자철광(Fe3 O4 )-금(Au) 코어-쉘 나노입자(NP)는 독특한 자기 및 광학적 특성을 가지고 있습니다. 생물학적 모이어티와 결합될 때 이러한 NP는 약물 전달 및 암 표적화와 같은 생물의학 응용을 위한 새로운 전략을 제공할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학적 부분과 결합된 자기 코어-쉘 NP 시스템의 제어 가능한 세포 흡수를 위한 효과적인 방법을 제시합니다. 구조 단백질인 비멘틴은 식균 작용에 강력한 영향을 미치는 것으로 생화학적으로 확인되었습니다. 또한, 비멘틴은 생물학적 부분이 여러 번 억제되더라도 세포 내로의 외인성 물질 내재화에 영향을 미칩니다. 이 연구에서 우리는 Fe3의 세포 내재화 성능을 보여줍니다. O4 - 생물학적 모이어티의 조합을 사용하여 표면 변형된 Au 코어-쉘 NP. vimentin 태그가 지정된 NP의 광형광은 다중 억제 테스트에서 영향을 받지 않은 상태로 유지되었으며, 이는 NP가 nystatin, dynasore, cytochalasin D 및 Muc1 항체(Ab)의 영향을 최소화했음을 나타냅니다. 결과적으로, 이 결과는 Muc1 Ab가 특정 분자를 표적으로 할 수 있고 특정 세포내이입을 조절할 수 있음을 나타냅니다. 게다가, 우리는 대장암 세포에서 특정 엔도사이토시스를 제어할 가능성을 보여줍니다.
나노 물질은 임상 진단 및 치료를 위한 새로운 길을 열었습니다. 특히 나노입자(NP)는 가장 중요한 도구 중 하나로 바이오센서[1, 2], 진단[3, 4], 표적 약물 전달 시스템[5, 6]과 같은 응용 분야에 사용되어 왔다. 생물 의학 응용 분야의 경우 NP는 일반적으로 코어 재료의 표면을 둘러싸는 유기 재료로 구성됩니다[7,8,9]. 자성 재료, 반도체 재료 또는 기타 유형의 재료로 구성된 코어 재료는 유용한 물리 화학적 특성을 가지며 외부 유기 표면은 NP에 화학적 안정성과 기능을 제공합니다. 생물학적 표적화 시스템에 적용하기 위해서는 물리화학적 특성뿐만 아니라 표적화를 위해 생물학적으로 기능화된 외부 유기 표면도 중요한 매개변수입니다. 기능화를 위한 표적화 모이어티의 예는 표적에 특이적인 항체 또는 리간드입니다. 외부 표면의 생체 기능화 물질에 따라 NP의 세포 내이입 메커니즘이 결정됩니다. 나노입자가 세포에 들어갈 수 있도록 하는 메커니즘은 나노의학 응용 분야에서 나노입자의 중요성 때문에 많은 최근 연구의 주제였습니다[10,11,12,13,14,15].
특히, 자기 나노입자는 세포 분류[16, 17], MRI[18], DNA 분리[19], 약물 전달[20], 온열 요법[21], 암을 포함한 많은 특정 부위 표적화 응용 분야에서 널리 사용되었습니다. 타겟팅 [22]. 다양한 자성 나노입자 중에서 자철광 나노결정은 생체적합성 및 화학적 안정성 때문에 생물의학 분야에서 가장 널리 사용되어 왔다. 자성 나노입자를 이용한 생체의학 응용에 많은 노력을 기울였지만 수용액에서의 우수한 분산성, 기능성 및 생체적합성과 같은 몇 가지 중요한 문제가 여전히 존재합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 많은 연구에서 다양한 작용기(예:카르복실기 및 아민기)를 사용하여 나노입자의 표면 개질에 초점을 맞추었습니다[23]. 그러나 자철광 NP의 표면에 작용기를 부착하는 것은 시간이 많이 걸리고 힘든 과정입니다. 이러한 사실을 감안할 때, Au 표면이 생체 분자 및 유기 물질에 쉽게 연결될 수 있기 때문에 코어 쉘형 Au 코팅 자성 나노입자가 매력적입니다.
특히, 자기 코어-Au 쉘 나노입자의 자기적 특성은 자기 분리를 가능하게 하고, MRI 영상의 해상도를 증가시키며, 온열 요법에 적용될 수 있다. 더욱이, 금의 우수한 화학적 결합 특성은 특정 암 표적화를 위한 수용체 매개 전달 시스템을 구축하는 데 유리합니다[24,25,26].
지난 수십 년 동안 많은 연구자들이 암 표적화를 위한 수용체 매개 전달 시스템을 보고했습니다[27,28,29].
