키토산 캡핑, 효소 반응형 중공 메조포러스 실리카 나노플랫폼을 이용한 표적 대장 약물 전달

초록

분해 가능한 키토산(CS)을 가수분해 가능한 아조 결합(HMSS–N=N–CS)을 통해 중공 메조포러스 실리카 구(HMSS)에 부착하여 효소 반응형 대장 특이적 전달 시스템을 개발했습니다. 독소루비신(DOX)은 HMSS의 중공 공동과 메조포어에 비결정 상태로 캡슐화되었으며, 35.2%라는 높은 약물 적재량을 달성했습니다. 체외 약물 방출 실험에서 HMSS–N=N–CS/DOX가 효소 반응형 약물 방출을 나타냄이 입증되었습니다. 이식된 CS는 HMSS의 생체적합성과 안정성을 높이고 단백질 흡착을 감소시켰습니다. 위장관 점막 자극 시험과 세포 독성 실험 결과, HMSS와 HMSS–N=N–CS 모두 우수한 생체적합성을 보였습니다. 세포 섭취 실험에서 HMSS–N=N–CS/DOX를 대장 효소 혼합물과 사전 배양한 후 DOX의 섭취가 현저히 증가했습니다. 대장 효소와 배양된 HMSS–N=N–CS/DOX는 세포 독성이 증가했으며, 그 IC₅₀ 값은 효소 없이 처리된 그룹보다 3배 낮았습니다. 본 연구는 경구 대장 특이적 약물 전달을 위한 메조포러스 캐리어의 후속 연구 기반을 마련했습니다.

서론

최근 자극 반응형 약물 전달 시스템(DDS)은 표적 병변 조직에서 약물의 효율적 적재와 선택적 방출을 위해 광범위한 주목을 받고 있습니다[1]. 설계된 자극 반응형 시스템은 병변 부위로 전달되어 주문형 약물 방출을 실현함으로써 치료 효과를 개선하고 조기 누출로 인한 부작용을 억제할 수 있습니다. 산화환원 전위[2], pH[1], 효소[3], 온도 및 빛[4, 5] 등 모든 내부 및 외부 자극이 자극 반응형 DDS 설계에 활용되어 왔습니다. 그중에서도 효소는 서로 다른 조직에서 뚜렷한 농도 차이를 보이기 때문에 내부 자극으로서 폭넓은 관심을 받아왔습니다[6].

지난 20년간 2~50 nm 크기의 메조포어를 가진 메조포러스 실리카 구(MSS)는 자극 반응형 약물 캐리어로 자리 잡았습니다[7, 8]. MSS는 매우 큰 기공 부피와 높은 비표면적으로 높은 약물 적재 용량을 가지며, 잘 정렬된 기공 구조, 쉽게 기능화할 수 있는 표면, 우수한 생체적합성을 지닙니다[9]. 또한 메조포러스 쉘 구조와 중공 공동을 가진 중공 메조포러스 실리카 구(HMSS) 나노입자는 중공 구조가 기존 MSS 캐리어보다 더 많은 약물을 효율적으로 보관하여 더 높은 저장 용량을 제공하므로 기존 MSS보다 우수합니다[10, 11]. MSS 기반의 다양한 자극 반응형 나노캐리어가 폴리머[12], 무기 나노입자[13], 덴드리머, 생체고분자[14], 거대고리 화합물 펩타이드[15], 지질[16] 등 다양한 게이트키퍼를 사용하여 약물 분자를 수용하도록 개발되었습니다. 기능성 캡핑을 가진 MSS 기반 수많은 DDS가 다양한 외부 또는 내부 자극에 반응하여 방출을 실현할 수 있지만, 대장 특이적 표적 약물 전달에 활용된 사례는 드뭅니다.

경구 약물 전달은 약물 투여의 가장 선호되고 간편한 방법입니다. 대장 특이적 표적 약물 전달은 크론병, 대장암, 궤양성 대장염 등 대장 질환 치료에 매우 매력적입니다. 그러나 대장 특이적 약물 전달은 위장관(GI) 내 다른 부위보다 수분 함량이 적고 경구 흡수를 위한 표면적이 상대적으로 작다는 등의 어려움이 있습니다[17,18,19]. 또한 경구 DDS는 위의 강산성 환경을 만나게 되는데, 이는 위장관에서 적재된 약물의 분해를 가속화하여 대장 표적 전달 능력을 상실하게 할 수 있습니다[19]. 이러한 이유로 위장관의 거의 중성에 가까운 pH 값(6~7)에서 pH 유발 약물 방출을 실현하고 위장의 강산성 조건을 견디는 여러 pH 의존성 DDS가 설계되었습니다[20,21,22,23]. 그러나 장(pH 6.8)과 대장(pH 7.4) 사이의 산도 차이가 미미하기 때문에, 이러한 pH 반응형 DDS는 대장 특이적 방출을 실현하기 어렵습니다.

