결장 특이적 약물 전달을 위한 키토산으로 덮인 효소 반응성 중공 메조포러스 실리카 나노플랫폼

결과 및 토론

HMSS–N=N–CS의 준비 및 특성화

HMSS는 이전 작업을 기반으로 약간의 변경을 가하여 작성되었습니다[36]. 첫째, 고체 SiO₂ 나노스피어를 제조하고, CTAB 템플릿을 포함하는 고체 실리카 나노스피어의 표면에 메조포러스 쉘을 코팅하였다. 그럼 나₂ CO₃ 고체 SiO₂를 선택적으로 에칭하는 데 사용되었습니다. mesoporous 쉘은 템플릿 CTAB에 의해 보호되는 동안 nanospheres. 아조 결합에 의해 "게이트키퍼"로 부착된 CS와 함께 HMSS-N=N-CS의 준비는 그림 1a에 설명되어 있습니다. 첫째, HMSS 나노입자의 표면은 APTES를 알킬 커플링 시약으로 사용하여 아미노 기능화된 HMSS(HMSS-NH₂ ) 사후 수정 방법으로. 이어서, HMSS-NH₂의 아미노기 사이의 아미드화 반응에 의해 HMSS-N=N-COOH를 제조하였다. 및 아조벤젠-3,3'-디카르복실산의 카르복실기. 그런 다음, CS는 HMSS-N=N-COOH의 카르복실기와 CS의 아미노기 사이의 아미드화 반응에 의해 HMSS 나노입자 표면에 공유적으로 변형되었습니다.

a의 TEM HMSS 및 b HMSS–N=N–CS

도 1a의 투과전자현미경(TEM) 이미지에 나타난 바와 같이, HMSS의 평균 직경은 280 nm이고, HMSS는 균일한 중공 구조와 고도로 정렬된 메조포러스 쉘을 갖는다. 평균 메조포러스 쉘 두께는 약 90 nm였다. HMSS의 매끄러운 표면과 비교하여 그래프트된 폴리머 HMSS-N=N-CS(그림 1b)의 표면은 거칠어서 CS가 HMSS 캐리어를 덮고 있음을 나타냅니다.

메조포러스 물질의 표면적과 기공 분포는 제어 방출을 위한 호스트 분자를 로딩하고 전달하는 데 중요한 역할을 했습니다. 기공 크기 분포 곡선 및 등온선은 N₂로 측정되었습니다. 흡착 및 탈착 분석(그림 2). 세부 매개변수(Brunauer–Emmett–Teller(BET) 표면적(S) _베팅 ), 총 세공 부피(V _P ) 및 기공 크기 분포(D _P ))는 표 1에 나와 있습니다. S _베팅 및 V _P 순수 HMSS의 810.7 m ² /g 및 0.969 cm ³ /g 및 D _P 약 3.8 nm였다. 디 _P HMSS–NH₂의 아민화 후 HMSS와 거의 동일하여 아미노 기능화 후 메조기공이 차단되지 않았음을 나타냅니다. S _베팅 및 V _P HMSS-N=N-CS의 azo 화합물과 CS 코팅에 의해 변형된 후 현저하게 감소하여 CS가 HMSS의 표면을 코팅했음을 나타냅니다[1].