암세포의 수용체 매개 표적화는 능동적 표적화의 한 형태입니다. 표적의 선택은 효과적인 능동 표적의 핵심이며 표적은 세포외막에서 과발현되어야 합니다. 대부분의 연구자들은 단일클론항체를 암 치료에 사용하고 있으며, 단일클론항체 요법과 기존의 화학요법을 병행할 경우 치료효과가 크게 증가할 수 있다[30]. 단일클론항체 요법의 성공에도 불구하고 단일클론항체는 암 표적화에 몇 가지 한계가 있습니다. 그들의 큰 크기(약 150 kDa)는 종양 침투의 주요 장애물이며[31, 32], 낮은 안정성과 낮은 용해도는 광범위한 사용을 방해합니다[33]. 표적화 담체에 대한 부착의 불균일한 방향 또한 비특이적 결합에 대한 장애물로 간주됩니다. 종양 침투가 개선된 항체를 생산하기 위해 광범위한 항체 형식이 조작되고 테스트되었습니다[34]. 고전적인 항체와는 별도로 독특한 항체 형식은 낙타과(Camelidae)의 종에 존재합니다. 소위 중쇄 항체(HCAb)는 이러한 종의 말초 혈액 및 우유에서 자연적으로 발생합니다. 이러한 HCAb의 항원 결합 단편은 낙타과의 HCAb(VHH)의 중쇄 가변 도메인(VH)인 단일 도메인으로 구성됩니다. VHH는 클로닝 후 세균이나 곰팡이에서 발현된 후 재조합적으로 얻어지며 나노바디(nanobody)라고 불린다. 11-15 kDa의 분자량을 가지며 모든 mAb 중에서 가장 작은 항체입니다[35,36,37]. 크기가 작기 때문에 격리된 위치의 항원에 대한 표적 프로브로 잠재적으로 적합할 뿐만 아니라 쉽게 수정할 수 있는 말단 말단이 암 표적에 적용하기에 매력적입니다.
세포의 적절한 표적화 및 내재화를 통한 NP의 효율적인 전달 또한 전달 시스템에서 중요한 요소입니다. 비멘틴은 병원체 부착 및 세포내 진입 경로의 구성요소로서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. vimentin 유전자 발현의 억제는 phagocytosis를 억제하는 반면 [38], cleaved vimentin은 phagocytosis를 유의하게 증가시키는 신호입니다 [39]. 따라서 세포 표면의 vimentin에 의한 세포 식균 작용 저항을 중화하는 것은 효율적인 나노 입자 전달을 위해 중요합니다.
이 연구에서 우리는 나노바디 태그가 붙은 Fe3의 세포내이입 경로를 조사합니다. O4 - 길이가 다른 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 스페이서로 변형된 Au 코어-쉘 NP. 생화학적 실험을 통해 식균작용에 강한 영향을 미치는 것으로 알려진 Vimentin[39]을 대조군으로 비교하여 나노입자의 세포내재화에 효과적으로 작용함을 확인하였다. 또한 췌장암, 유방암, 폐암, 위암 등 다양한 암에서 과발현되는 세포표면 당단백질인 Muc1을 암 표적 바이오마커로 활용하고 있다. Fe3의 효율적인 내재화를 확인했습니다. O4 Au 코어-쉘 NP 및 결장 세포에서 Muc1 수용체 매개 엔도사이토시스 경로를 통해 암세포에 제어 가능한 표적화 방법.
금(III) 아세테이트(Au(OOCCH3)3, 99.9%)는 Alfa Aesar에서 얻었습니다. 철(III) 아세틸아세토네이트(Fe(acac)3 , 99.9%), 1,2-헥사데칸디올(C14H29CH(OH)CH2(OH), 90%), 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(프로필렌 글리콜)-블록-폴리(에틸렌 글리콜)(PEG-PPG- PEG) 및 옥틸 에테르(C8H17OC8H17, 99%)는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 받은 그대로 사용했습니다. 알파-피리딜-2-디설피드-오메가-카르복시 숙신이미딜 에스테르 폴리(에틸렌 글리콜)(OPSS-PEG-NHS)(2K, 5K 및 10K)은 Nanocs에서 구입했습니다. 중탄산나트륨, WST-1, chlorpromazine, nystatin, cytochalasin D, dynasore, brefeldin A(BFA), monensin 및 trypan blue는 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. Cy3 및 Cy7.5는 Lumiprobe에서 구입했습니다. Anti-Muc1 Ab는 Abcam Inc.(Cambridge, MA)에서 구입했습니다. Phosphate-buffered saline(PBS), Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 및 태아 소 혈청은 Invitrogen Corp.에서 구입했습니다.
