대장암 세포에서 표적 세포내 섭취를 위한 Fe₃O₄-Au 코어-쉘 나노입자 흡수 최적화

요약

자철석(Fe₃O₄)-금(Au) 코어-쉘 나노입자(NP)는 독특한 자기적 및 광학적 특성을 가집니다. 생물학적 모이어티와 결합하면 이러한 NP는 약물 전달 및 암 표적화와 같은 생물의학 응용을 위한 새로운 전략을 제공할 수 있습니다. 여기서는 생물학적 모이어티와의 결합으로 자기 코어-쉘 NP 시스템의 제어 가능한 세포 흡수를 위한 효과적인 방법을 제시합니다. 구조 단백질인 비멘틴은 생화학적으로 포식작용에 강력한 영향을 미치는 것으로 확인되었습니다. 또한 비멘틴은 다중 생물학적 모이어티 억제 하에서도 외인성 물질의 세포 내 내재화에 영향을 미칩니다. 본 연구에서는 생물학적 모이어티 조합을 이용한 표면 수정된 Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP의 세포 내재화 성능을 입증했습니다. 비멘틴 태그 NP의 광형광은 다중 억제 테스트에서 영향을 받지 않아, NP가 니스타틴, 다이나소어, 사이토칼라신 D, 심지어 Muc1 항체(Ab)에 의해서도 최소한으로 영향을 받음을 나타냈습니다. 결과적으로 Muc1 Ab가 특정 분자를 표적화하고 특정 세포내 섭취를 제어할 수 있음을 보여줍니다. 또한 대장암 세포에서 제어 가능한 특정 세포내 섭취 가능성을 보였습니다.

서론

나노물질은 임상 진단 및 치료에 새로운 길을 열었습니다. 특히 나노입자(NP)는 가장 중요한 도구 중 하나로 바이오센서[1, 2], 진단[3, 4], 표적 약물 전달 시스템[5, 6] 등에 사용되었습니다. 생물의학 응용을 위해 NP는 일반적으로 코어 물질을 둘러싼 유기 물질로 구성됩니다[7-9]. 자기 물질, 반도체 물질 또는 기타 유형의 물질로 구성된 코어 물질은 유용한 물리화학적 특성을 가지며, 외부 유기 표면은 NP에 화학적 안정성과 기능성을 제공합니다. 생물학적 표적 시스템 응용을 위해서는 물리화학적 특성뿐만 아니라 표적화를 위해 생체기능화된 외부 유기 표면도 중요한 매개변수입니다. 기능화용 표적 모이어티의 예로는 표적에 특이적인 항체나 리간드가 있습니다. 외부 표면에 생체기능화된 물질에 따라 NP의 세포내 섭취 메커니즘이 결정됩니다. NP가 세포에 들어가는 메커니즘은 나노의학 응용에서의 중요성으로 인해 많은 최근 연구의 주제였습니다[10-15].

특히 자기 나노입자는 세포 분리[16, 17], MRI[18], DNA 분리[19], 약물 전달[20], 고열 치료[21], 암 표적화[22] 등 다양한 특정 부위 표적화 응용에 널리 사용되었습니다. 다양한 자기 나노입자 중 자철석 나노결정은 생체적합성과 화학적 안정성으로 인해 생물의학 응용에 가장 널리 사용되었습니다. 자기 나노입자를 이용한 생물의학 응용에 많은 노력이 기울여졌음에도 불구하고, 수용액 내 좋은 분산성, 기능성, 생체적합성 등의 중요한 문제가 여전히 남아 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 많은 연구가 다양한 기능기(예: 카르복실기와 아민기)를 이용한 NP 표면 수정에 집중했습니다[23]. 그러나 자철석 NP 표면에 기능기를 부착하는 것은 시간 소모적이고 힘든 과정입니다. 이 점을 고려할 때 Au 코팅 자기 NP인 코어-쉘 타입은 Au 표면이 생체분자와 유기 물질에 쉽게 결합할 수 있어 매력적입니다.