키토산(CS)은 β-(1-4)-결합된 글루코사민과 N-아세틸-D-글루코사민 단위로 구성된 양이온성 생분해성 천연 다당류입니다[24]. CS는 생분해성, 생체적합성, 점막부착성, 항균 활성 등 매력적인 특성으로 생물의학 분야에서 큰 주목을 받아왔습니다[25,26,27,28,29]. 복잡한 공정을 거쳐 합성되는 폴리머, 폴리전해질, 초분자와 비교했을 때, CS는 키틴의 철저한 탈아세틸화로 상대적으로 저렴하고 쉽게 얻을 수 있습니다[30,31,32]. 또한 CS가 세포 간 밀착 접합을 열어 약물 흡수를 증가시킬 수 있다는 보고도 있습니다[33]. 따라서 우수한 생체적합성과 HMSS의 메조포어를 덮기에 적합한 크기를 가진 고분자 CS를 캡핑제로 선택했습니다.

본 연구에서는 Scheme 1에 도시된 바와 같이 HMSS 소재 기반의 대장 특이적 효소 반응형 DDS(HMSS–N=N–CS)를 최초로 설계했습니다. 이 시스템에서 HMSS 캐리어는 선택적 에칭 전략으로 제조되었습니다. 고분자 CS가 아조 결합을 통해 HMSS 표면에 부착되어 HMSS의 개구부를 막는 게이트키퍼 역할을 합니다. HMSS와 CS 사이의 아조 결합은 대장 부위의 효소에 의해 절단될 수 있습니다[34, 35], 이로 인해 CS가 HMSS 개구부에서 분리됩니다. DOX를 모델 약물로 사용하여 HMSS 공동에 포접시켰으며, 체외 약물 방출 실험을 통해 대장 효소 존재 하에서 효소 반응형 방출을 평가했습니다. 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)과 유세포분석기(FCM)를 이용해 Caco-2 세포의 세포 섭취를 조사했습니다. 마지막으로 HMSS–N=N–CS/DOX의 Caco-2 세포에 대한 세포 독성을 측정했습니다.

재료 및 방법

재료

테트라에톡시실란(TEOS), N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 염산염(EDC), 키토산(DAC ≥ 95%), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT), 아조벤젠-3,3′-디카복실산, 브로마이드 칼륨(분광급, ≥ 99.5%), N-하이드록시석시나이미드(NHS) 및 DOX는 Aladdin Chemical Inc.(상하이, 중국)에서 구입했습니다. 아조벤젠-3,3′-디카복실산은 Inno-chem Technology Co. Ltd.(베이징, 중국)에서 공급받았습니다. 세포 배양 배지 DMEM, 페니실린-스트렙토마이신, 태아 소 혈청(FBS)은 GIBCO, Invitrogen Co.(칼스배드, 미국)에서 공급받았습니다. 모든 분석 시약은 추가 정제 없이 사용했습니다.

HMSS–N=N–CS 제조

HMSS–NH₂ 제조

HMSS 나노입자는 선택적 에칭법을 기반으로 선행 연구[36]에 따라 제조했습니다. 먼저 변형된 슈토버 법으로 고체 실리카 구를 합성했습니다. 간단히 말해, 6 mL TEOS를 10 mL 탈염수, 74 mL 에탄올, 3 mL 농암모니아수 혼합물에 부었습니다. 이후 혼합물을 실온에서 60분간 교반하여 콜로이드 실리카 현탁액을 얻었습니다. 고체 구를 원심분리, 세척, 건조하여 추가 사용을 위해 보관했습니다. 이후 고체 실리카 구 표면에 메조포러스 실리카 쉘을 코팅했습니다. 고체 실리카 300 mg을 초음파 처리하여 50 mL 탈염수에 분산시켰습니다. 이 실리카 현탁액을 60 mL 에탄올, 450 mg CTAB, 90 mL 물, 1.7 mL 암모니아수 혼합물에 부었습니다. 60분 교반 후 TEOS(0.75 mL)를 첨가했습니다. 이후 6시간 교반 후 나노입자를 원심분리하여 수집하고 40 mL 물에 재분산시켰습니다. 약 1.2 g Na₂CO₃를 현탁액에 넣고 격렬히 교반했습니다. 55°C에서 12시간 유지한 후 HMSS 나노입자 생성물을 수집하고 무수 에탄올로 세척했습니다. HMSS와 APTES 비율을 4:1(m/v)로 하여 80°C 질소 분위기에서 8시간 후개프팅법으로 HMSS–NH₂를 제조했으며, CTAB는 환류법으로 제거했습니다[3].

HMSS–N=N–COOH 제조

아조벤젠-3,3′-디카복실산(50 mg)을 pH 5.8 PBS에 녹였습니다. 이어서 EDC(5 mg/mL)와 NHS(3 mg/mL)를 넣고 30°C에서 1시간 동안 아조벤젠-3,3′-디카복실산을 활성화했습니다. HMSS–NH₂ 15 mg/mL를 함유한 10 mL PBS를 첨가하고 24시간 교반했습니다. 생성된 HMSS–N=N–COOH를 원심분리로 분리하고 에탄올로 세척했습니다.

