SOX2가 CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 경로 조절로 자궁경부암 줄기세포 증식과 자기갱신 제어

초록

장비암호화 RNA(lncRNA)가 자궁경부암(CC)에서의 역할이 제시되었습니다. 본 연구는 성결정 영역 Y-박스 2(SOX2)/lncRNA 결장암 관련 전사체-1(CCAT1)/마이크로RNA-185-3p(miR-185-3p)/포크헤드 박스 단백질 3(FOXP3) 축이 CC 줄기세포의 증식과 자기갱신 능력에 미치는 영향을 논의하는 것을 목표로 합니다. CC 조직과 세포에서 miR-185-3p, SOX2, CCAT1, FOXP3 발현을 측정했습니다. CC 환자에서 SOX2/CCAT1 발현과 임상병리적 특징 간 관계를 검증했습니다. CD44⁺HeLa 세포에서 기능 상실 및 획득 실험을 수행해 생물학적 기능과 자기갱신 능력을 논의했습니다. 마지막으로 SOX2, CCAT1, FOXP3, miR-185-3p 간 관계를 검증했습니다. CC 조직과 세포에서 miR-185-3p 발현은 감소한 반면 SOX2, CCAT1, FOXP3 발현은 증가했습니다. SOX2와 CCAT1 발현은 CC의 종양 크기, 림프절 전이(LNM), 국제산부인과연맹 병기(FIGO 병기)와 연관되었습니다. SOX2 또는 CCAT1 하향 조절과 miR-185-3p 상향 조절이 CD44⁺HeLa 세포의 증식, 침윤, 이동, 구형체 수를 억제하고 세포자멸사를 촉진했습니다. SOX2가 CCAT1에 결합해 miR-185-3p 발현에 영향을 주며, FOXP3가 miR-185-3p의 표적임이 확인되었습니다.

서론

자궁경부암(CC)은 여성 사망 원인 4위로, 2018년 전 세계적으로 약 570,000건 발생과 311,000건 사망이 추정됩니다[1]. 이 복잡한 질환은 유전적 효과와 바이러스 감염 등 다양한 요인이 관여합니다[2]. 인유두종바이러스(HPV) 병행 검사와 HPV 백신 개발로 자궁경부 이형성증과 암의 조기 진단 절차가 발전해 CC의 발생률, 이환율, 사망률이 감소했습니다[3]. 초기 CC 환자에게는 가임력 보존 수술, 원추 생검, 근치적 기관절제술, 골반 림프절 절제술, 골반 방사선 치료, 근접 치료 등이 권장됩니다[4]. 진행성 CC 환자에서는 전이 또는 재발로 예후가 여전히 나쁩니다[5]. 따라서 CC 치료 개선을 위해 새롭고 효과적인 예후 표지자와 치료 전략을 발굴하는 것이 여전히 시급합니다.

성결정 영역 Y-박스 2(SOX2)는 전사 인자 SOX 계열의 중요한 일원으로, 주로 배아 및 성체 줄기세포에서 발현되며 종양 줄기세포에서도 발현됩니다[6]. SOX2가 hedgehog 신호 전달 경로를 통해 CC에서 방사선 저항성을 조절함이 밝혀졌습니다[7]. 또 다른 연구에서는 SOX2가 CC 세포주에서 암 줄기세포 아집단 유지에 필수적임이 입증되었습니다[8]. 장비암호화 RNA(lncRNA)는 200개 뉴클레오티드 길이의 RNA 분자 계열입니다[9]. LncRNA 결장암 관련 전사체-1(CCAT1)은 인간 8q24.21 염색체에 위치하며 결장암에서 유전적 돌연변이를 초래하는 '핫스팟'으로 여겨집니다[10]. 한 연구에서 CCAT1이 CC 세포 증식과 침윤을 가속화함이 보고되었습니다[11]. Jia 등에 따르면 CCAT1이 CC 세포 증식, 이동, 침윤을 현저히 강화합니다[12]. 또한 다른 연구에서 CCAT1이 마이크로RNA-185-3p(miR-185-3p)를 감소시켜 장벽을 파괴함으로써 염증성 장질환의 악성도를 높임이 밝혀졌습니다[13]. miRNA는 mRNA를 감소시키고 번역을 억제해 유전자 발현을 역으로 조절할 수 있습니다[14]. 이전 연구의 체외 실험에서 miR-185-3p가 비인두암 방사선 감수성을 조절함이 밝혀졌습니다[15]. 또 다른 연구에서 miR-185가 난소암 시스플라틴 저항성에 체내외 관여함이 시사되었습니다[16]. 포크헤드 박스 단백질 3(FOXP3)는 FOX 단백질 계열에 속하는 전사 인자로, 처음 조절 T(Treg) 세포에서 발견되어 Treg 세포 유지와 과정에 중요한 역할을 합니다[17]. 한 연구에서 FOXP3가 CC의 림프관신생과 연관됨 보고되었습니다[18]. 또 다른 연구에서 FOXP3 수준이 CC의 FIGO 병기와 종양 크기와 현저히 연관됨 밝혀졌습니다[19]. 본 연구에서는 SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 축이 CC 줄기세포 증식과 자기갱신 능력에 미치는 영향을 조사했습니다.