특히 자기 코어-Au 쉘 NP의 자기적 특성은 자기 분리를 가능하게 하고, MRI 영상 해상도를 높이며, 고열 치료에 적용할 수 있습니다. 또한 금의 우수한 화학적 결합 특성은 특정 암 표적화를 위한 수용체 매개 전달 시스템 구축에 유리합니다[24-26].

지난 몇십 년간 많은 연구자들이 암 표적화를 위한 수용체 매개 전달 시스템을 보고했습니다[27-29].

암세포의 수용체 매개 표적화는 능동 표적화의 한 형태입니다. 표적 선택은 효과적인 능동 표적화의 핵심이며, 표적은 세포외 막에서 과발현되어야 합니다. 대부분의 연구자들이 암 치료에 단일클론 항체를 사용했으며, 단일클론 항체 치료가 기존 화학요법과 결합될 때 치료 효과가 크게 증가할 수 있습니다[30]. 단일클론 항체 치료의 성공에도 불구하고, 암 표적화에서 몇 가지 한계가 있습니다. 큰 크기(약 150 kDa)는 종양 침투의 주요 장애물이며[31, 32], 낮은 안정성과 용해도는 광범위한 사용을 방해합니다[33]. 표적 캐리어에 부착되는 불균일한 방향도 비특이적 결합의 장애물로 간주됩니다. 종양 침투가 개선된 항체를 생산하기 위해 다양한 항체 형식이 개발되고 테스트되었습니다[34]. 고전적 항체 외에 낙타과(Camelidae) 종에 고유한 항체 형식이 존재합니다. 소위 중쇄 항체(HCAb)는 이 종의 말초 혈액과 우유에서 자연적으로 발생합니다. 이러한 HCAb의 항원 결합 조각은 낙타과 HCAb의 중쇄 가변 영역(VHH)인 단일 도메인으로 구성됩니다. 클로닝과 박테리아 또는 곰팡이에서의 발현 후 재조합으로 얻은 VHH를 나노바디라고 합니다. 분자량 11-15 kDa로 모든 mAb 중 가장 작은 항체입니다[35-37]. 작은 크기뿐만 아니라 쉽게 수정 가능한 말단도 암 표적화 응용에 매력적입니다.

적절한 표적화와 세포 내재화를 통한 NP의 효율적 전달도 전달 시스템에서 중요한 요소입니다. 비멘틴이 병원체 부착과 세포내 진입 경로의 구성 요소로 중요한 역할을 한다는 보고가 있습니다. 비멘틴 유전자 발현 억제는 포식작용을 억제[38]하는 반면, 절단된 비멘틴은 포식작용을 크게 증가시키는 신호입니다[39]. 따라서 세포 표면의 비멘틴에 의한 포식작용 저항을 중화하는 것이 효율적인 나노입자 전달에 중요합니다.

본 연구에서는 서로 다른 길이의 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 스페이서로 수정된 나노바디 태그 Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP의 세포내 섭취 경로를 조사했습니다. 생화학 실험에서 포식작용에 강한 영향을 미치는 것으로 알려진 비멘틴을 대조군으로 비교하여 NP의 세포 내재화에 효과적으로 작용함을 확인했습니다. 또한 다양한 암(췌장암, 유방암, 폐암, 위암 등)에서 과발현되는 세포 표면 당단백질인 Muc1을 암 표적 바이오마커로 활용했습니다. 결장 세포에서 Muc1 수용체 매개 세포내 섭취 경로를 통해 Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP의 효율적 내재화와 제어 가능한 암세포 표적화 방법을 확인했습니다.