HMSS–N=N–CS 제조

0.15 g CS와 0.5 mL 초산을 50 mL 물에 녹여 CS 용액을 제조했습니다. HMSS–N=N–COOH 100 mg을 25 mL pH 5.0 PBS에 분산시키고 EDC와 NHS로 0.5시간 활성화했습니다. 이어서 CS 용액(10 mL)을 부어 1일간 지속적으로 교반했습니다. 마지막으로 합성된 HMSS–N=N–CS를 원심분리 및 세척하여 시료를 수집했습니다.

대장 효소 혼합물 추출

대장 미생물 군집은 선행 연구[37]에 따라 채취했습니다. 이후 37°C에서 배양하여 대장 미생물이 분비하는 효소 혼합물을 얻었습니다. 모의 대장 배지 내 효소 혼합물을 0.22-μm 필터로 여과하여 배양액의 모든 세포 잔해를 제거했습니다. 이후 여과액을 동결건조하여 분말 형태의 효소 혼합물을 얻었으며, 후속 연구에 사용했습니다.

약물 적재 과정 및 효소 반응형 방출

DOX 25 mg을 5 mL pH 3.5 HCl 용액에 녹였습니다. HMSS–N=N–CS 100 mg을 DOX 용액에 넣고 실온에서 12시간 교반했습니다. 이후 0.2 M NaOH 용액으로 혼합물의 pH를 7.0으로 조절하고 추가로 12시간 교반했습니다. DOX가 적재된 HMSS–N=N–CS(이하 HMSS–N=N–CS/DOX)를 원심분리 및 세척하여 HMSS–N=N–CS 표면에 흡착된 DOX를 제거했습니다. 각 단계에서 상등액을 수집하여 UV-Vis 분광광도법으로 480 nm에서 DOX 적재 효율(LE)을 측정했습니다. HMSS–N=N–CS에 적재된 DOX 총량은 초기 DOX 첨가량에서 약물 적재 공정 후 미적재 DOX를 빼서 계산했습니다. HMSS/DOX는 초기 캐리어로 HMSS를 사용하여 대조군으로 제조했습니다. DOX의 LE는 다음 공식으로 계산했습니다:

$$ \mathrm{LE}\ \left(\%\right)=\frac{m_A-{m}_B}{m_A-{m}_B+{m}_C} \times 100 $$

여기서 m_A는 첨가된 DOX 질량, m_B는 상등액 내 DOX 질량, m_C는 HMSS–N=N–CS 총 질량입니다.

HMSS–N=N–CS/DOX의 체외 효소 반응형 DOX 방출은 다음과 같이 평가했습니다. HMSS–N=N–CS/DOX와 HMSS/DOX 나노입자 각각 2 mg을 pH 7.4 PBS에 분산시키고 125 rpm으로 진탕 배양했으며, 대장 효소 혼합물 농도를 달리했습니다(0 mg/mL, 0.3 mg/mL, 1 mg/mL). 정해진 시간 간격으로 1 mL 방출 매질을 채취하여 흡광도를 측정했습니다. DOX 방출은 480 nm에서 측정했습니다. HMSS/DOX를 대조군으로 사용했습니다.

BSA 흡착 실험

BSA 흡착량은 선행 연구[38, 39]에 따라 평가했습니다. BSA를 pH 7.4 PBS(0.5 mg/mL)에 녹였습니다. HMSS, HMSS–NH₂, HMSS–N=N–CS 각각 5 mg을 2.5 mL PBS(pH 7.4)에 넣고 동일한 부피의 BSA 용액을 가한 뒤 100 rpm 쉐이커에 놓았습니다. 6시간 후 원심분리로 상등액을 수집했습니다. 마지막으로 쿰마시 브릴리언트 블루 용액으로 염색 후 595 nm에서 BSA 농도를 측정했습니다.

특성 분석

HMSS 나노입자의 메조포러스 네트워크 구조와 형태는 TEM(EM–208S, CSIS, USA)으로 관찰했습니다. 나노입자의 비표면적과 기공 크기 분포는 질소 흡착 분석기(V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, 중국)로 분석했습니다. 제타 전위와 입자 크기는 나노사이저(Nano-z90, Malvern Instruments Ltd., 영국)로 측정했습니다. TGA 분석은 TGA-50 장비(Shimadzu, 교토, 일본)로 질소 분위기에서 승온 속도 10°C/min으로 수행했습니다. 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR) 스펙트럼은 FT-IR 분광계(Bruker Tensor27, 스위스)로 KBr 펠렛법을 사용해 400~4000 cm⁻¹ 범위에서 측정했습니다. 분말 XRD는 Cu-Kα 방사선(λ = 1.5418 Å)을 사용한 지멘스 D5005 X선 회절계(카를스루에, 독일)로 수행했습니다.