아 질소 흡착/탈착 등온선 및 b HMSS, HMSS–NH₂의 기공 크기 분포 및 HMSS–N=N–CS

HMSS-N=N-CS의 성공적인 접목은 다양한 방법으로 검증되었다. HMSS–NH₂의 ξ 전위 HMSS의 표면에 아민 그룹이 추가되었기 때문에 그림 3a와 같이 -27.9에서 +31.4 mV까지 다양한 기능화 후 큰 변화를 겪었습니다. HMSS–NH₂ 이후 아조벤젠-3,3'-디카르복실산과 반응하여 HMSS-N=N-COOH를 형성하면, HMSS 표면의 카르복실 그룹 때문에 ξ 전위가 -2.0 mV로 더 감소합니다. CS 폴리머가 HMSS의 표면에 더 그래프트되어 HMSS-N=N-CS를 형성한 후, ξ 전위는 + 32.4 mV로 되돌아갔다. 결과는 HMSS 표면에 아미노가 풍부한 양전하 CS 코팅에 기인합니다[1]. HMSS, HMSS–NH₂의 열중량 분석(TGA) 곡선 , HMSS-N=N-COOH 및 HMSS-N=N-CS 종은 그림 3b에 나와 있습니다. HMSS-N=N-COOH와 비교하여 HMSS-N=N-CS는 CS 체인의 제거로 인해 약 19%의 추가 무게를 잃었습니다. HMSS의 표면에 아조 결합의 그래프팅은 HMSS-N=N-COOH를 준비하는 동안 그림 3b의 삽입된 것과 같이 색상 변화에 의해 확인되었습니다. 반응물 HMSS–NH₂ 아조벤젠-3,3'-디카르복실산이 HMSS의 아미노기와 반응한 후 생성물 HMSS-N=N-COOH가 황갈색인 반면, 생성물 HMSS-N=N-COOH는 흰색이다. 유체역학적 직경(D _H ) 및 HMSS, HMSS–NH₂의 다분산 지수(PDI) 값 및 HMSS-N=N-CS는 그림 3c와 같이 증류수에서 결정되었습니다. HMSS의 직경은 309 nm이고 PDI는 0.190입니다. HMSS의 표면에 아민 그룹을 추가하여 HMSS–NH₂를 형성한 후 , D _H 324 nm로 증가했습니다. HMSS–N=N–CS의 직경은 342 nm로 HMSS–NH₂의 직경보다 컸습니다. 이식된 CS 사슬 때문입니다. HMSS–N=N–CS(0.177)의 PDI는 HMSS–NH₂보다 작았습니다. , 평균 입자 크기는 CS의 그래프팅 후에 훨씬 더 커졌음을 나타냅니다. TEM에서 얻은 직경과 비교하여 DLS로 측정한 HMSS 및 HMSS-N=N-CS의 직경이 더 컸습니다. 디 _H 나노입자의 크기는 수화층이 있는 물 환경에서 측정되었고, TEM에 의해 제공된 나노입자의 크기는 건조 나노입자로부터 얻어졌다[3]. HMSS–NH₂의 FT-IR 스펙트럼 , HMSS-N=N-COOH, HMSS-N=N-CS 및 CS는 그림 4d에 나와 있습니다. HMSN–NH₂의 피크와 비교 , 2853 및 2925 cm ⁻¹ 에서 흡착 피크 증가 − CH₂의 진동에 기인합니다. 카르복시 말단 아조 결합의 그래프팅에서. CS가 HMSS-N=N-COOH의 표면에 첨가된 후, 1660 cm ^-1 에서 흡착 피크의 증가가 있었습니다. 및 3435 cm ⁻¹ , 이는 υ_(C=O) 에 기인합니다. 아미드 밴드에서 그리고 CS에서 NH의 진동. 모든 결과는 HMSS–N=N–CS의 성공적인 준비를 입증했습니다.

아 HMSS의 해당 ξ 전위, HMSS–NH₂ , HMSS-N=N-COOH 및 HMSS-N=N-CS; ㄴ HMSS–NH₂의 TGA 곡선 , HMSS–N=N–COOH 및 HMSS–N=N–CS(삽입:(a ) HMSS–N=N–COOH 및 (b ) HMSS–NH₂ ); ㄷ HMSS, HMSS–NH₂의 크기 분포 , 및 HMSS-N=N-CS 삽입:나노 입자의 해당 PDI 값; 그리고 d HMSS–NH₂의 FT-IR 스펙트럼 , HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS 및 CS

DOX, HMSS–N=N–CS, HMSS–N=N–CS/DOX 및 PM의 XRD 패턴

약물 상태 및 적재 효율성

DOX는 HMSS–N=N–CS의 로딩 및 릴리스 거동을 조사하기 위해 선택되었습니다. HMSS-N=N-CS 나노입자 현탁액의 pH 값을 pH 3.5로 조정했을 때 CS 바이오폴리머는 양전하를 띠게 되었습니다(pK_a CS의 6.3)은 산성 환경에서 양성자화된 아미노 그룹으로 인해 발생했습니다[24]. CS 폴리머는 양전하를 띠고 팽창하여 CS 전하 사이의 반발 상호작용으로 인해 HMSS의 메조기공이 열렸습니다. 따라서 DOX는 확산에 의해 HMSS-N=N-CS의 중간 기공에 접근할 수 있습니다. 그러나, 약물 로딩 혼합물을 7.4로 조정한 후 CS 사슬이 탈양성자화되고 붕괴되어 DOX의 조기 방출을 방해했습니다.