재료 및 방법

윤리 승인 및 참여 동의

인간 대상 실험은 헬싱키 선언의 원칙을 준수해 수행되었습니다. 본 연구는 지린대학교 제1병원 기관윤리위원회 승인을 받았습니다. 모든 참여자가 서면 동의서에 서명했습니다.

연구 대상

2016년 12월부터 2018년 12월까지 39례의 CC 조직과 대응하는 인접 정상 조직을 CC 환자로부터 수집해 액체 질소에 보존했습니다. 포함 기준: (1) 경부 및 경관 생검 병리, 경부 도말 세포학, 경부 요오드 검사, 질경, 경추 절제술로 CC로 병리 확진. (2) 수술 2주 전 방사선 치료와 화학 요법 미실시. 제외 기준: (1) 방사선 또는 화학 요법 중인 환자, (2) 시료 수집에 동의하지 않은 환자, (3) 면역계 질환 환자.

세포 선정 및 배양

CC 세포주(SiHa, HeLa, CaSki, HCC94, C33A)와 인간 자궁경부 상피 불멸화 세포주 H8을 상하이 바이오리프 바이오테크사(상하이, 중국)에서 구입했습니다. CC 세포 SiHa, HeLa, HCC94는 10% FBS 함유 고당 둘베코 변성 이글 배지(DMEM)에서, CaSki, C33A, H8 세포는 10% FBS 함유 RPMI-1640 배지에서 배양했습니다(37℃, 5% CO₂). 세포를 2일마다 트립신 처리해 계대 배양했습니다.

CC 줄기세포 분리(CD44⁺HeLa 세포)

CC 줄기세포를 CC 세포주 HeLa의 현탁 배양으로 분리했습니다. HeLa 세포를 혈청 무함유 아이스코브 변성 둘베코 배지(IMDM)로 초저부착 페트리 접시에서 21일간 배양하며 배지를 3-5일마다 반정량적으로 교환했습니다. 일부 세포가 구형으로 현탁되어 HeLa 구형 형성 세포(SFCs)를 얻었습니다. 구형 세포의 특성을 확인하고 분석했습니다. 세포를 트립신으로 분리해 1 × 10⁶ cells/mL로 조절했습니다. 세포에 CD44 항체를 첨가하고 유세포 분석으로 분리했습니다. 표면 CD44 양성인 HeLa 세포가 HeLa 종양 줄기세포, 음성인 세포가 HeLa 비줄기세포입니다. CC 줄기세포를 DMEM/F12에 20 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 20 ng/mL 상피 성장 인자(EGF), B27을 첨가해 배양했습니다. 배지에는 1% 페니실린과 스트렙토마이신 포함[20].

세포 처리

CD44⁺HeLa 세포를 sh-SOX2, sh-SOX2 음성 대조(NC), sh-CCAT1, sh-CCAT1 NC, miR-185-3p mimic, mimic NC, sh-CCAT1과 miR-185-3p inhibitor, sh-CCAT1과 inhibitor NC로 형질주입했습니다. 모든 올리고뉴클레오티드 서열은 GenePharma(상하이, 중국)에서 제공받았습니다. 트립신으로 분리한 세포를 6웰 플레이트에 3 × 10⁶ cells/well로 접종했습니다. 60% 융합도에 도달하면 무혈청 배지로 교체해 1시간 배양했습니다. 리포펙타민 2000 형질주입 시약(Invitrogen, 칼스배드, 캘리포니아, USA)으로 형질주입을 수행했습니다.

역전사 정량적 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)

조직과 세포 RNA를 Trizol(Invitrogen)로 추출했습니다. RNA(1 μg)를 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 RTase 키트(Invitrogen)로 cDNA로 역전사했습니다. cDNA를 실시간 PCR 시스템에 첨가했습니다. 프라이머는 상하이 상공 바이오테크놀로지사(상하이, 중국)에서 설계했습니다(표 1). U6을 miR-185-3p의 로딩 컨트롤로, 글리세르알데히드 인산 탈수소효소(GAPDH)를 SOX2, CCAT1, FOXP3의 내부 기준으로 사용했습니다. 결과는 2^−ΔΔCt 법으로 분석했습니다.