세포 배양 및 세포 섭취 실험

Caco-2 세포는 10% FBS, 1% 비필수 아미노산, 1%(v/v) 피루브산 나트륨, 1% 스트렙토마이신이 첨가된 배지에서 배양했습니다. NIH-3T3 세포는 1% 스트렙토마이신과 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 배양했습니다. Caco-2 세포의 나노캐리어 섭취는 FCM과 CLSM으로 특성화했습니다. Caco-2 세포를 24웰 플레이트에 접종했습니다. 하룻밤 배양 후 무료 DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, 대장 효소 혼합물과 사전 배양한 HMSS–N=N–CS/DOX 나노입자(DOX 농도 5 μg/mL 해당)를 각 웰에 첨가했습니다. 2시간 추가 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 충분히 세척했습니다. 세포를 4% 포름알데히드로 고정하고 Hoechst 33258로 염색하여 CLSM으로 관찰했습니다. FCM으로 세포 섭취를 정량 평가했습니다. Caco-2 세포를 6웰 플레이트에 접종하고 24시간 추가 배양했습니다. PBS로 세척 후 Caco-2 세포를 무료 DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, 대장 효소 혼합물과 사전 배양한 HMSS–N=N–CS/DOX 나노입자(DOX 농도 5 μg/mL 해당)와 함께 혈청 없는 DMEM에서 2시간 배양했습니다. 세포를 차가운 PBS로 세척하고 트립신화한 후 0.5 mL PBS에 재현탁했습니다. FACS Canto 유세포분석기(Becton, Dickinson, 미국)로 세포 내 DOX 형광을 측정했습니다.

체외 세포 증식 실험

HMSS와 HMSS–N=N–CS 빈 캐리어의 NIH-3T3 및 Caco-2 세포에 대한 세포 독성은 MTT 분석법[40, 41]으로 검증했습니다. 간단히 말해, Caco-2 세포와 NIH-3T3 세포를 각각 96웰 플레이트에 접종하고 하룻밤 추가 배양했습니다. 기존 배지를 다양한 농도의 나노입자가 포함된 무혈청 배지로 교체했습니다. 2일 배양 후 50 μL MTT 용액(2 mg mL^–1)을 첨가하고 4시간 배양하여 생존 세포를 측정했습니다. MTT 용액을 제거하고 150 μL DMSO를 첨가하여 포르마잔을 용해시켰습니다. 이후 마이크로플레이트 리더(Tecan, 만네도르프, 스위스)로 570 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 무료 DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, 대장 미생물에서 추출한 효소 혼합물과 사전 배양한 HMSS–N=N–CS/DOX의 세포 독성은 해당 DOX 농도(0.1, 1, 5, 10, 20 μg/mL)에서 Caco-2 세포를 이용해 측정했습니다. 배양 시간은 48시간이었으며, 나머지 실험 과정은 위와 동일했습니다.

독성 연구

위장관 점막 자극 시험은 경구 약물 전달의 체내 생체안전성 평가에 필수적입니다. 수컷 Sprague-Dawley 쥐(180 ± 10 g)를 세 그룹으로 무작위 배정했습니다(그룹당 3마리). 쥐에게 생리식염수, HMSS, HMSS–N=N–CS 나노입자를 매일 100 mg/kg 용량으로 투여했습니다. 7일 후 모든 쥐를 희생하고 조직을 수집하여 병리 조직 검사(H&E)를 수행했습니다. HMSS와 HMSS–N=N–CS 나노입자의 생체안전성을 평가하기 위해 BALB/c 쥐(18~20 g)에 격일로 100 mg/kg 경구 투여 후 체중 변화를 기록했습니다. 모든 실험 절차는 치치하르 의과대학 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며 치치하르 의과대학 윤리위원회 승인을 받았습니다.

통계 분석

통계 데이터는 SPSS 소프트웨어를 사용해 양측 Student's t-검정으로 분석했습니다. 본 연구의 오차 막대는 표준편차(SD)입니다. p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했습니다.

결과 및 고찰

HMSS–N=N–CS 제조 및 특성 분석

HMSS는 선행 연구[36]에 따라 약간의 변형을 거쳐 제조했습니다. 먼저 고체 SiO₂ 나노구를 제조하고, CTAB 주형제를 포함한 고체 실리카 나노구 표면에 메조포러스 쉘을 코팅했습니다. 이후 Na₂CO₃를 사용해 고체 SiO₂ 나노구를 선택적으로 에칭하는 동안 메조포러스 쉘은 주형제 CTAB에 의해 보호되었습니다. CS가 아조 결합으로 '게이트키퍼' 역할을 하며 부착된 HMSS–N=N–CS 제조 과정은 Fig. 1a에 나타나 있습니다. 먼저 HMSS 나노입자 표면을 알킬 커플링 시약인 APTES로 후개질하여 아미노 기능화 HMSS(HMSS–NH₂)를 얻었습니다. 이후 HMSS–NH₂의 아미노기와 아조벤젠-3,3′-디카복실산의 카르복실기 간 아미드화 반응으로 HMSS–N=N–COOH를 제조했습니다. 이어서 HMSS–N=N–COOH의 카르복실기와 CS의 아미노기 간 아미드화 반응으로 CS를 HMSS 나노입자 표면에 공유 결합시켰습니다.

