우울증에서 히스톤 탈아세틸화효소(HDAC)를 중심으로 하는 연구가 과도하게 수행되었지만 HDAC1에 대한 연구는 많지 않습니다. 거기에서 우울증에서 HDAC1/microRNA(miR)-124-5p/neuropeptide Y(NPY) 축의 메커니즘을 밝히기 위한 본 연구가 시작되었습니다. Sprague Dawley 쥐는 우울증 모델을 설정하기 위해 예측할 수 없는 만성적인 가벼운 스트레스에 의해 자극을 받았습니다. 우울한 쥐에게 체중, 학습 및 기억 능력, 산화 스트레스 및 혈청 염증 및 해마 조직의 신경 전달 물질 발현에서의 역할을 조사하기 위해 억제된 HDAC1 또는 억제된 miR-124-5p를 주사했습니다. 해마에서 MiR-124-5p, HDAC1 및 NPY 발현을 테스트했습니다. miR-124-5p, HDAC1 및 NPY 발현의 상호작용도 확인되었다. 우울한 쥐의 해마에서 더 높은 miR-124-5p와 HDAC1과 더 낮은 NPY 발현 수준이 발견되었습니다. miR-124-5p를 억제하거나 HDAC1을 억제하면 학습 및 기억 능력이 약화되고 우울한 쥐의 체중이 증가합니다. miR-124-5p의 녹다운 또는 HDAC1의 억제는 산화 스트레스와 염증을 억제하고 우울한 쥐의 신경 전달 물질 발현을 촉진했습니다. HDAC1은 miR-124-5p를 매개하여 NPY를 조절합니다. NPY의 녹다운은 우울한 쥐에 대한 억제된 miR-124-5p의 보호 효과를 폐지했습니다. 우리의 연구는 miR-124-5p 또는 HDAC1의 억제가 NPY를 상향 조절하여 우울한 쥐의 기억과 학습 능력을 향상시키며, 이는 우울증에 대한 기존 지식을 업데이트하고 우울증 치료를 위한 새로운 참고 자료를 제공할 수 있음을 보여줍니다.
우울증은 전 세계적으로 심각한 경제적 부담과 사회적 결과를 초래하는 중증 장애 정신병을 말합니다[1]. 우울증은 환자의 전반적인 건강을 위협하는 생리적, 인지적, 행동적 변화가 특징입니다[2]. 우울증에 접근할 수 있는 치료법은 케타민을 속효성 항우울제로 적용하고 신경 아형 집단의 활동을 선택적으로 수용할 수 있는 장비의 개선으로 개발되었습니다[3]. 또한, 카본 도트와 같은 다용도 나노 아키텍처는 신경 장애에 적용할 수 있습니다[4]. 그러나 우울증에 대한 부적절한 치료는 수행 능력 저하, 행동 장애, 신체 질환, 약물 남용 및 심지어 자살을 초래할 수 있습니다[5]. 따라서 우울증 치료에 있어 혁신적인 약제를 발견하는 것이 절실히 필요합니다.
우울증 및 항우울제와 함께 혈장에서 microRNA(miR)-124 수준이 상승하는 것으로 이전에 문서화되었습니다[6]. 만성 예측할 수 없는 가벼운 스트레스(CUMS) 유발 우울증 동안 해마에서 miR-124 발현은 동적 변화를 보여 우울증의 여러 단계에서 다양한 병리학적 변화를 나타냅니다[7]. 또한 miR-124는 주요우울장애에서 우울과 유사한 행동을 개선할 수 있는 후보물질이다[8]. 또한 miR-124 억제는 전전두엽 피질에서 항우울제로 작용하는데, 이는 생쥐의 약화된 우울증 유사 행동에 반영됩니다[9]. 히스톤 데아세틸라제 1(HDAC1)은 miR-124[10]의 매개체로 전사 조절 및 후성 유전적 변형[11]을 위한 다중 단백질 복합체를 형성합니다. 우리가 아는 한, HDAC1 활동의 손상은 주요 우울 장애에서 회복력을 촉진합니다[12]. 또한 뇌에서 HDAC1을 억제하면 기분 장애 및 기타 신경가소성 변화 뇌 질환을 개선할 수 있습니다[13]. HDAC 억제제는 불안과 같은 알코올 섭취 행동을 약화시키고 신경 펩티드 Y(NPY) 발현을 증가시킬 수 있습니다[14]. 또한 HDAC 활성 장애는 편도체의 중심핵과 편도체의 내측 핵에서 NPY 발현을 증가시킬 수 있습니다[15]. NPY는 불안, 사회 장애 및 우울 증상을 예방하기에 충분한 시상하부 오식성 신경 펩티드이다[16]. 그 외에도 NPY와 그 수용체는 지질다당류에 의해 유발된 우울증 쥐 모델에 항염증 및 항우울 효과를 부여하는 것으로 입증되었습니다[17]. 종합하면 우울증에서 HDAC1/miR-124-5p/NPY 축의 결합된 상호 작용은 모호합니다. 따라서 본 연구는 이 축의 기전을 규명하여 우울증 치료제 후보물질을 규명하고자 한다.
본 연구에 참여한 동물 실험은 하얼빈 의과대학 제1부속병원의 실험동물윤리 요건을 준수하였다. 실험은 실험 동물의 먹이 조건을 개선하고 사용 동물의 수를 줄이며 동물의 고통을 완화하기 위해 최적화되었습니다.