재료 및 방법

재료

초산 금(III)(Au(OOCCH₃)₃, 99.9%)는 Alfa Aesar에서 구입했습니다. 기타 화학물질로는 아세틸아세토네이트 철(III)(Fe(acac)₃, 99.9%), 1,2-헥사데칸디올(C14H29CH(OH)CH2(OH), 90%), 폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(프로필렌 글리콜)-블록-폴리(에틸렌 글리콜)(PEG-PPG-PEG), 옥틸 에테르(C8H17OC8H17, 99%)를 Sigma-Aldrich에서 구입하여 그대로 사용했습니다. α-피리딜-2-디설파이드-오메가-카복시 석시니미딜 에스테르 폴리(에틸렌 글리콜)(OPSS-PEG-NHS)(2K, 5K, 10K)는 Nanocs에서 구입했습니다. 탄산나트륨, WST-1, 클로르프로마진, 니스타틴, 사이토칼라신 D, 다이나소어, 브레펠딘 A(BFA), 모넨신, 트립탄 블루는 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. Cy3와 Cy7.5는 Lumiprobe에서 구입했습니다. 항-Muc1 Ab는 Abcam Inc.(Cambridge, MA)에서 구입했습니다. 인산 완충 식염수(PBS), Dulbecco 변형 Eagle 배지, 태아 소 혈청은 Invitrogen Corp.에서 구입했습니다.

Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP 합성

Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP는 나노에멀전 법으로 합성했습니다. 코어-쉘 NP 합성 공정은 두 단계로 구성됩니다: (1) Fe₃O₄ 코어 NP 형성, (2) 자기 NP에 Au 쉘 코팅. 첫 단계에서 Fe(acac)₃(0.1766 g 또는 0.5 mmol), 1,2-헥사데칸디올(0.6468 g 또는 2.5 mmol), 블록 공중합체(폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드); PEO-PPO-PEO)(0.4~1.2 g)를 옥틸 에테르 혼합 용액에 넣고 300°C로 가열하여 Fe 전구체를 환원했습니다. 가열된 용액을 냉각하여 Fe₃O₄ 코어 NP 형성을 완료했습니다. 두 번째 공정은 자기 코어 형성 후 정제 과정 없이 연속적으로 수행했습니다. Au 전구체(0.2338 g 또는 0.62 mmol)와 1,2-헥사데칸디올(0.88 g, 3.4 mmol)을 Fe₃O₄ NP로 구성된 에멀전에 첨가하고 혼합 용액을 230°C로 가열했습니다. 실온으로 냉각 후 원심분리로 에멀전을 침전시키고 코어-쉘 NP를 분리했습니다.

재조합 항-Muc1-VHH 5-24 K10 발현 벡터 구성

순방향 프라이머 5'-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3'와 역방향 프라이머 5'-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3'를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행했습니다. PCR 생성물을 EcoRI와 XhoI로 소화하고 QIA quick Gel Extraction Kit(QIAGEN, Valencia, CA, USA)로 겔 정제했습니다. 정제된 PCR 생성물을 EcoRI/XhoI로 소화된 pET-23a(Novagen, Darmstadt, Germany)에 클로닝했습니다. 대장균(E. coli) DH5α(RBC Bioscience, Xindian, Taiwan)를 열충격으로 형질전환하고 100 μg/ml 앰피실린(Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands)을 함유한 LB 한천 배지에서 선별했습니다.

재조합 단백질 발현 및 정제

재조합 항-Muc1-VHH 5-24 K10 단백질을 발현 및 정제하기 위해 pET-23a-항-Muc1-VHH 5-24 K10로 형질전환된 대장균 BL21 균주(RBC Bioscience, Xindian, Taiwan)를 사용했습니다. 세균을 앰피실린(100 μg/ml)을 함유한 LB 배지에서 배양했습니다. 아이소프로필 β-D-티오갈락토시드(IPTG)(Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands)를 최종 농도 0.4 mM으로 37°C에서 5시간 유도하여 단백질 발현을 유도했습니다. 세균 펠릿을 용해 버퍼(50 mM NaH₂PO₄, pH 8.0; 300 mM NaCl)에 재현탁하고 얼음에서 10분간 초음파 처리했습니다. 초음파 처리된 용해액을 4°C에서 20,000×g로 20분 원심분리하고 Ni-NTA His·Bind Resin(Peptron, Daejeon, Korea)에 적용했습니다. 레진에 결합된 His-태그 단백질을 용출 버퍼(50 mM NaH₂PO₄, pH 8.0; 300 mM NaCl; 150 mM 이미다졸)로 용출했습니다. 정제된 단백질을 15% SDS-PAGE 겔로 분리했습니다.