웨스턴 블롯 분석

세포와 조직 총 단백질을 추출했습니다. 단백질 농도를 비시니코닌산 키트(에이미젯 사이언티픽, 우한, 후베이, 중국)로 측정했습니다. 단백질을 로딩 버퍼와 혼합해 5분 끓인 후 얼음 목욕과 원심분리했습니다. 10% SDS-PAGE로 처리하고 막으로 전이했습니다. 막을 5% 탈지분유로 1시간 차단하고 1차 항체 SOX2(1:1000, 장쑤 루이시탄사, 장쑤, 중국), FOXP3(1:1000, Abcam Inc., 케임브리지, MA, USA), GAPDH(1:1000, Cell Signaling Technology, 베벌리, MA, USA)로 탐침한 후 과산화효소 표지 2차 항체로 재탐침하고 보존 필름으로 덮어 노출했습니다. Bio-rad Gel Doc EZ 이미저(Bio-rad, 캘리포니아, USA)로 현상했습니다. 단백질 이미지를 ImageJ2x 소프트웨어로 분석했습니다.

세포 계수 키트(CCK)-8 분석

CCK-8 분석을 키트(베요타임, 상하이, 중국)로 수행했습니다. 세포(1 × 10⁴)를 96웰 플레이트에 접종하고 배양했습니다. 0, 24, 48, 72시간 배양 후 웰당 10 μL CCK-8 용액을 첨가하고 1시간 배양했습니다. 450 nm에서 멀티스칸 스펙트럼 전파장 마이크로플레이트 리더로 광학 밀도 값을 측정했습니다. 6개 웰을 취해 평균값을 계산했습니다. 시간을 가로축, 상대 세포 생존율을 세로축으로 해 세포 성장 곡선을 그렸습니다. 광학 밀도 값이 세포 증식을 나타냅니다.

유세포 분석

세포(1 × 10⁶)를 1500 r/min으로 원심분리하고 200 μL 결합 버퍼에 현탁시킨 후 5 μL 요오드화 프로피듐(PI)과 5 μL Annexin V-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 순차 첨가하고 400 μL 버퍼를 첨가했습니다. 유세포 분석기(BD 바이오사이언스, NJ, USA)로 세포자멸사율을 검증했습니다.

스크래치 시험

형질주입된 세포를 분리해 현탁액으로 만들었습니다. 세포 현탁액(1 × 10⁶ cells/mL)을 6웰 플레이트에 접종해 80-90% 융합도까지 배양했습니다. 10 μL 무균 피펫 팁으로 자를 이용해 6웰 플레이트에 가로/세로 스크래치를 균일하게 만들었습니다. 원래 배지를 완전 배지로 교체하고 계속 배양했습니다. 0시간과 72시간에 현미경으로 세포 이동을 관찰하고 동일 위치에서 촬영했습니다.

트랜스웰 분석

형질주입된 세포를 트립신 처리, 1000 g 원심분리, DMEM으로 세척했습니다. 완전 수화된 트랜스웰 챔버를 10% FBS-DMEM(600 mL/well) 함유 24웰 플레이트에 놓았습니다. 세포 현탁액(5 × 10⁵ cells/mL, 200 μL)을 매트리겔 코팅(1:8 매트리겔 80 μL)된 트랜스웰 상부 챔버에, 500 μL 20% FBS-DMEM을 하부 챔버에 첨가했습니다. 24시간 계속 배양 후 500 μL 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하고 0.1% 크리스탈 바이올렛 염색액으로 염색했습니다. 상부 챔버 표면과 가장자리의 세포를 면봉으로 닦아냈습니다. 5개 무작위 시야를 선정해 현미경(니콘 이클립스 TE2000-S, 니콘, 일본)으로 세포를 계수했습니다.

구형 형성 분석

세포를 200 cells/well로 혈청 무함유 현탁 배지 함유 저흡착 6웰 플레이트에 접종했습니다. 2주 후 니콘 이클립스 TE2000-S 현미경(니콘)으로 세포 구형 형성률을 관찰했습니다. 구형 형성률 = 평균 구형 수/접종 세포 수 × 100%로 계산했습니다.

크로마틴 면역침강(ChIP) 분석

ChIP 분석을 ChIP 키트(Upstate, NY, USA)로 수행했습니다. SOX2(1:1000, Re-stem Biotech, 장쑤, 중국)와 정상 토끼 IgG(12-370, Millipore, USA) 항체를 이용해 가교 결합된 단백질-DNA 복합체를 면역침강했습니다. CD44⁺HeLa 세포를 1% PFA로 고정해 DNA-단백질 가교 결합을 생성했습니다. 초음파로 DNA를 200-300 bp 크로마틴 단편으로 절단했습니다. 침강된 크로마틴 DNA를 회수해 RT-qPCR로 분석했습니다.