Sprague-Dawley(SD) 수컷 쥐는 체중이 200-220g인 SPF(특정 병원균이 없음) 등급으로 Harbin Medical University(중국 하얼빈) 부속 병원의 동물 연구 센터에서 제공되었습니다. 쥐는 SPF 등급 환경(22–24 °C, 60–64% 습도, 12시간 명암 주기)에서 유지되었습니다. 모델링 기간 및 기타 특정 시점을 제외하고 쥐는 물과 음식을 자유롭게 얻을 수 있었습니다.
모델링된 쥐를 무작위로 8개 그룹으로 나누었습니다(n =10):정상군(무처리 쥐), CUMS 군(CUMS 유발 우울증 쥐), sh-음성 대조군(NC) 그룹(sh-HDAC1 렌티바이러스 NC를 주사한 CUMS 유도 우울증 쥐), sh-HDAC1 군 (sh-HDAC1 렌티바이러스를 주사한 CUMS 유발 우울증 쥐), anti-miR-NC 그룹(안티-miR-124-5p 렌티바이러스 NC를 주사한 CUMS 유도 우울증 쥐), anti-miR-124-5p 그룹(CUMS- anti-miR-124-5p lentivirus를 주사한 유도 우울증 쥐), anti-miR-124-5p + sh-NC군 , 및 anti-miR-124-5p + sh-NPY 그룹(항-miR-124-5p 렌티바이러스 및 sh-NPY 렌티바이러스를 주사한 CUMS 유도 우울증 쥐).
CUMS 유발 우울증 쥐 모델은 Willner의 방법에 의해 확립되었습니다[18]. 정상 그룹의 쥐에게는 자극 없이 음식과 물이 공급되었고 다른 7개 그룹의 쥐는 독립된 우리에서 35일 동안 CUMS를 받았습니다. 이 쥐들은 용기(수심 30cm)에서 4°C에서 5분 동안 얼음물 수영, 낮과 밤 반전(낮에는 12시간 동안 어둠 속에서, 그리고 빛이 비치는 밝은 공간에 머무르는 쥐)에 의해 자극되었습니다. 야간에는 백열등 12시간 동안), 스왈로우 테일 클립으로 30초 동안 꼬리 고정, 1분 흔들기, 24시간 금식 및 물 부족, 30분 초음파 자극(50Hz), 습식 패딩 및 에어컨 17℃에서. 쥐는 매일 이러한 자극 중 하나에 의해 무작위로 자극되었으며 동일한 자극은 총 5회 이하로 적용되었습니다.
쥐는 2% pentobarbital sodium(50 mg/kg)으로 마취되었고 양측 해마(전후부 직경 =4.8 mm, 중앙외측 거리 =± 2.5 mm, 후방강과 전방 천문 사이의 거리 =)는 3.5 mm에서 렌티바이러스를 주사하였다. 26-G 바늘이 있는 Hamilton 마이크로 주사기로 μL/min. 역류를 방지하기 위해 주사바늘을 주사 부위에 5분 동안 두었다. 두개골은 뼈 왁스로 봉합하고 절개는 봉합한 후 7일 동안 쥐를 회복시켰다[19]. sh-HDAC1 렌티바이러스 및 이의 NC, 항-miR-124-5p 렌티바이러스 및 이의 NC, 뿐만 아니라 sh-NPY 및 이의 NC(역가:10 8 TU/mL)는 GenePharma Co. Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다.
CUMS 모델링 전날(0일), CUMS 모델링 후(36일), 렌티바이러스 간섭 후(52일)에 쥐의 체중을 측정했습니다.
개방형 필드 테스트(OFT)는 우울 행동을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 새로운 환경에서 쥐의 자율 및 탐색 행동을 감지할 수 있습니다. 이 테스트는 쥐의 활동을 기록하기 위해 열린 필드 상자 위에 비디오 추적 시스템이 배치된 검은색 나무 야외 상자(100cm × 100cm × 50cm)에서 수행되었습니다. 열린 상자의 바닥은 흰색 선으로 25개의 격자(20cm × 20cm)로 나뉩니다. 쥐를 미리 정의된 무작위 순서로 중앙 격자에 배치하고 격자를 가로지르는 양(쥐가 한 쪽 뒷다리로 팔다리 또는 이중 앞다리가 있는 격자로 들어가는 경우) 및 양육 빈도(앞다리를 들어 올리고 한쪽으로 똑바로 서 있는 쥐) 뒷다리)는 비디오 추적 시스템에 의해 기록되었습니다. 이 테스트는 조용하고 어두운 실내 환경에서 수행되었습니다. 모든 테스트가 끝나면 오픈 필드 박스를 75% 알코올로 청소하여 냄새를 제거했습니다.