Fig. 1a의 투과전자현미경(TEM) 이미지에서 볼 수 있듯 HMSS의 평균 직경은 280 nm이며, 균일한 중공 구조와 고도로 정렬된 메조포러스 쉘을 가집니다. 평균 메조포러스 쉘 두께는 약 90 nm입니다. HMSS의 매끄러운 표면과 달리 이식된 고분자 HMSS–N=N–CS(Fig. 1b)는 표면이 거칠어 CS가 HMSS 캐리어를 덮고 있음을 나타냅니다.

메조포러스 소재의 비표면적과 기공 분포는 게스트 분자의 적재와 제어 방출에 중요한 역할을 합니다. 기공 크기 분포 곡선과 등온선은 N₂ 흡착-탈착 분석(Fig. 2)으로 측정했습니다. 상세 파라미터(BET 비표면적(S_BET), 총 기공 부피(V_P), 기공 크기 분포(D_P))는 표 1에 제시했습니다. 순수 HMSS의 S_BET와 V_P는 각각 810.7 m²/g와 0.969 cm³/g였으며, D_P는 약 3.8 nm였습니다. 아미노 기능화 후 HMSS–NH₂의 D_P는 HMSS와 거의 동일하여 아미노 기능화 후에도 메조포어가 막히지 않았음을 보여줍니다. 아조 화합물 변형과 CS 코팅 후 HMSS–N=N–CS의 S_BET와 V_P가 현저히 감소하여 CS가 HMSS 표면을 코팅했음을 입증했습니다[1].

HMSS–N=N–CS의 성공적인 이식은 다양한 방법으로 검증되었습니다. Fig. 3a에 나타난 바와 같이 HMSS–NH₂의 제타 전위는 기능화 후 -27.9에서 +31.4 mV로 크게 변했는데, 이는 HMSS 표면에 아미노기가 도입되었기 때문입니다. HMSS–NH₂가 아조벤젠-3,3′-디카복실산과 반응하여 HMSS–N=N–COOH를 형성한 후 제타 전위는 표면의 카르복실기 때문에 -2.0 mV로 추가 감소했습니다. CS 고분자가 HMSS 표면에 추가로 이식되어 HMSS–N=N–CS를 형성한 후 제타 전위는 다시 +32.4 mV로 복귀했습니다. 이는 HMSS 표면에 아미노기가 풍부한 양전하성 CS가 코팅되었기 때문입니다[1]. HMSS, HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS의 열중량 분석(TGA) 곡선은 Fig. 3b에 나타냈습니다. HMSS–N=N–COOH에 비해 HMSS–N=N–CS는 약 19%의 추가 중량 손실을 보였으며, 이는 CS 사슬의 제거에 기인합니다. HMSS–N=N–COOH 제조 중 색 변화로 아조 결합의 HMSS 표면 이식도 확인되었습니다(Fig. 3b 인셋). 반응물 HMSS–NH₂는 흰색인 반면, 생성물 HMSS–N=N–COOH는 아조벤젠-3,3′-디카복실산이 HMSS–NH₂의 아미노기와 반응한 후 황갈색이 되었습니다. HMSS, HMSS–NH₂, HMSS–N=N–CS의 수동역학적 직경(D_H)과 분산도 지수(PDI)는 증류수에서 측정했습니다(Fig. 3c). HMSS는 직경 309 nm, PDI 0.190이었습니다. HMSS 표면에 아민기를 도입하여 HMSS–NH₂를 형성한 후 D_H는 324 nm로 증가했습니다. HMSS–N=N–CS의 직경은 342 nm로 HMSS–NH₂보다 컸으며, 이는 이식된 CS 사슬 때문입니다. HMSS–N=N–CS의 PDI(0.177)는 HMSS–NH₂보다 작아 CS 이식 후 평균 입자 크기가 더 균일해졌음을 나타냅니다. TEM으로 얻은 직경과 비교하면 DLS로 측정한 HMSS와 HMSS–N=N–CS의 직경이 더 컸습니다. 나노입자의 D_H는 수화층이 있는 수용액 환경에서 측정되는 반면, TEM으로 제공되는 크기는 건조 상태의 나노입자에서 얻어진 것입니다[3]. HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS, CS의 FT-IR 스펙트럼은 Fig. 4d에 나타냈습니다. HMSN–NH₂의 피크와 비교했을 때 2853과 2925 cm⁻¹에서 흡수 피크 증가는 카르복시 말단 아조 결합 이식 시 -CH₂ 진동에 기인합니다. HMSS–N=N–COOH 표면에 CS를 추가한 후 1660 cm⁻¹과 3435 cm⁻¹에서 흡수 피크 증가가 나타났으며, 이는 각각 아미드 밴드의 υ_(C=O)와 CS의 N-H 진동에 기인합니다. 모든 결과가 HMSS–N=N–CS의 성공적인 제조를 입증합니다.