Fe3 O4 -Au 코어-쉘 NP는 나노에멀젼 방법을 통해 합성되었습니다. 코어-쉘 NP의 합성 과정은 두 단계로 구성됩니다. (1) Fe3의 형성 O4 코어 NP 및 (2) 자기 NP에 Au 쉘 코팅. 첫 번째 단계에서 Fe3 O4 NP는 Fe(acac)3의 혼합 용액에서 준비되었습니다. (0.1766 g 또는 0.5 mmol), 1,2-헥사데칸디올(0.6468 g 또는 2.5 mmol) 및 블록 공중합체(폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드), PEO-PPO-PEO)( 0.4 ~ 1.2 g) 옥틸 에테르 중. 혼합 용액을 300 °C로 가열하여 Fe 전구체를 환원시켰다. Fe3의 형성 O4 코어 NP는 가열된 용액을 냉각하여 완성되었습니다. 두 번째 공정은 자심 형성 후 정제과정 없이 연속적으로 진행하였다. Au 전구체(0.2338 g 또는 0.62 mmol) 및 1,2-헥사데칸디올(0.88 g, 3.4 mmol)을 Fe3로 구성된 에멀젼에 첨가했습니다. O4 NPs, 그리고 혼합 용액을 230 °C에서 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 에멀젼을 원심분리에 의해 침전시키고 코어-쉘 NP를 분리하였다.
중합효소연쇄반응(PCR)은 정방향 프라이머 5'-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3' 및 역방향 프라이머 5'-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3'를 사용하여 수행되었습니다. PCR 산물을 EcoRI 및 XhoI로 분해하고 QIA quick Gel Extraction Kit(QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용하여 겔 정제했습니다. 정제된 PCR 생성물을 EcoRI/XhoI-소화된 pET-23a(Novagen, Darmstadt, Germany)에 클로닝하였다. 대장균 (대장균 ) DH5α(RBC Bioscience, Xindian, Taiwan)를 열 충격에 의해 생성된 구성물로 형질전환하고 100μg/mL 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트(Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands)에서 선택했습니다.
재조합 항-Muc1-VHH 5-24 K10 단백질을 발현 및 정제하기 위해, E. 대장균 BL21 균주(RBC Bioscience, Xindian, Taiwan)를 pET-23a-항-Muc1-VHH 5-24 K10으로 형질전환시켰다. 그 다음, 박테리아를 암피실린(100 μg/mL)을 함유하는 LB 브로쓰에서 성장시켰다. 단백질 발현은 37 °C에서 5 h 동안 0.4 mM의 최종 농도에서 이소프로필 β-d-티오갈락토시드(IPTG)(Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands)에 의해 유도되었습니다. 박테리아 펠릿을 용해 완충액(50 mM NaH2 PO4 , pH 8.0; 300 mM NaCl)에 이어 얼음 위에서 10 분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리된 용해물을 20,000×g에서 원심분리했습니다. 4 °C에서 20 분 동안 Ni-NTA His·Bind Resin(Peptron, 대전, 한국)에 적용했습니다. 수지에 결합된 His-tagged 단백질은 elution buffer(50 mM NaH2 PO4 , pH 8.0; 300 mM NaCl; 150 mM 이미다졸). 정제된 단백질은 15% SDS-PAGE 젤에서 분리되었습니다.
다양한 길이(2, 5 및 10 K)의 OPSS-PEG-NHS를 티올기의 활성화를 위해 0.1 M 중탄산나트륨에 용해시켰다. 활성화된 OPSS-PEG-NHS를 합성된 코어-쉘 Fe3 용액에 첨가했습니다. O4 -Au NPs 및 4 °C에서 12 시간 동안 교반. 활성화된 OPSS-PEG-NHS의 티올 그룹은 코어 쉘 NP의 Au 표면에 공유적으로 연결되었습니다. 그런 다음, 나노바디 용액(0.25 mg/mL)을 PEG화 Fe3에 첨가했습니다. O4 -4 °C에서 12 h 동안 Au 코어-쉘 NP. 말단에 있는 10개의 라이신(K) 꼬리의 아민 그룹은 pH 약 8.3에서 OPSS-PEG-NHS의 NHS 그룹에 공유적으로 연결되었습니다. Cy3 및 Cy7.5는 나노바디의 잔류 아민 그룹에 태그되었습니다.