무쾌감증은 우울증의 중요한 증상 중 하나였습니다. 자당 선호도 테스트(SPT)는 쥐의 우울한 행동을 평가할 수 있습니다. SPT 전에 각 쥐에게 24시간 동안 2병의 설탕물(1% sucrose, w/w)을 제공하고 추가 24시간 동안 멸균수 1병과 설탕물 1병을 제공했습니다. 그 후, 쥐의 자당 선호도 백분율(SPP)은 다음과 같이 검출되었습니다:23시간 금식 및 물 부족 후, 쥐에게 멸균수 1병과 설탕수(1% 자당) 1병을 30분 동안 허용했습니다. 1시간 후, 두 병의 위치를 반대로 하고 쥐에게 이 두 병을 추가로 30분 동안 자유롭게 했습니다. 이 1시간 동안 이 두 병의 멸균수와 설탕수(1% 자당)의 소비량(mL)을 측정하고 SPP를 계산했습니다. SPP =설탕수 사용량/(설탕수 사용량 + 멸균수 사용량) × 100%.
Morris water maze test(MWM)는 쥐의 공간 학습과 기억 능력을 평가하기 위해 널리 적용되었습니다. MWM 테스트는 수심 40cm의 원형 물탱크(직경 150cm, 높이 60cm)에서 수행되었습니다. 수온은 22 ± 1 °C로 유지되었고 물은 무독성이며 세척이 쉬운 염료로 검은색으로 염색되었습니다. 탱크와 수면은 4개의 사분면(SE, SW, NW 및 NE 사분면)으로 나뉘었으며 각 사분면은 내부 벽에 밝은 색상과 특별한 모양의 해당 아이콘으로 장식되었습니다. 목표 플랫폼은 NE 사분면 중앙에 위치한 원형 투명 플랫폼(직경 11cm)으로 수면 아래 1.5cm에 잠겨 있습니다. 비디오 추적 시스템을 탱크 중앙 위에 설치하여 수영 속도, 경로 및 쥐가 대상 플랫폼에 들어가 사분면에서 수영하는 데 소요된 시간을 기록했습니다. 쥐를 무작위 순서로 4개의 사분면에서 물에 넣고 60초 이내에 대상 플랫폼을 탐색하고 탑승하도록 허용했습니다. 래트가 플랫폼에 탑승하는 데 걸린 시간을 탈출 대기 시간으로 기록했습니다. 쥐가 60초 이내에 대상 플랫폼에 탑승하지 못하면 안내하고 탈출 대기 시간을 60초로 기록했습니다. 각 테스트 후, 쥐는 15초 동안 표적 플랫폼에 머물도록 하고 쥐는 5일 동안 하루에 4번 훈련되었습니다. 최종 탈출 지연은 3~5일 탈출 지연의 평균이었다. MWM 테스트 6일차에는 우주탐사 테스트가 진행됐다. 목표 플랫폼을 물 탱크에서 제거하고 쥐가 SW 사분면에서 물에 들어갔습니다. 60초 이내에 NE 사분면에서 쥐가 헤엄치는 시간을 우주탐사 시간으로 기록했습니다.
이 실험의 타임라인은 그림 1에 나와 있습니다.
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본 연구의 연대기
마지막 MWM 테스트 하루 후, 쥐를 안락사시키고 2% 펜토바르비탈 나트륨(50 mg/kg)을 복강 내 주사했습니다. 흉강을 열어 심장혈액을 주사기로 채취한 후 3500 r/min의 속도로 15분간 3회 원심분리한 후 상층액을 -20 °C에 보관하였다. 채혈 후 좌심실에서 대동맥까지 카테터를 삽입하고 생리식염수 500mL를 관류하여 전혈을 플러싱하였다. 해마 조직을 분리하고 1.5mL 원심분리기 튜브에 넣고 무게를 재고 -80°C에서 보관했습니다. 해마의 일부를 4% 파라포름알데히드로 2시간 동안 고정하고 그래디언트 자당으로 탈수하고 파라핀에 포매했습니다.
혈청은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), malondialchehyche(MDA), 글루타티온(GSH), 인터루킨(IL)-β, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 산화질소(NO) 농도의 검출을 위해 재가온되었습니다. SOD, MDA 및 GSH 검출용 키트는 Beyotime Institute of Biotechnology(중국 상하이)에서 제공한 반면, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석) 키트는 NanJing JianCheng Bioengineering Institute에서 IL-β, TNF-α 및 NO 검출용 키트를 제공했습니다. 중국 난징).
파라핀 절편을 탈랍하고, 에탄올로 수화하고, 증류수로 헹구고, 헤마톡실린 염색 용액으로 20분 동안 염색하였다. 그 후, 섹션이 파란색으로 변할 때까지 섹션을 수돗물로 헹구었습니다. 그런 다음 절편을 1% 에탄올성 염산 용액에 10초 동안 넣고 수돗물로 헹구고 에탄올로 탈수한 후 에오신에서 2분간 염색하고 고농도 알코올로 탈수하고 자일렌에서 투과화시켰다. 마지막으로 섹션을 밀봉하고 생물학적 현미경으로 관찰했습니다.
해마 조직의 무게를 측정하고 생리 식염수(100μL/10mg)에서 초음파로 균질화했습니다. 균질액을 4°C에서 30분 동안 유지하고, 12,000 rpm(4°C)에서 3분 동안 원심분리하여 상등액을 수집했습니다. 상등액의 단백질 농도는 bicinchoninic acid(BCA) protein detection kit(CWBIO, Beijing, China)로, 노르에피네프린(NE), 세로토닌(5-HT), 도파민(DA) 발현량은 ELISA kit로 측정하였다. NE, 5-HT 및 DA ELISA 키트는 Liweiping Biotechnology Co., Ltd.(중국 베이징)에서 제공했습니다.