약물 상태 및 적재 효율

HMSS–N=N–CS의 적재 및 방출 거동을 조사하기 위해 DOX를 선택했습니다. HMSS–N=N–CS 나노입자 현탁액의 pH를 3.5로 조절하면 CS 생고분자의 아미노기가 산성 환경에서 프로톤화되어 양전하를 띠게 됩니다(CS의 pK_a = 6.3)[24]. CS 고분자가 양전하를 띠고 팽창하여 CS 전하 간의 반발력에 의해 HMSS의 메조포어가 열리게 됩니다. 이에 따라 DOX가 확산을 통해 HMSS–N=N–CS의 메조포어로 진입할 수 있습니다. 그러나 약물 적재 혼합물의 pH를 7.4로 조절하면 CS 사슬이 탈프로톤화되어 붕괴되면서 DOX의 조기 방출을 차단합니다.

HMSS–N=N–CS/DOX의 LE는 35.2%로, 다른 DOX 적재 메조포러스 실리카 전달 시스템[3, 16]보다 훨씬 높았습니다. HMSS 나노캐리어의 높은 DOX LE는 중공 공동, 큰 비표면적, 메조포러스 네트워크가 약물 저장소로 활용될 수 있기 때문입니다. HMSS–N=N–CS/DOX 내 DOX의 물리적 상태는 분말 X선 회절(XRD)로 평가했습니다. XRD 프로파일(Fig. 4)에서 원료 DOX는 특징적이고 강한 결정 회절 피크를 보였습니다. HMSS–N=N–CS와 DOX의 물리적 혼합물(PM)도 분명한 결정 회절 피크를 보였습니다. 그러나 HMSS–N=N–CS/DOX는 뚜렷한 결정 피크를 보이지 않아 HMSS의 메조포러스 구조적 제약으로 인해 DOX가 비결정 상태로 존재함을 입증했습니다.

모의 대장 환경에서의 체외 효소 반응형 방출

HMSS–N=N–CS의 효소 반응형 방출을 조사하기 위해 HMSS–N=N–CS/DOX와 HMSS/DOX 나노입자를 다양한 농도의 대장 효소 혼합물이 포함된 pH 7.4 PBS에 첨가했습니다. Fig. 5a에서 볼 수 있듯 HMSS–N=N–CS/DOX는 pH 7.4 PBS에서 DOX의 느린 방출을 보였으며, 24시간 내 누적 방출률은 약 10%에 불과해 CS 고분자와 아조 결합의 우수한 캡핑 능력을 입증했습니다. 예상대로 희석 효소가 포함된 pH 7.4 PBS에서 DOX의 누적 방출은 동일 기간 20% 이상으로 향상되었습니다. 또한 고농도 효소 존재 시 DOX 방출량이 거의 40%로 급격히 증가했습니다. HMSS–N=N–CS/DOX의 효소 반응형 방출과 비교했을 때, HMSS/DOX의 DOX 방출은 고농도 효소 존재 여부와 관계없이 유사한 경향을 보였습니다. 상대적으로 낮은 약물 방출 비율은 음전하 HMSS와 양전하 DOX 사이의 정전기적 상호작용 때문입니다[42]. 위 결과는 HMSS–N=N–CS/DOX에서 DOX 방출이 대장 미생물에서 추출한 효소에 의해 현저히 가속화됨을 입증합니다. 효소 반응형 방출 메커니즘은 HMSS–N=N–CS의 아조 결합이 효소에 의해 분해되어 CS가 HMSS 표면에서 분리되고 HMSS에서 빠르게 방출되기 때문일 수 있습니다. 아조 결합은 대장 미생물이 분비하는 효소에 의해 절단된다는 보고가 있습니다[34, 35].

또한 모의 위장관 환경에서 HMSS–N=N–CS/DOX의 효소 반응형 방출을 추가 평가하기 위해 HMSS–N=N–CS/DOX 나노플랫폼을 처음에 모의 위액(SGF)에서 2시간, 이어서 모의 장액(SIF)에서 6시간 분산시킨 후, 마지막으로 1 mg/mL 추출 효소가 포함된 pH 7.4 PBS에 캐리어를 첨가했습니다. Fig. 5b에서 볼 수 있듯 모의 위액에서 DOX 방출은 상대적으로 빨라 2시간 내 누적량이 15%에 도달했습니다. 이는 산성 조건에서 HMSS–N=N–CS와 DOX 간 상호작용이 중성 조건보다 약하기 때문입니다[1]. 이후 SIF에서 2~8시간 동안 DOX 방출이 느려졌습니다. 그러나 HMSS–N=N–CS/DOX를 추출 효소가 포함된 pH 7.4 PBS에서 배양한 후 DOX 방출이 현저히 지속 증가하여 24시간 내 누적 방출량이 50% 이상에 도달했습니다. HMSS–N=N–CS/DOX에서 불완전한 DOX 방출은 양전하 DOX와 음전하 HMSS 간의 강한 상호작용 때문입니다.