코어-쉘 Fe₃O₄-Au NP 수정

다양한 길이(2, 5, 10 K)의 OPSS-PEG-NHS를 0.1 M 탄산나트륨에 녹여 티올기를 활성화했습니다. 활성화된 OPSS-PEG-NHS를 합성된 코어-쉘 Fe₃O₄-Au NP 용액에 첨가하고 4°C에서 12시간 교반했습니다. 활성화된 OPSS-PEG-NHS의 티올기가 코어-쉘 NP의 Au 표면에 공유 결합되었습니다. 이후 나노바디 용액(0.25 mg/ml)을 PEG화된 Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP에 첨가하고 4°C에서 12시간 반응시켰습니다. 나노바디 말단의 10개 라이신(K) 꼬리의 아민기가 pH 8.3에서 OPSS-PEG-NHS의 NHS기와 공유 결합되었습니다. Cy3와 Cy7.5를 나노바디의 잔여 아민기에 태그했습니다.

내재화 곡선

CT26 세포를 투명 바닥 96-웰 플레이트 웰당 5×10³개씩 배양하고 250 μl 배양액으로 37°C, 5% CO₂, 암조건에서 24시간 배양했습니다. 배양액을 제거하고 50 μg/ml Cy3-라벨 Fe₃O₄-Au NP, PEG-Cy3 또는 PEG-나노바디-Cy3-라벨 NP를 함유한 250 μl 신선 배양액을 각 웰에 첨가했습니다. 세포를 추가로 서로 다른 기간(0, 10, 20, 30, 60, 120, 360분) 동안 배양했습니다. 세포를 PBS로 3회 세척하여 자유 NP를 제거하고, 막 불투과성 형광 퀜처인 트립탄 블루를 사용하여 SpectraMAX GEMINI(Molecular Devices, CA, USA)로 각 웰의 형광을 측정했습니다. 각 실험은 동일한 양의 NP(50 μg/ml)로 수행하고 3회 반복했습니다[40].

억제 테스트

CT26 세포를 투명 바닥 96-웰 플레이트 웰당 5×10³개씩 배양하고 250 μl 배양액으로 37°C, 5% CO₂, 암조건에서 24시간 배양했습니다. 배양액을 제거하고 20 μg/ml 클로르프로마진(CPZ), 50 μg/ml 니스타틴, 20 μg/ml 사이토칼라신 D, 25 μg/ml 다이나소어, 20 μg/ml BFA, 140 μg/ml 모넨신, 또는 5 μM 항-Muc1 Ab를 함유한 250 μl 신선 배양액을 첨가하고 1시간 배양했습니다.

배양액을 다시 제거하고 50 μg/ml Cy3-라벨 Fe₃O₄-Au NP, PEG-Cy3-라벨 NP, PEG-나노바디-Cy3-라벨 NP, 또는 비멘틴-Cy3-라벨 NP를 함유한 250 μl 배양액을 첨가했습니다.

37°C, 5% CO₂에서 1시간 후 PBS로 3회 세척하여 자유 NP를 제거하고, 막 불투과성 형광 퀜처인 트립탄 블루를 사용하여 SpectraMAX GEMINI(Molecular Devices, CA, USA)로 형광을 측정했습니다. 각 실험은 동일한 양의 NP(50 μg/ml)로 수행하고 4회 반복했습니다.