RNA 풀다운 분석

비오틴 표지 miR-185-3p 야생형(WT)과 돌연변이형(MUT) 플라스미드(50 nM)를 CD44⁺HeLa 세포에 각각 형질주입했습니다. 48시간 형질주입 후 특정 세포 용해액(Ambion, 오스틴, 텍사스, USA)으로 세포를 배양했습니다. 세포 용해액(50 mL)을 분주했습니다. 잔여 용해액을 RNase-free와 효모 tRNA(시그마)로 미리 코팅된 M-280 스트렙타비딘 비드(시그마, 세인트루이스, MO, USA)와 배양했습니다. 이어서 차가운 용해액으로 2회, 저염 버퍼로 3회, 고염 버퍼로 1회 세척했습니다. 길항 miR-185-3p 프로브를 음성 대조로 설정했습니다. Trizol로 총 RNA를 추출하고 RT-qPCR로 CCAT1 수준을 측정했습니다.

이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석

https://jaspar.genereg.net/로 SOX2의 CCAT1 프로모터 영역 잠재 결합 부위 E1과 E2를 예측했습니다. SOX2와 CCAT1 결합 부위 E1을 포함한 CCAT1 프로모터 서열을 합성해 CCAT1 3'UTR WT(E1-WT)와 CCAT1 3'UTR MUT(E1-MUT) 벡터를 구성했습니다. 벡터를 pmirGLO(베요타임)에 클로닝했습니다. 이후 CCAT1-WT/pmirGLO 또는 CCAT1-MUT/pmirGLO를 sh-SOX2 또는 sh-SOX2 NC와 함께 CD44⁺HeLa 세포에 각각 공동 형질주입하고 2일 후 용해했습니다. 루시퍼라제 검출 시스템(타카라, 다롄, 중국)으로 루시퍼라제 활성을 측정했습니다.

생물정보학 웹사이트로 CCAT1과 miR-185-3p 결합 부위를 예측하고 분석했습니다. CCAT1과 miR-185-3p 결합 부위를 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석으로 검증했습니다. miR-185-3p 결합 부위를 포함한 CCAT1 3'UTR을 구성했습니다. CCAT1 3'UTR WT와 CCAT1 3'UTR MUT를 구성해 mimic NC와 miR-185-3p mimics와 함께 CD44⁺HeLa 세포에 2일간 공동 형질주입했습니다. 이후 세포를 용해시키고 루시퍼라제 검출 시스템(타카라)으로 루시퍼라제 활성을 측정했습니다. 동일한 방법으로 miR-185-3p와 FOXP3 간 표적 관계도 검증했습니다.

통계 분석

모든 데이터는 SPSS 21.0 소프트웨어(IBM Corp., 아몬크, NY, USA)로 평가했습니다. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시했습니다. 두 그룹 간 차이는 t-test, 그룹 간 차이는 일원 분산 분석(ANOVA) 후 Tukey 사후 검정으로 분석했습니다. 분류 변수는 Fisher's exact test로 평가했습니다. p 값 < 0.05를 유의함으로 간주했습니다.

결과

CC 조직에서 miR-185-3p 발현 감소, SOX2/CCAT1/FOXP3 발현 증가, SOX2와 CCAT1 발현이 종양 크기, LNM, FIGO 병기와 연관

SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 축이 CC 줄기세포 증식과 자기갱신 능력에 미치는 역할을 조사할 때, CC 조직과 인접 정상 조직에서 miR-185-3p, SOX2, CCAT1, FOXP3 발현을 RT-qPCR과 웨스턴 블롯으로 측정했습니다. 그 결과(그림 1a-c) CC 조직에서 miR-185-3p 발현이 감소하고 SOX2, CCAT1, FOXP3 발현이 증가했습니다.

CC 조직에서 miR-185-3p 발현 감소, SOX2, CCAT1, FOXP3 발현 증가. a CC와 인접 정상 조직에서 SOX2 mRNA, CCAT1, miR-185-3p, FOXP3 mRNA 발현 비교. b CC와 인접 정상 조직에서 SOX2와 FOXP3 단백질 발현 밴드. c CC와 인접 정상 조직에서 SOX2와 FOXP3 단백질 발현 비교. *p < 0.05 vs. 인접 정상 조직. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시, 두 그룹 간 비교에 t-test 수행

SOX2/CCAT1 발현과 CC 임상병리적 특징 간 관계를 분석했습니다(표 2). CC에서 과발현된 SOX2와 CCAT1이 종양 크기, LNM, FIGO 병기와 연관되어, 더 큰 종양 크기, LNM, 진행된 FIGO 병기 환자에서 SOX2와 CCAT1 발현이 더 높음을 나타냈습니다.