CT26 세포는 5 × 10 3 으로 시딩되었습니다. 바닥이 투명한 96웰 플레이트에 웰당 세포를 넣고 250 μL의 배양 배지에서 24시간 동안 37 °C, 5% CO2에서 배양 어두운 데에서. 배지를 제거하고 50 μg/mL Cy3로 표지된 Fe3를 포함하는 250 μL의 새로운 배양 배지 O4 -Au NP 및 PEG-Cy3 또는 PEG-나노바디-Cy3 표지된 NP를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 다른 기간(0, 10, 20, 30, 60, 120 및 360분) 동안 추가로 배양했습니다. 그런 다음, 세포를 PBS로 3회 세척하여 유리 NP를 제거하고, SpectraMAX GEMINI(Molecular Devices, CA, USA)에 의해 막-불투과성 형광 소광제인 트립판 블루를 사용하여 각 웰의 형광을 측정하였다. 각 실험은 동일한 양의 NP(50 μg/mL)로 수행되었으며 세 번 반복되었습니다[40].
CT26 세포는 5 × 10 3 으로 시딩되었습니다. 바닥이 투명한 96웰 플레이트에 웰당 세포를 넣고 5% CO2에서 37 °C에서 24시간 동안 250 μL의 배지에서 배양 어두운 데에서. 배지를 제거하고 20 μg/mL 클로르프로마진(CPZ), 50 μg/mL 니스타틴, 20 μg/mL 사이토칼라신 D, 25 μg/mL dynasore, 20 μg/mL dynasore, 20 μg/mL BFA μg/mL를 포함하는 250μL의 새로운 배양 배지 mL 모넨신 또는 5 μM 항-Muc1 Ab를 첨가하고 세포를 1 시간 동안 배양했습니다.
배지를 다시 제거하고 50 μg/mL Cy3-labeled Fe3를 포함하는 250μL의 배양 배지 O4 -Au NP, PEG-Cy3 표지 NP, PEG-나노바디-Cy3 표지 NP 또는 vimentin-Cy3 표지 NP가 추가되었습니다.
37 °C 및 5% CO2에서 1 시간 후 , 세포를 PBS로 3회 세척하여 유리 NP를 제거하고, SpectraMAX GEMINI(Molecular Devices, CA, USA)에 의해 막-불투과성 형광 소광제로서 트립판 블루를 사용하여 형광을 측정하였다. 각 실험은 동일한 양의 NP(50 μg/mL)로 수행되었으며 4번 반복되었습니다.
코어-쉘 나노입자는 공개된 방법에 의해 합성되었다[16, 17]. 그림 1a, b의 투과 전자 현미경(TEM) 관찰은 Fe3 O4 -Au 코어-쉘 NP는 평균 직경이 13.5 nm이고 좁은 크기 분포를 갖는 구형이었습니다.
<그림><그림>
합성된 Fe3의 특성화 O4 -Au 코어 쉘 NP. 아 , b 합성된 Fe3의 TEM 관찰 O4 -Au 코어 쉘 NP. ㄷ , d 외부 자기장을 적용하기 전과 후의 수용액의 NP. 이 합성된 코어-쉘 NP의 UV 흡광도 피크는 ~ 530 nm에서 나타납니다. 에 Fe3의 자기 히스테리시스 루프 O4 핵심
코어 NP(Fe3)의 ~ 8.5 nm에서 증가 O4 ) 코어 표면에 ~ 2.5nm 두께의 Au 쉘 코팅으로 인해 코어 쉘 NP가 생성됩니다. Fe3의 고속 푸리에 변환(FFT) 분석이 포함된 고해상도 TEM 이미지 O4 -Au core-shell NP는 보충 정보 그림 S1에 포함되어 있습니다.
유기용매로 제조된 제품을 자기분리를 이용하여 정제하여 물에 옮겼다.
코어-쉘 NP는 NP에 존재하는 잔류 블록 공중합체로 인해 표면 변형 없이 물에 잘 분산되고 안정적이었습니다.
그림 1c와 d는 외부 자기장을 적용하기 전과 후 수용액에서 NP를 보여줍니다. 외부 자기장 하에서 코어 쉘 NP는 균질한 분산(그림 1c)에서 맑고 투명한 용액(그림 1d)으로 빠르게 변했습니다.
코어-쉘 NP의 흡수 밴드는 UV-Vis 분광법을 사용하여 조사되었습니다. 그림 1e에서 볼 수 있듯이 ~ 530 nm에서 흡광도 피크가 나타나 NP 표면에 Au가 있음을 나타냅니다(보충 정보 그림 S2에는 Fe3에 대한 EDX 데이터 결과가 포함되어 있습니다. O4 -Au 코어 쉘 NP). 샘플이 정제됨에 따라 광학 결과는 코어-쉘 구조의 형성을 보여주었습니다.
Fe3의 자기 특성을 조사하기 위해 진동 샘플 측정에서 자기 히스테리시스 루프를 얻었습니다. O4 코어 및 코어 쉘 NP. 두 NP는 상온에서 보자력이 거의 0 Oe인 초상자성 거동을 보였다(그림 1f).