HMSS–N=N–CS의 단백질 흡착 및 안정성

경구 투여 시 나노캐리어의 표면 특성은 필연적으로 약물 방출 거동과 생체 흡착에 영향을 미칩니다[43]. 표면 단백질 흡착 분석을 통해 HMSS 표면에 이식된 CS의 효과를 평가했습니다. Fig. 6a에서 볼 수 있듯 벌거벗은 HMSS 나노캐리어는 최대 16.5%의 극적인 BSA 흡착을 보였으며, 이는 HMSS의 큰 비표면적과 중공 공동, 강한 흡착 능력, HMSS의 실라놀기와 BSA 간의 비특이적 상호작용에 기인합니다[38, 39]. 또한 HMSS–NH₂도 10.2%의 상대적으로 높은 BSA 흡착량을 보였습니다. 그러나 고분자 CS를 커버로 추가한 후 표면 흡착 BSA 비율이 2.5%로 현저히 감소하여 HMSS–N=N–CS의 체내 거동에 미치는 영향을 크게 감소시켰습니다. HMSS–N=N–CS와 HMSS 시료의 안정성을 추가 관찰하기 위해 각각 20 mg을 pH 7.4 PBS와 탈염수에 첨가했습니다. Fig. 6b에서 볼 수 있듯 HMSS–N=N–CS와 HMSS 모두 물에서는 상대적으로 안정적이었으나, HMSS는 pH 7.4 PBS에서 빠르게 응집되었습니다. 반면 HMSS–N=N–CS는 고분자 CS가 HMSS 표면에 이식된 후 분산성이 현저히 향상되었습니다. 또한 HMSS–N=N–CS 캐리어는 pH 7.4 PBS에서 12시간 이상 침전 없이 안정적으로 유지될 수 있습니다. 이 결과는 친수성 CS 고분자 코팅이 HMSS–N=N–CS의 분산성을 개선하고 표면 단백질 흡착을 감소시킬 수 있음을 입증합니다.

세포 섭취

인간 상피 대장암 세포인 Caco-2 세포는 경구 약물 전달에서 모델 세포로 널리 사용됩니다. Fig. 7a에서 볼 수 있듯 무료 DOX로 배양한 Caco-2 세포는 양전하 DOX가 세포에 진입한 후 핵으로 이동하기 때문에 DOX에서 기인한 상대적으로 강한 형광 신호를 보였습니다. 무료 DOX 그룹과 비교했을 때 HMSS–N=N–CS/DOX 그룹은 HMSS–N=N–CS/DOX에서 약물이 불완전하게 방출되어 더 약한 형광 신호 강도를 보였습니다. 그러나 HMSS–N=N–CS/DOX를 대장 효소 혼합물과 1시간 사전 배양한 후 현저히 증가된 형광 신호를 보였습니다. 이는 효소 혼합물에 의해 아조 결합이 절단되어 HMSS 표면에서 CS가 제거되고, 결과적으로 HMSS–N=N–CS/DOX에서 DOX 방출이 현저히 가속화되었기 때문입니다. HMSS–N=N–CS/DOX와 효소 배양 HMSS–N=N–CS/DOX의 세포 섭취 차이를 정량적으로 평가하기 위해 FCM을 사용했습니다. Fig. 7b에서 볼 수 있듯 HMSS–N=N–CS/DOX 그룹의 평균 형광 강도(MFI)는 124.7로 무료 DOX 그룹보다 약했습니다(p < 0.001). 흥미롭게도 HMSS–N=N–CS/DOX를 대장 효소 혼합물과 1시간 사전 배양한 후 MFI가 357로 현저히 증가하여 무료 DOX 그룹을 초과했습니다. 이는 아조 결합 절단 후 HMSS–N=N–CS/DOX에서 약물 방출이 가속화되었기 때문입니다. 이 모든 결과는 HMSS–N=N–CS/DOX의 아조 결합이 대장 효소 존재 하에서 절단되어 HMSS 표면에서 CS가 탈락하고 HMSS에서 DOX 방출이 가속화됨을 나타냅니다.

