정(검정색 원, 맨손, 빨간색 원, CDI, 진한 파란색 원, 스트렙타비딘, 녹색 원, 에탄올아민). 그림 삽입은 도식적으로 표시됩니다. ㄷ 프로브 부착을 위한 IDE의 I-V 측정. (녹색 원, 에탄올아민, 진한 빨간색 원, 프로브). AAA 컴플리케이션의 이미지는 삽입된 그림으로 표시됩니다.
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프로브와 타겟의 대화형 분석. 아 프로브와 miRNA-335-5p(표적)의 고용량 상호작용. (진한 빨간색 원, 프로브, 검은색 원, 대상). ㄴ miRNA-335-5p의 용량 의존적 분석. 낮은 펨토몰에서 낮은 나노몰 범위까지 테스트. (검정색 원, 프로브, 주황색 원, 1 fM, 파란색 원, 10 fM, 녹색 원, 100 fM, 자주색 원, 1 pM, 분홍색 원, 10 pM, 하늘색 원, 100 pM, 검정 원, 1 nM)
비오틴화된 프로브를 감지 표면에 부착한 후 다양한 용량으로 표적 상호작용 분석을 수행했습니다. 이 검증은 낮은 펨토몰에서 낮은 나노몰 범위까지 수행되었습니다. 이 범위를 보장하기 위해 1 nM의 표적 miRNA-335-5p 서열로 예비 분석을 수행했습니다. 포획 프로브-변형된 표면에 표적 miRNA-335-5p 서열의 1 nM을 추가한 후, 전류 수준은 1.29E- 08 A에서 1.29E- 07 A로 변경되었다(그림 4a). 이 결과는 캡처 프로브와 표적 서열 사이에 혼성화가 발생했음을 나타냅니다. 이 확인 후, 검출 한계를 결정하기 위해 표적 서열을 1 fM에서 1 nM으로 적정했으며, 이는 포획 프로브 수정 표면에 독립적으로 떨어졌습니다. 고정화 전후에 전류 변화가 감지되었습니다. 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM 혼성화에 대한 전류 차이는 각각 2.87, 3.87, 5.04, 6.598, 얻어진 결과에 기초하여, 표적 서열의 시험된 모든 농도에서 명확한 용량 의존적 전류 변화가 검출되었다(그림 4b).
농도 의존적 증가에 따른 위의 결과를 바탕으로 선형회귀분석을 수행하였다. 검출 감도는 3σ 계산을 사용하여 추정되었으며 1 fM으로 떨어졌습니다(그림 5a, b). 농도는 1 fM 미만으로 배경 신호와 더 낮은 값을 나타냅니다. 또한, 비상보 및 단일 및 삼중 불일치 서열로부터 표적 서열을 구별하기 위해 특이성 분석을 수행하였다. 설계된 프로브가 다른 서열보다 완벽한 miRNA-335-5p 상보적 서열과 더 강한 반응을 보이는 것이 명백하였다(도 6a). 단일 불일치 서열은 프로브 서열 상의 단일 불일치 서열에 의한 부분 이중체 형성으로 인해 비상보적 및 삼중 불일치 서열보다 더 높은 전류 응답을 초래하였다. 재현성 분석은 IDE 표면의 모든 화학적 및 생물학적 변형으로 수행되었으며 데이터의 평균을 구했습니다. 평균 데이터는 다른 실험이 수행되었을 때 큰 변화가 없었음을 나타냅니다(그림 6b). 또한 IDE의 성능을 지원하기 위해 현재 사용 가능한 방법의 특성을 비교했습니다(표 1).
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용량 의존성. 아 miRNA-335-5p와 프로브의 용량 의존적 상호작용. ㄴ 다양한 농도의 miRNA-335-5p를 사용한 선형 회귀 분석. LOD는 배경 신호(S/N =3:1)에 대한 분석물의 최저 농도로 간주되었습니다.
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고성능 분석. 아 특이성 분석. 표적 서열은 상보적이지 않은 단일 및 삼중 불일치 서열과 구별되었다. ㄴ 재현성 테스트. 평균값은 3중 실험으로 표시됩니다.
생물학적 바이오마커를 사용한 분석 방법의 개발은 신체 검사 중 AAA 진단에 도움이 됩니다. 현재 연구에서는 miRNA-335-5p가 AAA와 함께 발현되는 것으로 밝혀지면서 AAA의 중증도를 예측하기 위한 miRNA-335-5p 매개 검출이 개발되었습니다. 생성된 IDE 탐지의 출력은 AAA의 심각도 예측을 용이하게 하기 위해 더 낮은 탐지 수준에서 더 높은 탐지 수준으로 표시되었습니다. 더 낮은 검출 수준은 고성능 분석을 위한 높은 특이성과 재현성을 가진 1 fM이었습니다. 본 연구에 사용된 4가 streptavidin-biotin 방법은 좋은 결과를 얻었고 다른 바이오마커 분석에 활용될 수 있습니다.
모든 데이터는 제한 없이 완전히 사용할 수 있습니다.
복부 대동맥류
1,1'-카르보닐디이미다졸
인산염 완충액
맞물린 전극
자외선
나노물질
초록 산화물/금속/산화물(OMO) 레이어 스택은 박막 태양 전지의 전면 접촉으로 투명 전도성 산화물을 대체하는 데 사용됩니다. 이러한 다층 구조는 접점의 전체 두께를 줄일 뿐만 아니라 간섭 효과를 사용하여 셀을 착색하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 금속층에 크게 의존하는 면저항과 기생흡수는 태양전지에서 더 높은 효율을 달성하기 위해 더욱 감소되어야 한다. 이 간행물에서 AgOX Cu(In,Ga)Se2의 성능을 향상시키기 위해 OMO 전극에 습윤층이 적용되었습니다. (CIGS) 박막 태양 전지. AgOX 습윤층은 다층 전극
초록 본 논문에서는 전금속 메타물질 기반의 테라헤르츠(THz) 바이오센서를 이론적으로 조사하고 실험적으로 검증한다. 이 THz 메타물질 바이오센서는 레이저 드릴링 기술을 통해 제조된 스테인리스 스틸 소재를 사용합니다. 시뮬레이션 결과에 따르면 이 메타물질 센서의 최대 굴절률 감도와 성능 지수는 각각 294.95GHz/RIU 및 4.03입니다. 그런 다음 이 바이오센서의 유효성을 평가하기 위한 검출 물질로 소 혈청 알부민을 선택했습니다. 실험 결과에 따르면 감지 감도는 72.81GHz/(ng/mm2 ) 검출 한계는 0.035mg/m