RNA 추출 키트(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 해마 조직에서 RNA를 추출하고, 자외선 분광광도계로 RNA의 농도 및 순도를 검출하였다. 역전사 키트 지침(DRR047S, Takara, Dalian, China)에 따라 상보적 DNA(cDNA)로의 RNA 역전사를 수행했습니다. mRNA는 GoldScript one-step RT-PCR Kit(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)에 의해 cDNA로 역전사되었고, miRNA는 Hairpin-it™ miRNA 정량 검출 키트(GenePharma)에 의해 전사되었습니다. RT-qPCR 검출 키트(Promega)를 적용하여 조직에서 HDAC1, miR-124-5p 및 NPY 발현을 검출했습니다. U6은 miR-124-5p에 대한 내부 대조군으로 표시되었고 HDAC1 및 NPY에 대해서는 β-액틴이 표시되었습니다. PCR 프라이머는 Sangon Biotech Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 입수했습니다(표 1). 타겟 유전자의 상대적인 발현은 2 -△△ 로 계산하였다. CT 방식.
해마 조직을 얼음 위에서 조각으로 자르고 radio-immunoprecipitation assay lysate(Beijing Solarbio Science &Technology Co. Ltd., Beijing, China)로 용해하여 단백질을 추출하였다. 단백질 농도는 BCA 방법에 의해 결정되었습니다. 총 단백질(50μg)에 5 × 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 로딩 완충액을 1:4로 첨가하고 끓는 수조에서 5분 동안 가열했습니다. 그런 다음, 단백질을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용하고 멤브레인에 전기 블로팅하고 1시간 동안 5% 우유로 차단했습니다. 그 후 HDAC1(1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), NPY(1:800, NeoMakers, Fremont, California, USA) 및 β-actin(1:1000, Abcam, Cambridge, MA, UK) 밤새도록, 양고추냉이 퍼옥시다아제로 표지된 이차 항체로 재탐침하였다. 멤브레인은 향상된 화학 발광에 의해 개발되었으며 광학 밀도는 Quantity One 회색 분석 소프트웨어에 의해 계산되었습니다. 표적 유전자의 단백질 발현은 β-actin gray 값에 대한 gray 값의 비율로 표현하였다.
ChIP 분석은 EZ-ChIP 키트(Millipore, Bedford, MA, USA)의 지침에 따라 수행되었습니다. HEK293T 세포를 1% 포름알데히드와 함께 10분 동안 인큐베이션하고 글리신으로 종결시켰다. 그런 다음, 세포를 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 초음파 처리를 위해 SDS Lysis Buffer를 첨가했습니다. 10,000g에서 4℃에서 10분간 원심분리한 세포(100μL)를 900μL ChIP Dilution Buffer, 20μL의 50 × PIC 및 60μL ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA를 4℃에서 1시간 동안 반응시키고, 10분 동안 방치하였다. 침전물을 20 μL을 입력으로 사용하여 1분 동안 700 rpm에서 원심분리했습니다. HDAC1 항체(1μL) 및 면역글로불린 G 항체가 있는 튜브를 추가하고 항체가 없는 다른 튜브를 추가했습니다. 2개의 튜브에 있는 샘플을 밤새 인큐베이션하고, 용리하고, 탈가교시켰다. DNA 검색 후 샘플을 RT-qPCR로 테스트했습니다.
생물정보학 웹사이트(https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/)는 miR-124-5p와 NPY의 결합 부위를 분석했다. NPY-야생형(WT) 및 NPY-돌연변이(MUT) 플라스미드는 Huayueyang Biotechnology Co., Ltd.(Beijing, China)에 의해 생성되었습니다. 모방 NC 또는 miR-124-5p 모방과 결합하여 플라스미드를 HEK293T 세포로 형질감염시켰다. 세포 루시퍼라제 활성은 루시퍼라제 검출 키트(BioVision) 및 Glomax20/20 루미노미터(Promega)로 측정했습니다.
데이터 분석에는 SPSS 21.0 통계 소프트웨어(IBM Corp. Armonk, NY, USA)를 사용했습니다. 결과는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 두 그룹 간의 비교는 t에 의해 테스트되었습니다. 테스트. 여러 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석(ANOVA)으로 평가한 후 Tukey의 사후 검정으로 쌍대 비교를 수행했습니다. 피 양면 테스트 및 P를 나타냄 <0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다.
<섹션 데이터-제목="결과">CUMS 모델링 1일 전(0일), 모델링 중단 1일(36일) 및 렌티바이러스 간섭 7일 후(52일) 래트의 체중을 측정했습니다. 모델링 전 각 그룹에서 쥐의 체중에는 차이가 감지되지 않았습니다(모든 P> 0.05). 모델링 후 쥐의 체중은 정상 그룹에 비해 CUMS 그룹, sh-NC 그룹, sh-HDAC1 그룹, anti-miR-NC 그룹 및 anti-miR-124-5p 그룹에서 감소했습니다(모두 P <0.05). CUMS 그룹, sh-NC 그룹, sh-HDAC1 그룹, anti-miR-NC 그룹 및 anti-miR-124-5p 그룹(모두 P> 0.05). 간섭 후, CUMS 그룹에서 정상 그룹에 비해 쥐 체중이 감소했습니다(모든 P <0.05). CUMS 그룹, sh-NC 그룹 및 anti-miR-NC 그룹(모두 P> 0.05). 쥐의 체중은 NC 그룹에 비해 sh-HDAC1 그룹과 anti-miR-124-5p 그룹에서 증가했습니다(둘 모두 P <0.05), HDAC1 또는 miR-124-5p의 억제가 우울한 쥐의 체중을 증가시켰음을 나타냅니다(그림 2a).