이전 연구에서 보고된 바와 같이 코어-쉘 NP의 감수성은 마그네타이트 NP의 감수성보다 높았는데, 이는 부분적으로 근접 효과와 고유한 공간 구성으로 인한 것일 수 있습니다[41, 42]. 게다가, 코어 NP와 코어-쉘 NP의 포화 자화는 10 kOe에서 각각 ~37 emu/g 및 ~21 emu/g이다. Ms의 차이는 코어 쉘 NP에 비자성 성분(Au)이 존재하기 때문입니다.
VHH 5-24 K10 유전자는 PCR 증폭 후 pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10을 생성하기 위해 프레임 내 클로닝되었습니다(그림 2a). 재조합 단백질은 E에서 발현되었다. 대장균 IPTG로 유도한 후 pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10으로 형질전환되고 Ni-NTA His·Bind 수지로 정제된 BL21. 재조합 항-Muc1-VHH 5-24 K10은 E에서 쉽게 발현되었다. 대장균 가용성 18-kDa 단백질. 1-L 배양에서 1 ± 0.5 mg의 정제된 재조합 항-Muc1-VHH 5-24 K10을 얻었습니다.
<그림><그림>
항-Muc1-VHH 5-24 K10 융합 단백질의 발현 및 정제. VHH 5-24 K10 유전자는 프레임 내에서 복제되어 a b 후 pET-23a-항-Muc1-VHH 5-24 K10 Muc1-VHH 5-24 K10 융합 단백질의 정제. 정제된 단백질을 15% SDS-PAGE에서 분리하였다. 레인 1 단백질 사다리. 레인 2 정제된 단백질. ㄷ 이 연구에 사용된 PEG-나노바디-염료 표지된 NP의 개략도
정제된 단백질은 15% SDS-PAGE 겔로 확인하였다. 정제된 단백질을 Coomassie blue로 염색한 결과 순도가 95% 이상임을 알 수 있었습니다(그림 2b). 합성된 Fe3 O4 -Au NP는 PEG화, 항체 태깅 및 염료 라벨링의 세 단계로 수정되었습니다(그림 2c). 각 수정 단계 후에 제타 전위를 측정하여 성공적인 수정을 확인했습니다. 표 1은 해당 제타 전위에 대한 수정의 영향을 보여줍니다. 베어 코어 쉘 NP의 제타 전위는 -19.8 ± 6.68 mV였습니다. OPSS-PEG-NHS를 사용하여 NP의 PEG화를 수행했습니다. 크기가 다른 일련의 나노복합체를 생산하기 위해 다양한 길이(2K, 5K, 10K)의 OPSS-PEG-NHS를 사용했습니다.
<그림>PEG화 후, 제타 전위가 감소했습니다(각각 2 K, 5 K 및 10 K에 대해 - 44.9 ± 8.19 mV, - 40.7 ± 7.88 mV 및 - 39.6 ± 8.74 mV).
흥미롭게도, 나노바디 태깅 후 제타 전위가 분명히 증가했습니다(각각 2 K, 5 K 및 10 의 경우 - 38.5 ± 5.61 mV, - 23.3 ± 8.61 mV 및 - 31.8 ± 7.37 mV).
염료 태깅 후 제타 전위도 증가했습니다(각각 2, 5 및 10 K에 대해 - 12.5 ± 7.25 mV, - 17.7 ± 3.94 mV 및 - 10.6 ± 4.72 mV).
베어 Fe의 제타 전위3 O4 -Au 코어-쉘 NP는 -19.8 ± 6.68 mV였습니다. PEG화 후, 제타 전위는 거의 -40 mV로 감소했습니다. 이러한 결과는 PEG 분자가 음전하를 띤 N-히드록시숙신이미드 작용기를 가지고 있기 때문에 PEG 분자가 코어-쉘 NP의 Au 쉘에 공유 결합으로 잘 결합되었음을 나타냅니다. 한편, 제타 전위는 나노바디에 대한 염료 태깅 후 증가했습니다(NP-PEG2 K-나노바디의 경우 -38.5 ± 5.61 mV, NP-PEG2 K-나노바디 염료의 경우 -12.5 ± 7.25 mV). 이 결과는 재조합 나노바디가 말단에 10개의 라이신 꼬리를 가지고 있기 때문에 합리적입니다. 나노바디의 각 유형은 제타 전위 측정에 의해 분류되었으며, 나노바디에 대한 항체 결합을 확인하기 위해 각 나노바디 유형에 대한 형광을 측정했습니다.