HMSS-N=N-CS/DOX의 LE는 35.2%로 다른 DOX가 포함된 메조포러스 실리카 전달 시스템의 LE보다 훨씬 컸다[3, 16]. HMSS 나노운반체에서 DOX의 높은 LE는 중공 공동, 넓은 표면적 및 약물 저장소로 사용될 수 있는 메조다공성 네트워크에 기인합니다. HMSS-N=N-CS/DOX에서 DOX의 물리적 상태는 XRD(power X-ray diffraction)로 평가되었습니다. XRD 프로파일(그림 4)에서 볼 수 있듯이, 원시 DOX는 특징적이고 강렬한 약물 결정질 회절 피크를 나타냅니다. HMSS-N=N-CS와 DOX의 물리적 혼합물(PM)도 명백한 결정질 회절 피크를 보였다. 그러나 HMSS-N=N-CS/DOX에 의해 뚜렷한 결정성 피크가 나타나지 않았으며, 이는 HMSS-N=N-CS/DOX에서 DOX의 물리적 상태가 HMSS의 메조포러스 구조의 제약으로 인해 비결정성임을 입증했습니다.

모의 결장 환경에서 체외 효소 반응 방출

HMSS-N=N-CS의 효소 반응성 방출을 조사하기 위해 HMSS-N=N-CS/DOX 및 HMSS/DOX 나노입자를 결장 효소 혼합물의 농도가 다른 pH 7.4 PBS에 첨가했습니다. 도 5a에 나타난 바와 같이, HMSS-N=N-CS/DOX는 pH 7.4에서 PBS에서 DOX의 느린 방출을 보였고, 누적 방출 백분율은 24시간 이내에 약 10%에 불과하여 CS의 우수한 캡핑 능력을 나타냅니다. 폴리머 및 아조 결합. 예상대로 pH 7.4에서 PBS에 희석된 효소의 경우 DOX의 누적 방출이 같은 기간 내에 20% 이상으로 향상되었습니다. 또한, 농축된 효소의 존재하에 DOX의 방출량이 거의 40%까지 급격히 증가하였다. HMSS-N=N-CS/DOX로부터의 효소 반응성 방출과 비교하여, HMSS/DOX로부터의 DOX 방출은 농축된 효소의 존재 또는 부재에서 유사한 경향을 가졌다. 상대적으로 낮은 약물 방출 비율은 음전하를 띤 HMSS와 양전하를 띤 DOX 사이의 정전기적 상호작용으로 인한 것입니다[42]. 위의 결과는 HMSS-N=N-CS/DOX에서 DOX의 방출이 결장 지역의 미생물총에서 추출한 효소에 의해 현저하게 가속화됨을 입증했습니다. 효소 반응 방출 메커니즘은 HMSS-N=N-CS의 아조 결합이 효소에 의해 분해되어 HMSS 표면에서 CS가 분리되고 HMSS에서 빠르게 방출된다는 것일 수 있습니다. 아조 결합은 결장 미생물총에 의해 분비되는 효소에 의해 절단되는 것으로 보고되었습니다[34, 35].

아 농축 및 희석 결장 효소 혼합물이 있는 pH 7.4 PBS에서 HMSS/DOX 및 HMSS-N=N-CS/DOX의 누적 방출 프로필; 그리고 b 다양한 pH 값의 방출 매체에서 HMSS–N=N–CS로부터 DOX의 시험관 내 pH 반응 방출 거동