CD44⁺HeLa 세포에서 miR-185-3p 발현 감소, SOX2/CCAT1/FOXP3 발현 증가

이어서 인간 자궁경부 상피 불멸화 세포 H8과 CC 세포주 SiHa, CasKi, HeLa, HCC94, C33A에서 miR-185-3p, SOX2, CCAT1, FOXP3 발현을 측정했습니다. CC 세포주에서 miR-185-3p 발현이 저하되고 SOX2, CCAT1, FOXP3가 상향 조절됨을 확인했습니다(그림 2a-c). 그중 HeLa 세포에서 SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 발현 차이가 H8 세포 대비 가장 컸으므로 HeLa 세포를 선정해 분리했습니다. 세포 현탁 배양으로 HeLa-SFCs를 얻고 유세포 분석으로 분리 전후 세포 표면 CD44 발현을 확인했습니다. 결과에서 HeLa-SFCs의 CD44 양성률이 분리 전보다 현저히 높아 CC 줄기세포 분리가 성공적임을 시사했습니다(그림 2d). 분리된 줄기세포를 CD44⁺HeLa 세포로 명명했습니다. 이어서 HeLa와 CD44⁺HeLa 세포에서 miR-185-3p, SOX2, CCAT1, FOXP3 발현을 측정했습니다(그림 2e-g). CD44⁺HeLa 세포에서 SOX2, CCAT1, FOXP3 발현이 상향 조절되고 miR-185-3p가 하향 조절됨을 확인했습니다.

CD44⁺HeLa 세포에서 miR-185-3p 발현 감소, SOX2, CCAT1, FOXP3 발현 증가. a H8과 CC 세포주에서 SOX2 mRNA, CCAT1, miR-185-3p, FOXP3 mRNA 발현 비교. b H8과 CC 세포주에서 SOX2와 FOXP3 단백질 발현 밴드. c H8과 CC 세포주에서 SOX2와 FOXP3 단백질 발현 비교. d 유세포 분석으로 HeLa 세포 분리 전후 CD44 발현율 검출. e HeLa 세포와 CD44⁺HeLa 세포에서 SOX2 mRNA, CCAT1, miR-185-3p 발현 비교. f HeLa 세포와 CD44⁺HeLa 세포에서 SOX2 단백질 발현 밴드. g HeLa 세포와 CD44⁺HeLa 세포에서 SOX2 단백질 발현 비교. ^p < 0.05 vs. H8 세포. ^&p < 0.05 vs. HeLa 세포. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시, 두 그룹 간 비교에 t-test, 다중 그룹 비교에 일원 ANOVA 후 Tukey 사후 검정 수행

SOX2 하향 조절과 CCAT1 하향 조절이 CD44⁺HeLa 세포 증식, 이동, 침윤, 구형 형성률 감소 및 세포자멸사 증가

이후 CC 줄기세포 증식과 자기갱신에 미치는 영향을 탐구하기 위해 CD44⁺HeLa 세포에서 SOX2와 CCAT1을 침묵시켰습니다. CCK-8 분석, 유세포 분석, 스크래치 시험, 트랜스웰 분석, 구형 형성 실험으로 검출한 결과, SOX2와 CCAT1 억제가 CD44⁺HeLa 세포의 증식, 이동, 침윤, 구형 형성률을 억제하고 세포자멸사를 촉진했습니다(그림 3a-i). 이는 SOX2 또는 CCAT1 침묵이 CC 줄기세포 증식과 자기갱신을 억제함을 나타냅니다.

SOX2 하향 조절과 CCAT1 하향 조절이 CD44⁺HeLa 세포 증식, 이동, 침윤, 구형 형성률 감소 및 세포자멸사 증가. a sh-CCAT1 또는 sh-SOX2 처리 세포에서 CCK-8 분석으로 측정한 세포 성장 곡선. b sh-CCAT1 또는 sh-SOX2 처리 세포에서 유세포 분석으로 검출한 세포자멸사. c sh-CCAT1 또는 sh-SOX2 처리 세포에서 세포자멸사율 비교. d sh-CCAT1 또는 sh-SOX2 처리 세포에서 스크래치 시험으로 측정한 세포 이동. e sh-CCAT1 또는 sh-SOX2 처리 세포에서 세포 이동 비교. f sh-CCAT1 또는 sh-SOX2 처리 세포에서 트랜스웰 분석으로 측정한 침윤 능력. g sh-CCAT1 또는 sh-SOX2 처리 세포에서 침윤 능력 비교. h sh-CCAT1 또는 sh-SOX2 처리 세포에서 구형 형성 실험으로 측정한 자기갱신 능력. i sh-CCAT1 또는 sh-SOX2 처리 세포에서 구형 형성률 비교. a p < 0.05 vs. sh-SOX2 NC 그룹. b p < 0.05 vs. sh-CCAT1 NC 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시, 다중 그룹 비교에 일원 ANOVA 후 Tukey 사후 검정 수행