도 3에 나타난 바와 같이, 모든 유형의 나노입자 및 나노바디가 억제제 제한 없이 세포 흡수 및 내재화가 잘 됨을 확인하였다. 세포 내재화 곡선은 50 μg/mL Cy3로 표지된 Fe3의 존재 하에 배양된 세포에서 얻었습니다. O4 -Au NP, PEG-Cy3 표지된 NP, PEG-나노바디-Cy3 표지된 NP는 배지를 제거하고 유리 NP를 세척한 후 트립판으로 세포의 총 형광을 최종적으로 측정한 후 서로 다른 기간(0분에서 360분 사이) 동안 파란색(그림 3).
<그림><그림>
50 μg/mL a 배양 후 CT26 점액 세포의 정규화된 광형광 Fe3 O4 -Au NP, b PEG화된 NP 및 PEG-나노바디 태그가 지정된 NP 및 c Fe3 O4 -Au NP, 나노바디 태그 NP 및 vimentin 태그 NP, 37 °C, 5% CO2 다른 기간 동안(10, 20, 30, 60, 120 및 360 분)
형광 강도 측정 결과에 따르면 1 h 이내에 NP가 세포에 내재화되었음을 확인할 수 있습니다(그림 3a). NP의 형광 강도는 1 h 이내에 최대값에 도달하였고, 형광 강도는 정상 상태에 도달한 후 점차 감소하였다. Ab의 존재 여부에 따라 약간의 시간 차이가 있지만 배양 시간당 형광 강도는 베어 NP의 결과와 크게 다르지 않았습니다(그림 3b). Fig. 3c에서 보는 바와 같이 Muc1과 vimentin의 이질적인 Ab를 이용한 Ab의 효과는 세포내 NP의 흡수와 내재화에 미미한 수준임을 확인하였다.
WST-1 assay로 Fe3의 농도와 표면 변형에 따른 CT26 mucin 세포의 생존율(%) O4 -Au 코어-쉘 NP는 다양한 노출 시간에 따라 추정되었습니다(그림 4a, b). CT26 세포의 생존력은 24 h 및 48 h 노출 후 또는 NPs의 표면 변형 후에 유의한 차이를 나타내지 않았습니다. 세포 생존율은 두 Fe3 모두에서 90% 이상이었습니다. O4 -Au NP(그림 4a) 및 표면 수정 NP(그림 4b).
<그림><그림>
순수한 Fe3로 처리된 CT26 점액 세포의 생존 O4 -Au 코어 쉘 NP 및 표면 수정 Fe3 O4 - 다양한 농도의 Au NP. 아 Fe3 O4 -Au NP 및 b PEG-나노바디-Cy3-표지된 NP. 각 실험 그래프는 4개의 서로 다른 실험 시리즈의 평균을 나타냅니다.
그림 5는 NP가 다양한 엔도사이토시스 경로(클라트린 매개, 카베올라 매개 및 식세포작용/거대음세포작용 경로)를 통해 CT26 뮤신 세포에 들어갔다는 것을 나타냅니다. 흥미롭게도, 도 5b는 항-Muc1 Ab가 또한 PEG-나노바디-Cy3-표지된 NP의 세포내이입에 주로 영향을 미친다는 것을 보여준다. NP 내재화의 경로를 이해하기 위해 특정 화학적 억제제를 사용하여 세포내이입 경로를 억제하려고 시도했습니다(그림 5). endocytosis의 경로는 clathrin-매개, caveolae-매개 및 macropinocytosis/phagocytosis의 세 가지 유형으로 구분되는 것으로 잘 알려져 있습니다.
<그림><그림>
1 시간 동안 화학적 세포내이입 억제제로 처리하고 50 μg/mL a로 배양한 CT26 점액 세포의 정규화된 광형광 베어 코어 셸 NP 및 b 37 °C, 5% CO2에서 나노바디 태그가 지정된 NP 30 분 동안. 내면화에 대한 통계적 효과가 있는 억제제(학생의 t 테스트, p (*) <0.05 및 p (**) <0.01)은 검은색 별표로 표시됩니다.
이 연구에서 억제제는 나노바디 태그가 지정된 NP의 내재화를 조사하기 위한 첫 번째 접근 방식으로 사용되었습니다. CPZ(클라트린 매개 엔도사이토시스 억제제), 니스타틴(카베올라 매개 엔도사이토시스 억제제), dynasore(다이나민 억제제), 사이토칼라신 D(식세포작용/대음세포작용 억제제), BFA(골지 기구 파괴자), 모넨신(리소좀 억제제), 또는 항-Muc1 Ab(수용체-/수신체 특이적 경쟁자)는 1 h 동안 세포와 함께 배양되었습니다. CPZ, nystatin, dynasore 및 cytochalasin D는 NP의 endocytosis에 영향을 미쳤습니다(그림 5a).