결과 및 논의

코어-쉘 NP는 발표된 방법[16, 17]으로 합성했습니다. Fig. 1a, b의 투과 전자 현미경(TEM) 관찰에서 Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP가 평균 직경 13.5 nm의 구형이며 좁은 크기 분포를 가짐을 확인했습니다.

코어 NP(Fe₃O₄)의 ~8.5 nm에서 증가는 코어 표면에 ~2.5 nm 두께의 Au 쉘 코팅으로 인한 것으로, 코어-쉘 NP를 형성합니다. Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP의 고해상도 TEM 이미지와 고속 푸리에 변환(FFT) 분석은 보충 정보 Fig. S1에 포함되어 있습니다.

유기 용매에서 제조된 생성물은 자기 분리로 정제하여 물로 옮겼습니다.

코어-쉘 NP는 잔류 블록 공중합체가 NP에 존재하여 표면 수정 없이도 물에서 잘 분산되고 안정적이었습니다.

Fig. 1c, d는 외부 자기장 적용 전후 수용액 내 NP를 보여줍니다. 외부 자기장 하에서 코어-쉘 NP는 균일한 분산 상태(Fig. 1c)에서 맑고 투명한 용액(Fig. 1d)으로 빠르게 변화했습니다.

코어-쉘 NP의 흡수 밴드는 UV-Vis 분광법으로 조사했습니다. Fig. 1e에서 ~530 nm에서 흡수 피크가 나타나 NP 표면에 Au가 존재함을 나타냅니다(보충 정보 Fig. S2에 Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP의 EDX 데이터 결과 포함). 시료가 정제되었으므로 광학 결과는 코어-쉘 구조 형성을 입증합니다.

자기 이력 루프는 진동 시료 측정으로 얻어 Fe₃O₄ 코어와 코어-쉘 NP의 자기적 특성을 조사했습니다. 두 NP 모두 상온에서 보자력 근처 0 Oe로 초상자성 거동을 보였습니다(Fig. 1f).

이전 연구들에서 보고된 바와 같이 코어-쉘 NP의 감수성은 자철석 NP보다 높았으며, 이는 근접 효과와 독특한 공간 구성 때문일 수 있습니다[41, 42]. 또한 코어 NP와 코어-쉘 NP의 포화 자화는 각각 10 kOe에서 ~37 emu/g와 ~21 emu/g입니다. Ms의 차이는 코어-쉘 NP에 비자기적 성분(Au)이 존재하기 때문입니다.

VHH 5-24 K10 유전자는 PCR 증폭 후 인프레임으로 클로닝되어 pET-23a-항-Muc1-VHH 5-24 K10을 생성했습니다(Fig. 2a). 재조합 단백질은 pET-23a-항-Muc1-VHH 5-24 K10로 형질전환된 대장균 BL21에서 IPTG 유도 후 Ni-NTA His·Bind Resin으로 정제되었습니다. 재조합 항-Muc1-VHH 5-24 K10은 대장균에서 용해성 18-kDa 단백질로 쉽게 발현되었습니다. 1-L 배양에서 1±0.5 mg의 정제된 재조합 항-Muc1-VHH 5-24 K10을 얻었습니다.

정제된 단백질은 15% SDS-PAGE 겔로 검증했습니다. 정제된 단백질의 코마시 블루 염색으로 95% 이상 순도임을 확인했습니다(Fig. 2b). 합성된 Fe₃O₄-Au NP는 PEG화, 항체 태깅, 염료 라벨링의 3단계로 수정되었습니다(Fig. 2c). 각 수정 단계 후 제타 전위를 측정하여 성공적인 수정을 확인했습니다. Table 1은 수정 단계에 따른 제타 전위 변화를 보여줍니다. 베어 코어-쉘 NP의 제타 전위는 -19.8±6.68 mV였습니다. NP의 PEG화는 OPSS-PEG-NHS로 수행했습니다. 다양한 크기의 나노복합체 시리즈를 생성하기 위해 다양한 길이(2K, 5K, 10K)의 OPSS-PEG-NHS를 사용했습니다.