miR-185-3p 고갈이 CD44⁺HeLa 세포에서 CCAT1 하향 조절 역할 역전

이어서 miR-185-3p가 CCAT1의 CC 줄기세포 증식과 자기갱신 조절 과정에 관여하는지 조사했습니다. CD44⁺HeLa를 miR-185-3p mimic으로 형질주입하거나 sh-CCAT1과 miR-185-3p inhibitor로 공동 형질주입했습니다. 결과에서 miR-185-3p 상향 조절이 CD44⁺HeLa 세포의 증식, 이동, 침윤, 구형 형성률을 현저히 감소시키고 세포자멸사율을 증가시켰습니다. miR-185-3p inhibitor 처리 세포가 CCAT1 하향 조절의 CD44⁺HeLa 세포 증식, 이동, 침윤, 세포자멸사, 구형 형성에 대한 역할을 역전시켰습니다(그림 4a-i).

miR-185-3p 과발현이 CD44⁺HeLa 세포 증식, 이동, 침윤, 구형 형성률 억제 및 세포자멸사 증가. a miR-185-3p mimic 처리 세포에서 CCK-8 분석으로 측정한 세포 성장 곡선. b miR-185-3p mimic 처리 세포에서 유세포 분석으로 검출한 세포자멸사. c miR-185-3p mimic 처리 세포에서 세포자멸사율 비교. d miR-185-3p mimic 처리 세포에서 스크래치 시험으로 측정한 세포 이동. e miR-185-3p mimic 처리 세포에서 세포 이동 비교. f miR-185-3p mimic 처리 세포에서 트랜스웰 분석으로 측정한 침윤 능력. g miR-185-3p mimic 처리 세포에서 침윤 능력 비교. h miR-185-3p mimic 처리 세포에서 구형 형성 실험으로 측정한 자기갱신 능력. i miR-185-3p mimic 처리 세포에서 구형 형성률 비교. a p < 0.05 vs. sh-SOX2 NC 그룹. b p < 0.05 vs. sh-CCAT1 NC 그룹. c p < 0.05 vs. mimic NC 그룹. d p < 0.05 vs. sh-CCAT1 + inhibitor NC 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시, 다중 그룹 비교에 일원 ANOVA 후 Tukey 사후 검정 수행

낮은 SOX2와 낮은 CCAT1 발현이 CD44⁺HeLa 세포에서 FOXP3 발현 감소와 miR-185-3p 발현 증가

이후 sh-SOX2, sh-CCAT1, miR-185-3p mimic 형질주입 및 sh-CCAT1과 miR-185-3p inhibitor 공동 형질주입 후 CD44⁺HeLa 세포에서 SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 발현을 조사했습니다. sh-SOX2 처리 세포에서 SOX2, CCAT1, FOXP3 발현 감소, miR-185-3p 발현 증가. sh-CCAT1 처리 세포에서 CCAT1, FOXP3 발현 감소, miR-185-3p 발현 증가. miR-185-3p mimic 도입 세포에서 miR-185-3p 발현 증가, FOXP3 발현 감소. sh-CCAT1과 miR-185-3p inhibitor 순차 형질주입 세포에서 FOXP3 발현 증가, miR-185-3p 발현 감소(그림 5a-d).

낮은 SOX2와 낮은 CCAT1 발현이 CD44⁺HeLa 세포에서 FOXP3 발현 감소와 miR-185-3p 발현 증가. a sh-SOX2 NC와 sh-SOX2 그룹에서 SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 발현. b sh-CCAT1 NC와 sh-CCAT1 그룹에서 SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 발현. c mimic NC와 miR-185-3p mimic 그룹에서 SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 발현. d sh-CCAT1 + inhibitor NC와 sh-CCAT1 + miR-185-3p inhibitor 그룹에서 SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 발현. a p < 0.05 vs. sh-SOX2 NC 그룹. b p < 0.05 vs. sh-CCAT1 NC 그룹. c p < 0.05 vs. mimic NC 그룹. d p < 0.05 vs. sh-CCAT1 + inhibitor NC 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시, 다중 그룹 비교에 일원 ANOVA 후 Tukey 사후 검정 수행