표적화 모이어티는 암 표적화의 성공의 열쇠이며, 이는 암 치료에서 특히 중요합니다. 표적화의 경우 효과적인 표면 개질은 치료 효율을 높이고 부작용을 제한하는 데 매우 중요합니다. 나노바디 태그가 붙은 Fe3 O4 -Au 코어-쉘 NP는 합성된 NP와 재조합 나노바디로부터 성공적으로 만들어졌습니다. 표 1은 각 수정 단계가 성공적으로 수행되었음을 명확하게 보여줍니다.
세포 생존력은 나노 물질의 생물학적 응용에 필수적인 요소 중 하나입니다. 세포 생존율은 베어 코어-쉘 NP와 변형 NP에서 90% 이상이었습니다(그림 4a, b). 이 결과는 베어 Fe3 O4 -Au 나노입자 및 변형 나노입자는 유의한 농도 및 변형 의존적 세포독성을 일으키지 않았으며 변형 나노입자가 생물학적 적용에 적합함
NP의 내재화 효율 및 억제제 효과에 대한 연구는 NP가 세포에 들어가는 메커니즘을 이해하는 데 중요한 정보를 제공합니다. PEG화 NP는 베어 NP에 비해 상대적으로 세포 내로 천천히 내재화되었지만, 나노바디 태그가 지정된 NP는 베어 NP보다 약간 빠르게 세포 내로 내재화되었다(그림 3a, b). PEGylation은 NP의 내재화를 방지하기 위한 잘 알려진 표면 변형 방법이므로 PEGylated NP의 내재화 경향을 쉽게 설명할 수 있습니다. 또한, 나노바디는 나노입자의 세포내이입을 유도하였다. 나노바디의 특이성을 확인하기 위해 vimentin Ab-tagged NP의 내재화율을 확인하였다. 흥미롭게도 vimentin Ab 태그가 지정된 NP는 세포 내재화를 촉진하지 않았습니다(그림 3c).
이러한 결과는 나노바디가 나노물질의 CT26 뮤신 세포 내로의 내재화를 효과적으로 유도할 수 있음을 나타내며, 나노입자 외막의 특이적 변형으로 내재화 경향을 조절할 수 있음을 시사한다. 또한, 나노바디 태그가 지정된 NP의 세포내이입 메커니즘은 억제 테스트 및 공초점 현미경 이미징을 통해 명확하게 표시되었습니다. 나노바디가 태그된 NP와 태그가 지정되지 않은 NP의 광형광은 CPZ, nystatin 또는 dynasore와 함께 배양할 때 유사한 감소 값을 보여주었습니다(그림 5a, b). CPZ, nystatin 및 dynasore는 각각 clathrin 매개 endocytosis, caveolae 매개 endocytosis 및 dynamin을 억제하는 역할을 합니다. 따라서 dynamin이 clathrin 매개 및 caveolae 매개 endocytosis에 대한 소포 생성과 밀접한 관련이 있기 때문에 두 경우 모두 광형광 값이 급격히 감소했습니다. 그림 5a에서 볼 수 있듯이 태그가 지정되지 않은 나노바디(그림 5a)와 나노바디가 태그된 나노입자(그림 5b) 모두 광형광에서 급격한 감소를 보였습니다.
특히, 나노바디가 태그된 NP는 CPZ, nystatin 및 dynasore에서 훨씬 더 낮은 광형광 값을 표시했습니다. 또한, 우리는 phagocytosis를 위한 액틴 필라멘트의 중합을 차단하는 세포 투과성 독소인 cytochalasin D에 적용될 때 태그가 지정되지 않은 NP가 nanobody 태그가 지정된 NP보다 더 강하게 영향을 받는 것을 확인했습니다[43]. 이러한 결과는 태그가 지정되지 않은 NP가 clathrin 매개 endocytosis, caveolae 매개 endocytosis 및 phagocytosis와 같은 여러 메커니즘을 통해 내재화되었음을 의미합니다. 결과적으로, 나노바디 태그가 지정된 NP의 세포 내재화는 클라트린 매개 및 카베올라 매개 엔도사이토시스에 의존합니다. 게다가, 세포가 Muc1 항체로 배양되었을 때 나노바디 태그가 붙은 NP의 세포 흡수량이 상당히 감소하였다(도 5b). 이 결과는 유리 Muc1 항체가 CT26 세포막에 부착되는 변형 나노입자 상의 나노바디의 경쟁자 역할을 하고 Muc1 항체가 변형 나노입자의 세포 내재화에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 특이하게도 vimentin Ab 태그가 붙은 나노입자는 나노바디 태그가 붙은 나노입자와 비교하여 억제능 면에서 확연한 차이를 보였다. vimentin 태그가 지정된 NP의 광형광은 다중 억제 테스트에서 영향을 받지 않은 상태로 유지되었으며, 이는 NP가 nystatin, dynasore, cytochalasin D 및 Muc1 Ab의 영향을 최소화했음을 나타냅니다. 이러한 현상은 탐식작용에 강력한 영향을 미치는 것으로 생화학적으로 확인된 vimentin의 효능에 대한 증거가 될 수 있다[39]. 결과적으로, 이 결과는 Muc1 Ab가 특정 분자를 표적으로 할 수 있고 특정 세포내이입을 조절할 수 있음을 나타냅니다.