PEG화 후 제타 전위는 감소했습니다(-44.9±8.19 mV, -40.7±7.88 mV, -39.6±8.74 mV, 각각 2K, 5K, 10K).

흥미롭게도 나노바디 태깅 후 제타 전위가 명확히 증가했습니다(-38.5±5.61 mV, -23.3±8.61 mV, -31.8±7.37 mV, 각각 2K, 5K, 10K).

염료 태깅 후 제타 전위도 증가했습니다(-12.5±7.25 mV, -17.7±3.94 mV, -10.6±4.72 mV, 각각 2, 5, 10K).

베어 Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP의 제타 전위는 -19.8±6.68 mV였습니다. PEG화 후 제타 전위는 -40 mV 근처로 감소했습니다. 이 결과는 PEG 분자가 음전하를 띤 N-하이드록시석시니미드 기능기를 가지므로 코어-쉘 NP의 Au 쉘에 공유 결합되었음을 나타냅니다. 한편 나노바디에 염료 태깅 후 제타 전위가 증가했습니다(NP-PEG2K-나노바디 -38.5±5.61 mV, NP-PEG2K-나노바디-염료 -12.5±7.25 mV). 이 결과는 재조합 나노바디가 말단에 10개의 라이신 꼬리를 가지므로 합리적입니다. 각 유형의 나노바디는 제타 전위 측정으로 분류되었으며, 나노바디의 항체 결합을 결정하기 위해 각 나노바디 유형의 형광을 측정했습니다.

Fig. 3에서 보는 바와 같이 억제제 제한이 없을 때 모든 유형의 나노입자와 나노바디가 세포 흡수와 내재화를 잘함을 확인했습니다. 50 μg/ml Cy3-라벨 Fe₃O₄-Au NP, PEG-Cy3-라벨 NP, PEG-나노바디-Cy3-라벨 NP 존재 하에서 세포를 배양하고 서로 다른 기간(0-360분) 후 배지를 제거하고 자유 NP를 세척한 후 트립탄 블루로 세포 총 형광을 측정하여 세포 내재화 곡선을 얻었습니다(Fig. 3).

형광 강도 측정 결과에 따르면 NP가 1시간 내에 세포 내에 내재화됨을 확인할 수 있습니다(Fig. 3a). NP의 형광 강도는 1시간 내에 최대에 도달한 후 정상 상태에 도달하면 점차 감소했습니다. 항체 유무에 따라 약간의 시간 차이가 있지만, 단위 배양 시간당 형광 강도는 베어 NP 결과와 유의미하게 다르지 않았습니다(Fig. 3b). Fig. 3c에서 보는 바와 같이 Muc1과 비멘틴의 이종 항체를 사용하여 항체의 효과가 NP의 세포 흡수와 내재화에 미미함을 확인했습니다.

WST-1 분석으로 Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP의 농도와 표면 수정에 따른 CT26 점액 세포의 생존율(%)을 다양한 노출 시간 후 추정했습니다(Fig. 4a, b). CT26 세포 생존율은 24시간과 48시간 노출 후 다양한 농도나 표면 수정 후에도 유의미한 차이를 보이지 않았습니다. 세포 생존율은 베어 Fe₃O₄-Au NP(Fig. 4a)와 표면 수정 NP(Fig. 4b) 모두에서 90% 이상이었습니다.

Fig. 5는 NP가 CT26 점액 세포에 다양한 세포내 섭취 경로(클라트린 매개, 카베올라 매개, 포식작용/대식세포 경로)로 진입함을 나타냅니다. 흥미롭게도 Fig. 5b에서 항-Muc1 Ab도 주로 PEG-나노바디-Cy3-라벨 NP의 세포내 섭취에 영향을 미침을 보여줍니다. NP 내재화 경로를 이해하기 위해 특정 화학 억제제로 세포내 섭취 경로를 억제해 보았습니다(Fig. 5). 세포내 섭취 경로는 클라트린 매개, 카베올라 매개, 대식세포/포식작용의 세 가지 유형으로 잘 알려져 있습니다.