SOX2가 CCAT1에 결합해 miR-185-3p 발현 영향, FOXP3가 miR-185-3p 표적 유전자

https://jaspar.genereg.net/ 웹사이트로 CCAT1 프로모터 영역 전사 인자 잠재 결합 부위를 예측 분석한 결과 SOX2와 CCAT1이 CCAT1 프로모터 영역에 잠재 결합 부위를 가짐을 보였습니다(그림 6a). ChIP-qPCR 결과(그림 6b): IgG 그룹 대비 SOX2 그룹에서 E1 결합 부위에서 더 많은 CCAT1 프로모터 단편이 농축되어, SOX2가 CCAT1 프로모터 E1 부위에 결합하며 CCAT1 조절에 관여함이 입증되었습니다. 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석 결과(그림 6c): sh-SOX2와 E1-WT 공동 형질주입 세포에서 루시퍼라제 활성이 억제되어 SOX2가 CCAT1에 결합할 수 있음을 나타냈습니다.

SOX2가 CCAT1에 결합해 miR-185-3p 발현 영향, FOXP3가 miR-185-3p 표적 유전자. a 생물정보학 사이트로 SOX2와 CCAT1 프로모터 영역 결합 부위 예측. b ChIP-qPCR 실험으로 SOX2와 CCAT1 결합 관계 검증. c 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석으로 SOX2와 CCAT1 결합 부위 검증. d 생물정보학 사이트로 CCAT1과 miR-185-3p 결합 부위 예측. e 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석으로 CCAT1과 miR-185-3p 결합 검증. f RNA 풀다운 분석으로 세포에서 CCAT1과 miR-185-3p 결합 관계 검증. g 생물정보학 웹사이트로 miR-185-3p와 FOXP3 표적 관계 예측. h 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석으로 miR-185-3p와 FOXP3 표적 관계 확인. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시, 두 그룹 간 비교에 t-test 수행

제퍼슨 웹사이트에서 CCAT1이 miR-185-3p와 결합할 것으로 예측했습니다(그림 6d). 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석 결과(그림 6e): miR-185-3p mimic과 CCAT1-WT 도입 세포에서 루시퍼라제 활성이 감소해 miR-185-3p가 CCAT1에 결합할 수 있음을 시사했습니다. RNA 풀다운 분석으로 CCAT1이 miR-185-3p와 결합하는지 검증했습니다. 결과(그림 6f): Bio-miR-185-3p-WT 처리 세포에서 CCAT1 농축 수준이 현저히 증가한 반면, Bio-miR-185-3p-MUT 처리 세포에서는 유의미한 차이가 없었습니다. 이 결과는 CCAT1이 miR-185-3p를 흡착해 miR-185-3p 발현에 영향을 줄 수 있음을 보여줍니다.

제퍼슨 웹사이트로 miR-185-3p와 FOXP3 간 표적 관계를 예측했습니다(그림 6g). 이중 루시퍼라제 리포터 유전자 분석으로 검증한 결과(그림 6h): FOXP3-WT와 miR-185-3p mimic을 CD44⁺HeLa 세포에 공동 형질주입 후 세포 상대 루시퍼라제 활성이 현저히 감소한 반면, FOXP3-MUT와 miR-185-3p mimic 공동 형질주입은 세포 상대 루시퍼라제 활성에 영향을 주지 않았습니다. 이는 miR-185-3p가 FOXP3를 표적화함을 시사합니다.

논의

CC는 전 세계 여성에서 유방암, 대장암, 폐암에 이어 4번째로 흔한 악성 종양입니다[3]. SOX2 양성 발현 CC 세포가 암 줄기세포 특성을 보임이 보고되었습니다[21]. 한 연구에서 CCAT1이 CC 관련 필수 온코제닉 lncRNA로 CC 세포 성장과 침윤에 촉진 역할을 함이 보고되었습니다[11]. 또 다른 연구에서 miR-185-3p가 비인두암 방사선 감수성 예측과 암세포 성장 및 세포자멸사 조절 가능함이 밝혀졌습니다[22]. FOXP3에 대한 순환 자가항체가 자궁경부 병변 진행을 반영해 CC 조기 예후 잠재적 바이오마커가 될 수 있음이 입증되었습니다[23]. 본 연구는 SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 축이 CC 줄기세포 증식과 자기갱신 능력에 미치는 영향을 탐구하기 위해 설계되었습니다.