또한 모방 GIT 환경에서 HMSS-N=N-CS/DOX의 효소 반응성 방출을 추가로 평가하기 위해 HMSS-N=N-CS/DOX 나노 플랫폼을 처음에 SGF에 2시간 동안 분산시킨 다음 추가로 분산했습니다. 6 h 동안 SIF하고, 마지막으로, 담체를 1 mg/mL 추출된 효소를 함유하는 pH 7.4 PBS에 첨가하였다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 모의 위액에서 DOX의 방출은 비교적 빠르며, 누적량은 2 h 이내에 15%에 도달하였다. 비교적 빠른 방출은 중성 조건보다 산성 조건에서 HMSS-N=N-CS와 DOX 사이의 상호 작용이 약하기 때문입니다[1]. 그런 다음 DOX의 방출은 SIF에서 2-8 h 동안 느려졌습니다. 그러나 HMSS-N=N-CS/DOX를 pH 7.4 PBS에서 추출된 효소와 함께 배양한 후, DOX의 방출은 계속해서 현저하게 증가하였고, 누적 방출량은 24시간 이내에 50% 이상에 도달하였다. HMSS-N=N-CS/DOX에서 불완전한 DOX 방출은 양전하를 띤 DOX와 음전하를 띤 HMSS 사이의 강한 상호작용 때문입니다.

HMSS–N=N–CS의 단백질 흡착 및 안정성

경구 투여의 경우 나노운반체의 표면 특성은 불가피하게 약물 방출 거동과 생체 흡착에 영향을 미칠 것입니다[43]. 표면의 단백질 흡착 분석은 HMSS 표면에 대한 이식된 CS의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다. 그림 6a에서 볼 수 있듯이, 베어 HMSS 나노캐리어는 최대 16.5%의 극적인 BSA 흡착을 나타냈으며, 이는 HMSS의 넓은 표면적과 중공 공동, 강력한 흡착 능력 및 HMSS와 BSA의 실라놀 그룹 사이의 비특이적 상호작용에 기인합니다. 38, 39]. 또한 HMSS–NH₂ 유사하게 10.2%의 비교적 높은 흡착된 BSA 양을 가졌다. 그럼에도 불구하고 표면에 흡착된 BSA의 비율은 폴리머 CS가 커버로 추가된 후 2.5%로 현저히 감소하여 HMSS-N=N-CS의 생체 내 거동에 대한 영향을 극적으로 감소시켰습니다. HMSS-N=N-CS 및 HMSS 샘플의 안정성을 추가로 관찰하기 위해 20 mg의 HMSS-N=N-CS 및 HMSS를 pH 7.4 PBS 및 탈이온수에 첨가했습니다. As displayed in Fig. 6b, although HMSS–N=N–CS and HMSS were relatively stable in water, HMSS quickly flocculated in pH 7.4 PBS. By contrast, the dispersity of HMSS–N=N–CS was obviously enhanced after the polymer CS was grafted onto the surfaces of HMSS. Additionally, HMSS–N=N–CS carriers can remain stable for more than 12 h without precipitation in pH 7.4 PBS. These results proved that covering with the hydrophilic CS polymer could improve the dispersity and decrease protein adsorption on the surface of HMSS–N=N–CS.

아 BSA adsorbance amounts of HMSS and HMSS–NH₂ and HMSS–N=N–CS (n =3, *p <0.05). ㄴ Photograph images of HMSS–N=N–CS and HMSS dispersed in water and PBS with a concentration of 4 mg/mL

Cellular Uptake

Caco–2 cells, as human epithelial colorectal adenocarcinoma cells, are widely used as model cells in oral drug delivery. As shown in Fig. 7a, Caco–2 cells incubated with free DOX showed a relatively strong fluorescence signal resulting from DOX because positively charged DOX could enter the cell and then the nucleus. Compared with the free DOX group, the HMSS–N=N–CS/DOX group showed a weaker fluorescence signal intensity due to incomplete drug release from HMSS–N=N–CS/DOX. However, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, it showed a markedly increased fluorescence signal. This was attributed to the azo bonds being cleaved by the enzyme mixture, which led to the removal of the CS from the surfaces of HMSS, thus significantly accelerating the DOX release from HMSS–N=N–CS/DOX. To quantitatively evaluate the cellular uptake differences for HMSS–N=N–CS/DOX and HMSS–N=N–CS/DOX incubated with extracted enzymes, FCM was used. As shown in Fig. 7b, the mean fluorescence intensity (MFI) for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 124.7, which was weaker than that of the free DOX group, with a p value less than 0.001. Excitingly, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, the MFI markedly increased to 357 and even exceeded that of the free DOX group owing to the accelerated drug release from HMSS–N=N–CS/DOX after the breakage of azo bonds. All these results indicated that the azo bonds in HMSS–N=N–CS/DOX could be cleaved in the presence of colonic enzymes, which led to the shedding of CS from the surface of HMSS and accelerated the DOX release from HMSS.