본 연구에서 억제제를 사용하여 나노바디 태그 NP의 내재화를 조사하는 첫 번째 접근법으로 시도했습니다. CPZ(클라트린 매개 세포내 섭취 억제제), 니스타틴(카베올라 매개 세포내 섭취 억제제), 다이나소어(다이나민 억제제), 사이토칼라신 D(포식작용/대식세포 억제제), BFA(골지체 파괴제), 모넨신(라이소좀 억제제), 또는 항-Muc1 Ab(수용체/수송체 특이적 경쟁자)를 세포와 1시간 배양했습니다. CPZ, 니스타틴, 다이나소어, 사이토칼라신 D가 NP의 세포내 섭취에 영향을 미쳤습니다(Fig. 5a).

표적 모이어티는 암 표적화 성공의 핵심으로, 암 치료에서 매우 중요합니다. 표적화를 위해 효과적인 표면 수정은 치료 효율을 높이고 부작용을 제한하는 데 매우 중요합니다. 나노바디 태그 Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP는 합성된 NP와 재조합 나노바디로 성공적으로 제조되었습니다. Table 1은 각 수정 단계가 성공적으로 수행되었음을 명확히 보여줍니다.

세포 생존율은 나노물질의 생물학적 응용에서 필수적인 요소입니다. 베어 코어-쉘 NP와 수정된 NP에서 세포 생존율이 90% 이상이었습니다(Fig. 4a, b). 이 결과는 베어 Fe₃O₄-Au NP와 수정된 NP가 유의미한 농도 및 수정 의존적 세포독성을 일으키지 않으며, 수정된 NP가 생물학적 응용에 적합함을 시사합니다.

내재화 효율과 NP의 억제제 효과 연구는 NP가 세포에 들어가는 메커니즘을 이해하는 데 중요한 정보를 제공합니다. PEG화된 NP는 베어 NP에 비해 상대적으로 느리게 세포에 내재화되었지만, 나노바디 태그 NP는 베어 NP보다 약간 더 빠르게 내재화되었습니다(Fig. 3a, b). PEG화는 NP 내재화를 방지하는 잘 알려진 표면 수정 방법이므로 PEG화된 NP의 내재화 경향은 쉽게 설명됩니다. 또한 나노바디가 NP의 세포내 섭취를 유도했습니다. 나노바디의 특이성을 확인하기 위해 비멘틴 Ab 태그 NP의 내재화율을 확인했습니다. 흥미롭게도 비멘틴 Ab 태그 NP는 세포 내재화를 촉진하지 않았습니다(Fig. 3c).

이 결과는 나노바디가 CT26 점액 세포로 나노물질의 내재화를 효과적으로 유도할 수 있으며, NP 외부 막의 특정 수정을 통해 내재화 경향을 제어할 수 있음을 시사합니다. 또한 나노바디 태그 NP의 세포내 섭취 메커니즘이 억제 테스트와 공초점 현미경 영상으로 명확히 밝혀졌습니다. 나노바디 태그 NP와 비태그 NP의 광형광 값은 CPZ, 니스타틴, 다이나소어 배양 시 유사하게 감소했습니다(Fig. 5a, b). CPZ, 니스타틴, 다이나소어는 각각 클라트린 매개 세포내 섭취, 카베올라 매개 세포내 섭취, 모체 막에서 신생 소포의 싹트기와 분리에 관여하는 큰 GTPase인 다이나민을 억제합니다. 이로 인해 다이나민이 클라트린 매개와 카베올라 매개 세포내 섭취를 위한 소포 생성과 밀접하게 관련되어 있어 두 경우 모두 광형광 값이 급격히 감소했습니다. Fig. 5a에서 비태그 NP(Fig. 5a)와 나노바디 태그 NP(Fig. 5b) 모두 광형광이 급격히 감소했습니다.