체외 세포 생존율 평가

모의 대장 조건에서 HMSS–N=N–CS/DOX의 효소 반응형 방출 효과를 입증하기 위해 Caco-2 세포를 이용한 체외 세포 생존율 실험을 수행했습니다. 고전적 항암제 DOX를 세포 생존율 실험에 사용했습니다. 이 실험에 앞서 다양한 농도(10~250 μg/mL)의 빈 HMSS와 HMSS–N=N–CS를 사용하여 Caco-2 세포와 정상 NIH-3T3(쥐 배아 섬유아세포) 세포에 대한 나노플랫폼의 생체적합성을 MTT 분석법[44, 45]으로 확인했습니다. Fig. 8a, b에서 볼 수 있듯 HMSS와 HMSS–N=N–CS는 다양한 농도에서 Caco-2 세포나 NIH-3T3 세포 배양 후 무시할 만한 세포 독성을 보였으며, 100 μg/mL 고농도에서 Caco-2 세포 생존율은 각각 87.9%와 88.3%로 임상 적용에 충분히 높았습니다(높은 HMSS 약물 적재량 덕분). 또한 NIH-3T3 세포를 HMSS와 HMSS–N=N–CS와 48시간 배양한 결과, 상대적으로 높은 농도 100 μg/mL에서 세포 생존율이 80% 이상이었습니다. 이 결과는 HMSS와 HMSS–N=N–CS가 세포적합성을 가지며 경구 전달에 활용될 수 있음을 나타냅니다.

DOX 적재 나노캐리어 HMSS–N=N–CS/DOX가 Caco-2 세포 생존율에 미치는 영향은 Fig. 8c에 나타냈습니다. 무료 DOX는 4T1 세포에 대해 강하고 농도 의존적인 세포 독성을 보였으며, 이는 양전하 무료 DOX가 4T1 세포막을 쉽게 통과하기 때문입니다. 무료 DOX 그룹의 IC₅₀ 값은 SPSS Statistics 소프트웨어로 10.18 μg/mL로 결정되었습니다. 무료 DOX와 비교했을 때 HMSS–N=N–CS/DOX는 같은 DOX 농도에서 더 높은 세포 생존율을 보였는데, 이는 음전하 HMSS 캐리어와 양전하 DOX 간의 강한 정전기적 상호작용으로 인한 DOX의 불완전한 방출 때문입니다. HMSS–N=N–CS/DOX 그룹의 IC₅₀ 값은 32.22 μg/mL로 무료 DOX보다 훨씬 높았습니다. 그러나 고농도 대장 효소와 사전 배양한 HMSS–N=N–CS/DOX는 명백한 농도 의존적 세포 독성을 보였으며, IC₅₀ 값은 9.41 μg/mL로 HMSS–N=N–CS/DOX보다 훨씬 낮았습니다. 이는 대장 효소가 HMSS–N=N–CS의 아조 결합을 분해하여 HMSS 표면에서 이식된 CS가 분리되고, 결과적으로 HMSS 캐리어에서 DOX가 빠르게 방출되기 때문으로 추정됩니다.

독성 연구

HMSS–N=N–CS 사용의 위험성은 향후 임상 적용 전 고려해야 할 중요한 요소입니다. H&E 염색을 통한 위장관 점막 자극 시험은 경구 투여용 전달 시스템의 체내 생체안전성 평가에 필수적입니다(Fig. 9a). 생리식염수 그룹과 비교했을 때, HMSS와 HMSS–N=N–CS 그룹 모두 100 mg/kg 용량으로 1주일 경구 투여 후 뚜렷한 조직병리학적 변화나 충혈을 보이지 않았습니다. 실험 과정에서 쥐의 사망이나 이상 행동은 관찰되지 않았습니다. 체중 감소는 체내 전신 독성의 중요하고 단순한 지표로 널리 간주됩니다[46]. Fig. 9b에서 볼 수 있듯 HMSS와 HMSS–N=N–CS 그룹 쥐의 체중은 생리식염수 그룹과 유사하게 약간 증가했습니다. 위 결과는 HMSS와 HMSS–N=N–CS가 경구 투여용 약물 캐리어로서 우수한 생체적합성을 가짐을 나타냅니다.

결론

요약하자면, 생분해성 CS를 아조 결합을 통해 HMSS 개구부에 게이팅하여 효소 반응형 대장 특이적 약물 전달을 달성했습니다. DOX는 HMSS의 중공 공동과 메조포어에 비결정 상태로 35.2%의 높은 적재 효율로 적재되었습니다. 안정성과 BSA 흡착 결과는 CS 게이트가 HMSS의 생체적합성과 안정성을 높일 수 있음을 보여주었습니다. 체외 방출 결과는 HMSS–N=N–CS/DOX가 대장 효소 존재 하에서 효소 반응형 약물 방출 거동을 보임을 입증했습니다. CLSM 섭취와 FCM 결과는 HMSS–N=N–CS/DOX를 대장 효소 혼합물과 배양한 후 DOX의 세포 섭취가 현저히 증가함을 나타냈습니다. 세포 생존율 결과는 HMSS–N=N–CS/DOX를 대장 효소와 배양한 후 세포 독성이 증가했으며, IC₅₀ 값이 HMSS–N=N–CS/DOX의 32.22 μg/mL에서 배양 후 9.41 μg/mL로 현저히 감소함을 보여주었습니다.