도 6에 도시된 바와 같이, 세포가 Cy7.5 표지된 베어 코어-쉘 NP 및 PEG-나노바디 태그가 지정된 NP로 처리되었을 때 유사한 결과가 얻어졌으며, 이는 다이너소어 억제가 없는 두 경우 모두에서 유사한 세포 흡수를 나타낸다. Dynasore 억제는 베어 NP와 비교하여 PEG-nanobody-tagged NP의 세포 내재화를 현저히 낮추도록 유도했습니다(그림 6b, 맨 아래 행). 이러한 결과는 베어 NP의 비특이적 엔도사이토시스와 dynamin 분자를 통한 나노바디 태그가 지정된 NP의 제한된 엔도사이토시스인 두 가지 엔도사이토시스 메커니즘이 있음을 의미합니다. 일단 나노바디가 외부 세포막에 부착되면, 나노바디 태그가 붙은 나노입자는 클라트린 및 카베올라 매개 메커니즘의 동시 활성화로 인해 세포막을 쉽게 통과할 수 있습니다. 결과적으로, 우리는 CT26 점액 세포에서 나노바디 태그가 붙은 NP의 내재화를 위한 clathrin 및 caveolae 매개 엔도사이토시스가 주요 기전이라고 가정할 수 있습니다.
<그림><그림>
a와 함께 배양된 CT26 점액 세포의 공초점 현미경 영상 Fe3 O4 -Au NP 및 b 5% CO2에서 37 °C에서 1 시간 동안 PEG-나노바디 태그가 지정된 NP 인큐베이터, 다이너소어 억제 전후(1 ng/mL)
암 표적화를 위한 나노물질 및 약물, 유전자 및 펩티드와 같은 외인성 물질의 제어 가능한 삽입은 생물의학 응용 분야에서 중요한 발전입니다. 이러한 친숙하지만 창의적인 개념은 새로운 치료 방법에 대한 전략을 제공할 수 있습니다. 이 논문에서 우리는 Fe3의 향상된 세포 흡수를 시연했습니다. O4 -Muc1 항체로 PEG화 후 Au 코어-쉘 NP. 나노바디 태그가 지정된 NP의 주요 세포내이입 메커니즘이 입증되었으며, 이는 결장직장암 세포에서 제어 가능한 특정 세포내이입의 가능성을 보여줍니다. 이러한 발견은 나노바디 태그가 지정된 NP와 결장직장암 세포 간의 표적화에 대한 통찰력을 제공하여 고효율 표적화 운반체의 설계를 지원합니다.
이 연구 동안 생성되거나 분석된 모든 데이터는 이 출판된 기사에 포함됩니다.
자철광
골드
나노입자
항체
중쇄 항체
낙타과의 VH HCAb
폴리(에틸렌 글리콜)
폴리(프로필렌 글리콜)
중합효소 연쇄반응
투과전자현미경
폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드)
오르토피리딜 이황화 PDP PEG 숙신이미딜 에스테르
브레펠딘 A
클로르프로마진
나노물질
초록 우리는 1.5~21nm의 잘 제어된 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 간격 두께에서 금 나노 입자(NP) 근처의 하위 단층 로다민 6G 분자의 형광을 조사합니다. 금 NP의 플라즈몬 공명 피크는 두께가 다른 PMMA 스페이서에 의해 530~580nm로 조정됩니다. 그런 다음 플라즈몬 공명 여기 향상으로 인해 562nm에서 로다민 6G 분자의 방출 강도가 향상되고 PMMA 스페이서 두께가 증가함에 따라 감소하는 것으로 나타났습니다. 유한 차분 시간 영역 방법에 의해 시뮬레이션된 스펙트럼 강도의 변화는 실험 결과와 일치합니다
초록 기존의 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 인해 비판을 받아왔다. 나노 입자의 돌파구는 전통적인 치료법과 진단을 업그레이드하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 실제로 나노 입자는 기존의 암 진단 및 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단 및 치료를 위한 새로운 관점과 첨단 장치를 만들 수 있습니다. 그러나 나노입자에 대한 연구는 대부분 in vivo 및 in vitro 단계에 머물고 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극히 소수에 불과하다. 이 리뷰에서 우리는 먼저 암 진단 및 치료에