특히 나노바디 태그 NP는 CPZ, 니스타틴, 다이나소어에서 유의미하게 낮은 광형광 값을 보였습니다. 또한 사이토칼라신 D(포식작용을 위한 액틴 필라멘트 중합을 차단하는 세포 투과성 독소[43]) 적용 시 비태그 NP가 나노바디 태그 NP보다 더 강하게 영향을 받음을 확인했습니다. 이 결과는 비태그 NP가 클라트린 매개 세포내 섭취, 카베올라 매개 세포내 섭취, 포식작용 등 여러 메커니즘으로 내재화됨을 시사합니다. 결과적으로 나노바디 태그 NP의 세포 내재화는 클라트린 매개와 카베올라 매개 세포내 섭취에 의존합니다. 또한 Muc1 항체 배양 시 나노바디 태그 NP의 세포 흡수량이 상당히 감소했습니다(Fig. 5b). 이 결과는 자유 Muc1 항체가 수정된 NP의 나노바디와 경쟁하여 CT26 세포막에 부착하며, Muc1 항체가 수정된 NP의 세포 내재화에서 중요한 역할을 함을 나타냅니다. 특이하게 비멘틴 Ab 태그 NP는 억제 능력 측면에서 나노바디 태그 NP와 뚜렷한 차이를 보였습니다. 비멘틴 태그 NP의 광형광은 다중 억제 테스트에서 영향을 받지 않아, NP가 니스타틴, 다이나소어, 사이토칼라신 D, 심지어 Muc1 Ab에 의해서도 최소한으로 영향을 받음을 나타냈습니다. 이 현상은 비멘틴이 생화학적으로 포식작용에 강력한 영향을 미침을 확인한 증거가 될 수 있습니다[39]. 결과적으로 Muc1 Ab가 특정 분자를 표적화하고 특정 세포내 섭취를 제어할 수 있음을 나타냅니다.

Fig. 6에서 보는 바와 같이 세포를 Cy7.5-라벨 베어 코어-쉘 NP와 PEG-나노바디 태그 NP로 처리했을 때 유사한 결과가 얻어졌으며, 다이나소어 억제 없을 때 두 경우 모두 유사한 세포 흡수를 보였습니다. 다이나소어 억제는 베어 NP에 비해 PEG-나노바디 태그 NP의 세포 내재화를 뚜렷하게 낮췄습니다(Fig. 6b, 아래 행). 이 결과는 베어 NP의 비특이적 세포내 섭취와 다이나민 분자를 통한 나노바디 태그 NP의 제한된 세포내 섭취라는 두 가지 세포내 섭취 메커니즘이 있음을 시사합니다. 나노바디가 외부 세포막에 부착되면 클라트린 매개와 카베올라 매개 메커니즘이 동시에 활성화되어 나노바디 태그 NP가 세포막을 쉽게 통과할 수 있습니다. 따라서 나노바디 태그 NP의 CT26 점액 세포 내재화 주요 메커니즘은 클라트린 매개와 카베올라 매개 세포내 섭취라고 추측할 수 있습니다.

결론

암 표적화와 약물, 유전자, 펩타이드 등 외인성 물질의 제어 가능한 삽입을 위한 나노물질은 생물의학 응용에서 중요한 진전입니다. 이러한 친숙하지만 창의적인 개념은 새로운 치료 방법을 위한 전략을 제공할 수 있습니다. 본 논문에서는 Muc1 항체로 PEG화된 Fe₃O₄-Au 코어-쉘 NP의 향상된 세포 흡수를 입증했습니다. 나노바디 태그 NP의 주요 세포내 섭취 메커니즘을 입증하여 대장암 세포에서 제어 가능한 특정 세포내 섭취 가능성을 보였습니다. 이러한 발견은 나노바디 태그 NP와 대장암 세포 간의 표적화에 대한 통찰을 제공하여 고효율 표적 캐리어 설계에 도움을 줍니다.