본 연구 결과에 따르면 SOX2와 CCAT1 발현이 CC 조직과 세포에서 증가했으며 종양 크기, LNM, 진행된 FIGO 병기와 연관되었습니다. 기능적으로 입증된 바에 따르면 SOX2와 CCAT1 하향 조절이 CC 줄기세포 증식, 이동, 침윤, 구형 세포 수를 감소시키고 세포자멸사를 증가시켰습니다. 본 연구와 유사하게 SOX2 발현이 CC에서 증가 경향을 보입니다[24, 25]. 또한 암 줄기세포 유래 CC 세포에서 SOX2 발현이 상향 조절됩니다[26]. 과발현된 SOX2가 여러 암 유형의 환자 임상병리적 특성과 연관됨이 제안되었습니다, CC에 국한되지 않습니다. 예를 들어 FIGO I-II기 자궁경부 편평상피암 환자에서 상향 조절된 SOX2가 나타남이 제안되었습니다[27]. 또한 SOX2 발현이 구강 편평상피암에서 LNM과 연관됨[28]. CC 진행에서 SOX2 분자 기능과 관련해, 하향 조절된 SOX-2가 자궁경부 편평상피암 세포 이동과 침윤을 억제함이 관찰되었습니다[29]. 한편 다른 연구에서는 상향 조절된 SOX2가 대조 세포 대비 CC 세포 클로노제닉성, 증식, 종양 형성능을 체내외에서 강화함이 입증되었습니다[30].

SOX2와 CCAT1 간 조절 관계에 대해, 기존 연구에서 SOX2 침묵이 CCAT1 mRNA 수준을 현저히 감소시킴이 제시되었습니다[31]. 암에서 CCAT1 역할에 대해, 한 연구에서 CCAT1 발현이 인접 정상 조직 대비 CC 조직에서 현저히 높음 보고되었습니다[11, 12]. 주목할 점은 CC에서 CCAT1 과발현이 종양 크기와 양의 상관관계가 있음[12]. 암 세포 활성에서 CCAT1 역할에 대해, CCAT1 과발현이 CC 세포 증식, 집락 형성, 침윤을 가속화함 강조한 연구 존재[11]. 흥미롭게도 선행 연구에서 CCAT1 녹다운으로 세포 생존율, 침윤, 이동 능력이 감소함 입증[12]. 어쨌든 SOX2와 CCAT1 기능 효과가 다른 암에서도 CC와 유사했습니다.

이후 본 연구에서 CCAT1이 miR-185-3p와 결합할 수 있음을 밝혔으며, CCAT1 하향 조절과 miR-185-3p 과발현이 CC 줄기세포 증식과 자기갱신 능력을 억제했습니다. CCAT1과 miR-185-3p가 음의 상관관계 있음 보고됨[13]. 또한 방사선 저항성 비인두암 증례에서 miR-185-3p 발현 감소가 관찰됨 보고[22]. 암 세포 공격성에서 miR-185-3p 억제 기능에 대해, miR-185-3p 상향 조절이 비인두암 세포 침윤 및 전이 특성 억제함 보고[32]. 또한 Zou 등이 miR-185 복원이 유방암 세포 성장과 침윤 억제함 제안[33]. miR-185 상향 조절이 비소세포폐암 세포 증식, 침윤, 집락 형성 능력 감소시킴 발견[34]. 비소세포폐암 세포에서 miR-185 과발현으로 체외 세포 증식, 침윤, 이동 및 체내 종양 성장 억제됨 제시[35]. 이들 연구에서 본 연구의 miR-185-3p 항종양 역할이 선행 연구와 일관됨.

나아가 miR-185-3p가 FOXP3를 표적화해 CC 줄기세포 활성 조절하는 CC 과발현 유전자임을 규명했습니다. 실제로 FOXP3는 대장암에서 SOX2 암 줄기세포 유사 표지자의 조절자[36]로 CC에서 조사되어 CC 세포에서 상향 조절됨 보임[19][37]. FOXP3 상향 조절이 비소세포폐암 세포에서 종양 구형 형성 촉진 및 줄기성 자극함 입증[38].

결론

종합하면, 본 연구는 SOX2 전사가 CCAT1을 활성화해 miR-185-3p를 억제하고 FOXP3를 조절함으로써 CC 줄기세포 증식과 자기갱신을 촉진함을 최초로 탐구했습니다. 이는 CC 치료의 잠재적 접근법이 될 수 있습니다. 다만 본 연구에는 설계된 실험에서 상대적으로 작은 시험 규모라는 한계가 여전히 존재합니다. 따라서 임상 연구가 추가로 수행되어 CC 치료 효능을 검증해야 할 것입니다.