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HDAC1 또는 miR-124-5p를 억제하면 체중이 증가하고 우울한 쥐의 학습 및 기억 능력이 향상됩니다. 아 우울증 쥐의 체중에 대한 HDAC1 또는 miR-124-5p 억제 효과; ㄴ HDAC1 또는 miR-124-5p에 의한 억제 전후의 SPP; ㄷ HDAC1 또는 miR-124-5p 억제 전후 OFT에서 격자를 가로지르는 빈도; d HDAC1 또는 miR-124-5p에 의한 억제 전후 OFT의 양육 빈도; 이 HDAC1 또는 miR-124-5p를 사용한 억제 전후의 MWM 테스트에서 탈출 대기 시간; 에 HDAC1 또는 miR-124-5p 억제 전후 MWM 테스트의 공간 탐색 시간; n =10; 피 정상 그룹과 비교하여 <0.05; b 피 sh-NC 그룹과 비교하여 <0.05; c 피 항-miR-NC 그룹과 비교하여 <0.05. 여러 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석에 의해 평가되었고 쌍대 비교는 Tukey의 사후 검정에 의해 평가되었습니다.
SPT, OFT 및 MWM 테스트를 적용하여 SPP, 그리드 교차 빈도 및 양육 빈도, 탈출 대기 시간 및 우주 탐사 시간을 감지했습니다. 간섭 전(그림 2b-f)은 일반 그룹인 SPP와 비교하여 그리드 교차 빈도, 양육 빈도 및 우주 탐사 시간이 감소한 반면 CUMS 그룹인 sh-NC에서는 탈출 대기 시간이 연장되는 것으로 요약되었습니다. 그룹, sh-HDAC1 그룹, anti-miR-NC 그룹 및 anti-miR-124-5p 그룹(모두 P <0.05), 쥐에서 우울증과 유사한 행동의 발달을 시사합니다. CUMS군, sh-NC군, sh-HDAC1군, anti-miR-NC군, anti-miR-124군 사이에 SPP, 그리드 교차빈도, 양육빈도, 우주탐사시간, 도주지연에서는 차이가 없었다. -5p 그룹(모든 P> 0.05). 간섭 후, sh-NC 그룹 및 anti-miR-NC 그룹, SPP에 비해 그리드 교차 빈도, 양육 빈도 및 우주 탐사 시간이 증가하는 반면 sh-HDAC1 그룹 및 anti-miR-124-그룹에서 탈출 대기 시간이 단축됨 5p 그룹(모두 P <0.05). CUMS군, sh-NC군, anti-miR-NC군 사이에 SPP, 격자교차 빈도, 사육 빈도, 우주탐사시간, 탈출 대기시간에 차이가 없었다(모두 P> 0.05), HDAC1의 억제 또는 miR-124-5p의 억제가 우울증과 유사한 행동을 약화시키고 쥐의 학습 및 기억 능력을 향상시킬 수 있음을 시사합니다.
HE 염색으로 해마 병변을 관찰한 결과(Fig. 3a), 정상군 쥐의 해마에서 깔끔하게 배열된 뉴런은 명확한 형태, 정상적인 구조, 조밀한 층, 명확한 세포핵 및 명백한 핵소체를 보였다. CUMS 그룹의 쥐의 뉴런은 수축되고 수는 감소했으며 불균일하게 분포된 염색질과 얇은 층으로 느슨하게 배열되었습니다. sh-NC 및 anti-miR-NC 그룹의 쥐는 CUMS 그룹과 동일한 상황을 보였다. sh-HDAC1 및 anti-miR-124-5p 그룹의 쥐는 NC 그룹과 비교하여 순서대로 신경 세포가 증가하고 손상이 감소했습니다. HDAC1을 녹다운하거나 miR-124-5p를 억제하면 우울한 쥐의 해마 병변이 완화되는 것으로 나타났습니다.
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HDAC1 또는 miR-124-5p의 억제는 병적 해마 손상을 약화시키고 우울한 쥐에서 신경 전달 물질 발현을 상향 조절합니다. 아 우울한 쥐의 해마 병변의 H 염색; ㄴ 해마 조직에서 NE 발현의 ELISA; ㄷ 해마 조직에서 5-HT 발현의 ELISA; d 해마 조직에서 DA 발현의 ELISA; n =6; 피 정상 그룹과 비교하여 <0.05; b 피 sh-NC 그룹과 비교하여 <0.05; c 피 항-miR-NC 그룹과 비교하여 <0.05. 여러 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석에 의해 평가되었고 쌍대 비교는 Tukey의 사후 검정에 의해 평가되었습니다.