아 CLSM of Caco-2 cells incubated with different samples. ㄴ The MFI of DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX treated by enzyme measured by FCM in Caco-2 cells (n =3, ***p <0.001)

In Vitro Cell Viability Evaluation

To prove the enzyme-responsive release effect of HMSS–N=N–CS/DOX in simulated colonic conditions, an in vitro cell viability assay was carried out using Caco-2 cells. The classic anticancer drug DOX was used in the cell viability assay. Prior to this assay, different concentrations of blank HMSS and HMSS–N=N–CS were employed to ascertain the biocompatibility of the nanoplatform towards Caco-2 cells and normal NIH-3T3 (mouse embryo fibroblast) cells at various concentrations from 10 to 250 μg/mL by MTT assay [44, 45]. As displayed in Fig. 8a, b, HMSS and HMSS–N=N–CS at different concentrations showed negligible cytotoxicity after incubation with Caco–2 cells or NIH-3T3 cells, and the viability of Caco–2 cells was 87.9% and 88.3% at the high concentration of 100 μg/mL, respectively, which is sufficiently high for clinical applications due to the high drug loading of HMSS. In addition, NIH-3T3 cells incubated with HMSS and HMSS–N=N–CS for 48 h had high cell viability (above 80%) at the relatively high concentration of 100 μg/mL. These results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS are cytocompatible and could be employed for oral delivery.

Effect of HMSS and HMSS–N=N–CS on cell proliferation of a Caco–2 cells and b NIH-3T3 cells for 48 h by MTT assay. ㄷ Cytotoxicity of free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX with enzyme against Caco-2 cells with different concentrations for 48 h

The effect of the DOX-loaded nanocarrier HMSS–N=N–CS/DOX on the viability of Caco–2 cells is displayed in Fig. 8c. Free DOX showed strong and concentration-dependent cytotoxicity towards 4T1 cells, which was attributed to the fact that positively charged free DOX could pass through 4T1 cell membranes easily. IC₅₀ value for the free DOX group was determined to be 10.18 μg/mL using the SPSS Statistics software. Compared with free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX exhibited a higher cell viability at the same DOX concentration owing to the incomplete release of DOX from HMSS–N=N–CS induced by the strong electrostatic interactions between negatively changed HMSS carriers and positively changed DOX. IC₅₀ value for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 32.22 μg/mL, which was much higher than that for free DOX. However, HMSS–N=N–CS/DOX preincubated with concentrated colon enzymes showed an obvious concentration-dependent cytotoxicity, and the IC₅₀ value was calculated to be 9.41 μg/mL, which was much lower than that of HMSS–N=N–CS/DOX. This reason could be ascribed to the colon enzymes degrading the azo bonds in HMSS–N=N–CS, which would lead to the detachment of grafted CS from the surface of HMSS, causing the fast release of DOX from HMSS carriers.

Toxicity Studies

The hazards of using HMSS–N=N–CS are a vital factor to be considered before its clinical applications in the future. H&E staining of gastrointestinal mucosa irritation is essential to evaluate the in vivo biosafety of the delivery system for oral administration (Fig. 9a). Compared to a saline group, both the HMSS and HMSS–N=N–CS groups exhibited no marked histopathological changes or hyperemia after oral administration for a week with an administration dose of 100 mg/kg. No death or unusual behaviors of rats was observed during the experimental process. A decrease in body weight is widely regarded as an important and simple index for in vivo systemic toxicity [46]. As shown in Fig. 9b, the body weights of mice in the HMSS and HMSS–N=N–CS groups increased slightly and were similar to those of the saline group. The above results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS showed good biocompatibility as drug carriers for oral administration.

아 Gastrointestinal mucosa irritation assay after oral administration of HMSS and HMSS–N=N–CS with the dose of 50 mg/kg for 7 days. ㄴ The weight changes of mice after oral administration for a week. Data were means ± SD (n =3)