우울증은 뇌 신경 전달 물질 장애와 관련이 있습니다. 따라서 쥐 해마에서 DA, NE 및 5-HT 신경 전달 물질의 수준을 ELISA로 측정했습니다. 결과는 대조적으로 정상 그룹의 경우 (그림 3b-d) CUMS 그룹, sh-NC 그룹, sh-HDAC1 그룹, anti-miR의 쥐에서 DA, NE 및 5-HT의 감소 된 수준이 발견되었음을 나타냅니다. -NC 그룹 및 anti-miR-124-5p 그룹(모두 P <0.05). CUMS 그룹, sh-NC 그룹 및 anti-miR-NC 그룹(모두 P> 0.05). sh-NC 및 anti-miR-NC 그룹과 비교하여 DA, NE 및 5-HT 수준은 sh-HDAC1 및 anti-miR-124-5p 그룹의 쥐에서 증가했습니다(모든 P <0.05), HDAC1의 하향 조절 또는 miR-124-5p의 감소가 우울한 쥐의 해마에서 DA, NE 및 5-HT의 수준을 상향 조절할 수 있음을 암시합니다.
혈청 내 산화 스트레스 관련 및 염증 인자 발현을 측정하였다. 정상군과 관련하여 SOD 및 GSH 활성이 손상된 반면, 다른 우울증 모델군에서는 MDA, IL-1β, TNF-α 및 NO 수준이 증가했습니다(모두 P <0.05). CUMS군, sh-NC군, anti-miR-NC군의 SOD, GSH 활성, MDA, IL-1β, TNF-α, NO의 농도는 차이가 없었다(모든 P> 0.05). sh-NC군 및 anti-miR-NC군과 관련하여 SOD 및 GSH 활성이 증가하였고 sh-NC군에서 MDA, IL-1β, TNF-α 및 NO 수준의 감소가 관찰되었다. HDAC1 그룹 및 anti-miR-124-5p 그룹(모두 P <0.05) (그림 4a-f), HDAC1의 고갈 또는 miR-124-5p의 하향 조절이 우울한 쥐의 산화 스트레스와 염증을 완화할 수 있음을 나타냅니다.
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HDAC1 또는 miR-124-5p의 억제는 우울한 쥐의 산화 스트레스와 염증을 억제합니다. 아 –ㄷ 우울한 쥐의 혈청에서 SOD, MDA 및 GSH 농도에 대한 HDAC1 또는 miR-124-5p 억제 효과; d –f 우울한 쥐의 혈청에서 IL-1β, TNF-α 및 NO 농도에 대한 HDAC1 또는 miR-124-5p 억제 효과; n =10; 피 정상 그룹과 비교하여 <0.05; b 피 sh-NC 그룹과 비교하여 <0.05; c 피 항-miR-NC 그룹과 비교하여 <0.05. 여러 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석에 의해 평가되었고 쌍대 비교는 Tukey의 사후 검정에 의해 평가되었습니다.
해마에서 HDAC1, miR-124-5p 및 NPY의 검출을 위해 RT-qPCR 및 웨스턴 블롯 분석이 채택되었습니다. (그림 5a, b) 정상 그룹에 비해 HDAC1과 miR-124-5p는 증가하고 NPY는 CUMS 그룹에서 감소하는 것으로 설명되었습니다(모든 P <0.05). HDAC1, miR-124-5p, NPY 발현은 CUMS군과 sh-NC군에서 차이가 없었다(모두 P> 0.05). sh-NC 그룹에 비해 sh-HDAC1 그룹은 HDAC1 및 miR-124-5p 감소 및 NPY 발현 수준 증가에 의해 반영되었습니다(모든 P <0.05). 위의 결과는 성공적인 렌티바이러스 간섭과 miR-124-5p와 HDAC1 발현 사이의 긍정적인 관계를 시사합니다.
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HDAC1은 miR-124-5p를 매개하여 NPY를 조절합니다. 아 RT-qPCR에 의한 HDAC1 억제 후 해마 조직에서 HDAC1, miR-124-5p 및 NPY mRNA 발현(n =6); ㄴ 웨스턴 블롯 분석에 의한 HDAC1 억제 후 해마 조직에서 HDAC1 및 NPY 단백질 발현(n =6); ㄷ RT-qPCR에 의한 miR-124-5p 억제 후 해마 조직에서 MiR-124-5p 및 NPY mRNA 발현(n =6); d 웨스턴 블롯 분석에 의한 miR-124-5p 억제 후 해마 조직에서 NPY 단백질 발현(n =6); 피 정상 그룹과 비교하여 <0.05; c 피 sh-NC 그룹과 비교하여 <0.05. 여러 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석에 의해 평가되었고 쌍대 비교는 Tukey의 사후 검정에 의해 평가되었습니다.
또한 miR-124-5p 억제 후 miR-124-5p 및 NPY 발현이 검출되어 정상군과 관련하여 miR-124-5p 상승 및 NPY 감소가 나타남을 입증하는 결과(그림 5c, d) CUMS 그룹(둘 다 P <0.05). 반대로, anti-miR-124-5p 그룹은 anti-miR-NC 그룹에 비해 miR-124-5p가 감소하고 NPY가 증가하는 경향을 보였습니다(둘 다 P <0.05). CUMS군과 anti-miR-NC군에서 miR-124-5p와 NPY 발현에 차이가 발견되지 않았다(P> 0.05). 결과는 성공적인 렌티바이러스 간섭과 NPY와 miR-124-5p 사이의 부정적인 연결을 나타냅니다.
ChIP 분석은 HDAC1이 miR-124-5p 프로모터에 결합할 수 있는지 여부를 테스트하기 위한 것으로, 그 결과(그림 6a, b) HDAD1이 miR-124-5p 프로모터에만 관련됨(P> <0.001), HDAC1이 miR-124-5p를 직접 조절할 수 있음을 나타냅니다.
<그림>
HDAC1은 miR-124-5p의 프로모터에 결합합니다. 아 ChIP 분석에 의한 HEK293T 세포의 HDAC1 및 miR-124-5p 프로모터 영역의 결합 풍부도(n =3); ㄴ ChIP 분석에 의한 HEK293T 세포의 HDAC1 및 관련 없는 유전자간 영역의 결합 풍부도(n =3); ㄷ 생물학적 정보 소프트웨어 웹사이트에 의한 MiR-124-5p 및 NPY 결합 부위; d 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석에 의한 miR-124-5p와 NPY 간의 표적화 관계(n = 3); Comparisons between two groups were tested by t test
The targeting relationship between miR-124-5p and NPY was predicted and verified through RNA22 tool and dual luciferase reporter gene assay (Fig. 6c, d). With respect to the cells co-transfection with NPY-3′UTR-WT and mimic NC, the cells with co-transfection of NPY-3′UTR-WT and miR-124-5p mimic showed impaired luciferase activity (P < 0.05). No difference was recognized in the luciferase activity in the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and mimic NC, and the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and miR-124-5p mimic (P > 0.05).
Spontaneous depletion of NPY and miR-124-5p was programmed to explore their interplay in depressed rats. It was exhibited that (Fig. 7a, b) lower NPY expression level was noticed in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (P < 0.05). Body weight and behavioral function tests illustrated that (Fig. 7c–f) by comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group presented reduced weight, SPP, frequency of crossing the grid, incidence of rearing and space exploration time with increased escape latency (all P < 0.05). HE staining of the hippocampal lesions pictured that (Fig. 8a) in comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the number of hippocampal neurons was reduced, and hippocampal neurons were darkly stained, sparsely and disorderly arranged in an irregular shape with reduced cell layers in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group. Moreover, versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group was accompanied by reduced DA, NE and 5-HT (all P < 0.05) (Fig. 8b). Besides, impaired SOD and GSH activities, and increased MDA, IL-1β, TNF-α and NO levels existed in the rats of the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (all P < 0.05) (Fig. 8c, d). Collectively, knockdown of NPY abolished the protective effects of repressed miR-124-5p on depressed rat.
Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on body weight and behavioral function of depressed rats. 아 MiR-124-5p and NPY mRNA expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by RT-qPCR (n = 6); ㄴ NPY protein expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by western blot analysis (n = 6); ㄷ Body weight of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); d SPP of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); 이 Frequency of crossing the grid and incidence of rearing after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); 에 Escape latency and space exploration time after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); Comparisons between two groups were tested by t test
Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on hippocampal damages of depressed rats. 아 HE staining of hippocampal lesions of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 6); ㄴ ELISA of NE, 5-HT and DA expression in hippocampal tissues of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 6); C. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on SOD, MDA and GSH concentration in serum (n = 10); D. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on IL-1β, TNF-α and NO concentration in serum (n = 10). Comparisons between two groups were tested by t test
Depression is a type of psychiatric disorder comprising a variety of conditions with diverse symptoms [20]. Though emerging studies have implied the role of miRNAs in depression, the precise action of miR-124-5p has been rarely investigated. Hence, the present study is projected for better comprehension of the mechanism of miR-124-5p/HDAC1/NPY axis in depression with the major outcome elaborating that silencing of either HDAC1 or miR-124-5p up-regulated NPY to improve memory and learning abilities of depressed rats.
To begin with, this study discovered HDAC1 expression in hippocampal tissues with the findings suggesting the elevation in the HDAC1 expression. Subsequently, with the purpose to decipher the functional roles of HDAC1 in depressed rats, loss-of-function assays were performed and it was disclosed that knockdown of HDAC1 increased the body weight, improved learning and memory abilities, attenuated pathological damage, up-regulated neurotransmitter expression, and suppressed oxidative stress and inflammation in depressed rats. Currently, a study has implied an increment in the expression of HDAC1 in depressive-like and anxiety-like phenotypes resulted by stress-offspring [21]. Moreover, the expression of HDAC1 is documented to up-regulate in penumbra in photothrombotic stroke [22]. Besides that, the incremental HDAC1 mRNA expression is found in granule and pyramidal cells in temporal lobe epilepsy [23]. As to the functional role of HDAC1, it has been reported that virus-mediated overexpression of neuronal HDAC1 in the hippocampus of mice imposes influences on loss of contextual fear memory in particular [24]. Mechanically, HDAC inhibitors reverse cognitive deficits found in neurodegenerative diseases and age-related memory loss [25]. Actually, it is accepted that the HDAC1 suppression by tianeptinaline has advanced neuroplasticity and reinforced memory [26]. As mentioned in a prior study, it is concluded that repression of HDAC1 inhibits the pathogenic processes that lead to motor neuron degeneration in mitochondrial diseases [27]. Experimentally, the silencing of HDAC1 by 5-thienyl-substituted 2-aminobenzamide-type is partially involved in the prevention of neuronal cell death in Parkinson's disease models [28]. Further supported by those researches, the protective effects of silenced HDAC1 have been witnessed in brain diseases, including but not limited to depression.
Then, our study discovered a targeting relationship between HDAC1 and miR-124-5p, which was supported by a prior study which suggests miR-124 transcription is in the charge of EVI1, acting by connection with the deacetylase HDAC1 [29]. miR-124-5p was the overexpressed gene in depressed rats and knockdown of miR-124-5p had the similar functions of silenced HDAC1 in depressed rats. In fact, there is a study indicating that the expression of miR-124 in the hippocampus is up-regulated from 5 to 6 weeks in depression-like behavior phenotypes [7]. Another study has identified the increase in the miR-124 expression in female with cocaine use disorder [30]. Also, it is previously described that miR-124-3p is highly expressed in stressed rodents in major depressive disorder [31]. Regarding to the effects, knockdown of miR-124 in the prefrontal cortex is reported to attenuate depression-like behavior of mice [9]. Besides that, miR-124 knockdown is believed to serve as an antidepressant agent of chronic corticosterone-induced gypenosides in mice [32]. Drawn from a prior study, knockdown of miR-124 can result in improved behavioral susceptibility to a milder stress paradigm [33]. It is reported that suppression of miR-124 by lentivirus transfection in the hippocampus can protect ketamine-induced neurodegeneration in vivo and in vitro [34]. Anyway, miR-124-5p suppression is an active actor to attenuate depression.
Furthermore, NPY expression was verified to be regulated by HDAC1 and miR-124-5p. The deteriorated deficits associated with HDAC2 in histone acetylation may be related to the decreased expression of NPY and can used to control anxiety-like and drinking behaviors [14]. NPY was down-regulated in depressed rats and up-regulation of NPY promoted learning and memory ability recovery in depressed rats. In the development of depressive-like behaviors, the rat models are manifested with reduced NPY expression [17]. Academically, the expression of NPY is evidenced to decline in mice with depression [35]. Consistently, the above-mentioned study findings are as same as the previous literature to some extent.
The novel findings of study suggested that inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities and increased body weight of depressed rats. In addition, knockdown of miR-124-5p or inhibition of HDAC1 suppressed oxidative stress and inflammation and promoted neurotransmitter expression of depressed rats. Moreover, HDAC1 mediated miR-124-5p to regulate NPY. In the rescue experiments, knockdown of NPY abolished the protective effects of inhibited miR-124-5p on depressed rats.
In summary, this study highlighted the effect of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression with the major findings suggesting inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities, increased body weight, suppressed oxidative stress and inflammation, as well as promoted neurotransmitter expression in depressed rats. HDAC1/miR-124-5p/NPY axis may provide a reference to treat neurological disorder, which may also update the existed knowledge of depression. However, further studies are still required for thorough comprehension of the complex mechanism of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression.
Not applicable.
MicroRNA-124-5p
Histone deacetylase 1
Neuropeptide Y
Chronic unpredictable mild stress
Sprague–Dawley
Specific pathogen-free
Negative control
Open field test
Sucrose preference test
Sucrose preference percentage
Morris water maze test
Superoxide dismutase
Malondialchehyche
글루타치온
Interleukin-β
Tumor necrosis factor-α
Nitric oxide
Enzyme-linked immunosorbent assay
Hematoxylin–eosin
Bicinchoninic acid
Norepinephrine
Serotonin
Dopamine
Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction
Complementary DNA
Sodium dodecyl sulfate
Chromatin immunoprecipitation
Untranslated region
Mutant type
Wild type
One-way analysis of variance
나노물질
초록 고품질 Sn(IV) 도핑된 CdS 나노와이어는 열 증발 경로에 의해 합성되었습니다. XRD 및 Raman 산란 스펙트럼 모두 도핑 효과를 확인했습니다. 실온 광발광(PL)은 근방 밴드갭 방출과 이산 포획 상태 방출이 동시에 현저하게 나타남을 보여주었으며, 이는 광 수송 동안 불순물 및 전자-포논 결합에 의한 강한 여기자 포획에 기인합니다. 트랩된 상태 방출에 대한 니어 밴드갭 방출의 PL 강도 비율은 CdS 나노와이어에서 도핑된 Sn(IV) 농도를 통해 조정할 수 있습니다. 트랩된 상태 방출이 1LO, 2LO, 4LO 포논의
초록 자궁경부암(CC)에서 긴 비암호화 RNA(lncRNA)의 역할이 제시되었습니다. 우리는 성 결정 영역 Y-box 2(SOX2)/lncRNA 결장암 관련 전사체-1(CCAT1)/microRNA-185-3p(miR-185-3p)/forkhead box protein 3(FOXP3)의 효과에 대해 논의하는 것을 목표로 합니다. ) CC 줄기 세포의 증식 및 자가 재생 능력에 관한 것입니다. MiR-185-3p, SOX2, CCAT1 및 FOXP3 발현은 CC 조직 및 세포에서 테스트되었습니다. CC 환자에서 SOX2/CCAT1 발
